劉洪超，于雅萌，郭東曉，林永強(qiáng)

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

補(bǔ)益強(qiáng)心片為人參、丹參、黃芪、麥冬、香加皮、葶藶子等6味中藥制備而成的復(fù)方制劑，具益氣活血的功效，臨床用于慢性充血性心力衰竭療效顯著[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載內(nèi)容包括性狀、人參(人參皂苷Rg1、Re、Rb1)、黃芪(黃芪甲苷)、香加皮(4-甲氧基水楊醛)的薄層色譜(TLC)鑒別及丹參中丹參酮ⅡA的高效液相色譜(HPLC)法含量測定。本試驗(yàn)優(yōu)化了黃芪和香加皮TLC鑒別的前處理及展開系統(tǒng)，補(bǔ)充了丹參中丹酚酸B的TLC鑒別，增加了HPLC法測定了方中補(bǔ)益元?dú)庵魉幦藚⒅械?種皂苷成分，為該制劑的質(zhì)量控制提供更為全面準(zhǔn)確的方法。

1 材料

1.1 儀器 美國安捷倫1200型高效液相色譜儀；瑞士梅特勒-托利多XSE205型電子天平；昆山市超聲KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(500 W，40 kHz)；瑞士卡瑪TLC Visualizer 2薄層成像系統(tǒng)。

1.2 試藥 乙腈為色譜純，純化水由密理博 Synergy UV凈水系統(tǒng)制備，其他試劑及試藥為分析純；市售硅膠G薄層預(yù)制板(青島海洋化工廠、德國默克公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品 黃芪甲苷(批號(hào):110781-200613)，丹酚酸B(批號(hào):111562-201313)，4-甲氧基水楊醛(批號(hào):110790-201303)，人參皂苷Rg1(批號(hào):110703-201530)，人參皂苷Rb1(批號(hào):110704-201625)，人參皂苷Re(批號(hào):110754-201525)，丹參對(duì)照藥材(批號(hào):120923-201113)，以上均購于中國食品藥品檢驗(yàn)研究院。補(bǔ)益強(qiáng)心片4批次(青島華仁太醫(yī)藥業(yè)有限公司，批號(hào):150601、150701、150801、170102)，陰性樣品均為按處方同比例除去相應(yīng)藥味后制備。

2 方法及結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪TLC鑒別[2-3]取供試品10片，去除包衣，研細(xì)，加甲醇60 mL，回流提取2 h，濾過，甲醇蒸干，殘?jiān)舆m量水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(20、10、10 mL)，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗至水層無色，分離正丁醇層蒸干，殘?jiān)眉s2 mL甲醇溶解，上樣于中性氧化鋁柱(100至200目，5 g，內(nèi)徑為10～15 mm)上，用100 mL 40%甲醇洗脫，洗脫液濃縮至干，加甲醇1mL溶解，作為供試品溶液。同時(shí)取與供試品量相當(dāng)?shù)牟缓S芪陰性樣品，按以上供試品制法制成缺黃芪陰性對(duì)照溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品以甲醇溶解，制成1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置后分取的下層展開，取出晾干后噴以10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃烘至顯色清晰。供試品與對(duì)照品在相應(yīng)位置上，顯示顏色一致的斑點(diǎn)；在紫外光(365 nm)下檢視，斑點(diǎn)顯橘黃色熒光。陰性樣品在與黃芪甲苷相應(yīng)色譜位置無斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)干擾，表明該方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

1.黃芪甲苷對(duì)照品；2～4.供試品；5.缺黃芪陰性對(duì)照 a.日光下；b.紫外光(365 nm)下圖1 黃芪薄層鑒別色譜圖

2.1.2 香加皮TLC鑒別[2,4]取供試品10片，去除包衣，研細(xì)，加甲醇30 mL，回流提取1 h，放冷，濾過蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。同時(shí)取與供試品量相當(dāng)?shù)牟缓慵悠り幮詷悠罚匆陨瞎┰嚻分品ㄖ瞥扇毕慵悠り幮詫?duì)照溶液。另取香加皮對(duì)照藥材1 g，同供試品制法處理，制成對(duì)照藥材溶液。再取4-甲氧基水楊醛對(duì)照品以甲醇溶解，制成1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上，用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(20∶3∶0.5)展開，取出晾干后噴以二硝基苯肼試液。供試品在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置，顯相同顏色的多個(gè)斑點(diǎn)；在與對(duì)照品相應(yīng)位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品在香加皮對(duì)照藥材和4-甲氧基水楊醛對(duì)照品相應(yīng)位置上無斑點(diǎn)干擾，表明該法專屬性良好，結(jié)果見圖2。

2.1.3 丹參TLC鑒別[2,5-6]取供試品10片，去除包衣，研細(xì)，加甲醇50 mL，回流提取30 min，放冷，濾過蒸干，殘?jiān)铀s40 mL溶解，用石油醚(60～90 ℃)40 mL振搖提取，分取水層，稀鹽酸調(diào)pH值2～3，加乙醚振搖提取2次，每次30 mL，合并乙醚液，揮去溶劑，加甲醇1 mL溶解，制成供試品溶液。同時(shí)取與供試品量相當(dāng)?shù)牟缓㈥幮詷悠罚匆陨瞎┰嚻分品ㄖ瞥扇钡㈥幮詫?duì)照溶液。另取丹參對(duì)照藥材0.5 g，用20 mL甲醇超聲處理20 min，濾過濃縮至1 mL后制成對(duì)照藥材溶液。再取丹酚酸B對(duì)照品以甲醇溶解，制成0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上，用甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)展開，取出晾干后噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置，顯相同顏色的數(shù)個(gè)斑點(diǎn)；在與對(duì)照品相應(yīng)位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品在與丹參對(duì)照藥材和丹酚酸B對(duì)照品相應(yīng)位置上無斑點(diǎn)干擾，表明該法專屬性良好，結(jié)果見圖3。

1.丹參對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.丹酚酸B對(duì)照品；6.缺丹參陰性對(duì)照?qǐng)D3 丹參薄層鑒別色譜圖

2.2 含量測定[7-10]

2.2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～35 min，19%A；35～55 min，19%→29%A；55～70 min，29%A；70～100 min，29%→40%A)；流速1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，203 nm處檢測；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2.2 對(duì)照品配制 取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb13種對(duì)照品適量，以甲醇溶解，制成含人參皂苷Rg10.187 4 mg·mL-1、人參皂苷Re 0.189 4 mg·mL-1、人參皂苷Rb10.197 2 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液；另取適量以上對(duì)照品，以甲醇溶解，制成含人參皂苷Rg11.006 9 mg·mL-1、人參皂苷Re 0.935 9 mg·mL-1、人參皂苷Rb10.971 8 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用于線性關(guān)系的測定。

2.2.3 供試品制備 取供試品20片，去除包衣，研細(xì)，取約2 g于濾紙筒內(nèi)，精密稱定，置索氏提取器中，加適量三氯甲烷回流至提取液無顏色，棄去提取液，殘?jiān)鼡]干溶劑，連同濾紙筒移入燒瓶中，精密加70%乙醇50 mL，稱定重量，回流提取1 h，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密移取25 mL續(xù)濾液至蒸發(fā)皿中，蒸去溶劑，用30 mL水分次溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，水飽和正丁醇振搖提取4次(30 mL×2、20 mL×2)，正丁醇提取液合并，以氨試液30 mL洗滌2次，棄去氨試液，回收正丁醇至干，殘?jiān)约状既芙廪D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，濾過即得。

2.2.4 陰性對(duì)照制備 取相當(dāng)于供試品量約2 g的不含人參陰性樣品，按以上供試品制法制成缺人參陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性 取以上對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣并記錄相關(guān)色譜信息。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰計(jì)均不低于6 000；目標(biāo)峰基線分離良好，與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。

2.2.6 線性關(guān)系 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1、2、5 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取以上4份稀釋溶液及“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、對(duì)照品儲(chǔ)備液各進(jìn)樣10 μL，測定并記錄3個(gè)目標(biāo)峰的峰面積。每個(gè)對(duì)照品均以進(jìn)樣量對(duì)應(yīng)橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)應(yīng)縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到如下結(jié)果：人參皂苷Rg1回歸方程Y=341.52X+5.214 4，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0；人參皂苷Re回歸方程Y=323.66X-13.611，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；人參皂苷Rb1回歸方程Y=239.7X+14.789，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種人參皂苷對(duì)照品進(jìn)樣量分別在0.187 4～10.06 9 μg(人參皂苷Rg1)、0.1894～9.359 μg(人參皂苷Re)、0.197 2～9.718 μg(人參皂苷Rb1)范圍內(nèi)與所測得的峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測其峰面積積分值。結(jié)果3種目標(biāo)成分的峰面積RSD分別為0.45%(人參皂苷Rg1)、0.31%(人參皂苷Re)、0.38%(人參皂苷Rb1)，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下的供試品，在制備后的0、2、4、8、12、24 h時(shí)間點(diǎn)各進(jìn)樣10 μL，對(duì)3種目標(biāo)成分的峰面積進(jìn)行測定。結(jié)果3種目標(biāo)成分的峰面積RSD分別為1.04%(人參皂苷Rg1)、0.44%(人參皂苷Re)、0.64%(人參皂苷Rb1)，表明供試品中所測成分在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.2.9 重復(fù)性考察 取批號(hào)為170102的樣品，照“2.2.3”項(xiàng)下所述方法處理，平行制備6份，所得供試品溶液依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算含量。結(jié)果人參皂苷Rg1的平均含量為0.571 6 mg·g-1(RSD為 0.45%，n=6)、人參皂苷Re的平均含量為0.777 4 mg·g-1(RSD為0.86%，n=6)、人參皂苷Rb1的平均含量為1.433 7 mg·g-1(RSD為0.46%，n=6)，表明擬定的檢測方法重復(fù)性良好。

2.2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已在重復(fù)性試驗(yàn)中測定含量的170102批次樣品1.0 g，按“2.2.3”項(xiàng)下供試品制備方法操作至“連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中”，精密加入對(duì)照品溶液(濃度為：人參皂苷Rg10.052 42 mg·mL-1、人參皂苷Re 0.067 45 mg·mL-1、人參皂苷Rb10.127 68 mg·mL-1，70%乙醇配制)10 mL和70%乙醇40 mL，繼按“2.2.3”項(xiàng)下所述供試品溶液制備方法處理至制備結(jié)束，平行制備6份。計(jì)算每份樣品中3種目標(biāo)成分回收率，結(jié)果見表1。

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.11 專屬性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液及“2.2.4”項(xiàng)下缺人參陰性對(duì)照溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄相關(guān)色譜信息。供試品色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品色譜相應(yīng)的3個(gè)目標(biāo)峰，陰性樣品色譜中無相應(yīng)色譜峰，證明處方中其他藥味對(duì)測定人參中的目標(biāo)成分無干擾(見圖4)。

a.混合對(duì)照品溶液；b.供試品溶液；c.陰性對(duì)照溶液 1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1圖4 人參含量測定HPLC色譜圖

2.2.12 樣品測定 取4批樣品各2份，按照“2.2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量總和，結(jié)果見表2。

表2 供試品含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 薄層鑒別 黃芪甲苷鑒別原標(biāo)準(zhǔn)中提取較為煩瑣，上大孔樹脂柱后需反復(fù)沖洗，后續(xù)還需進(jìn)行索氏提取，改為萃取后蒸干過中性氧化鋁柱進(jìn)行除雜純化，更為便捷省時(shí)，且分離較好無干擾。優(yōu)化了香加皮薄層鑒別項(xiàng)的展開劑及顯色劑，并增加了香加皮藥材作為對(duì)照，可在TLC圖譜中體現(xiàn)更多對(duì)應(yīng)的色譜信息。增加了丹參對(duì)照藥材和丹酚酸B的薄層鑒別，可對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中丹參的質(zhì)量控制(丹參酮ⅡA的含量測定)予以補(bǔ)充。以上各鑒別均進(jìn)行了陰性實(shí)驗(yàn)及耐用性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均滿足TLC方法的相關(guān)要求。

3.2 補(bǔ)益強(qiáng)心片原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包含丹參中丹參酮ⅡA的HPLC法含量測定，屬于丹參中脂溶性有效成分，輔以新增的丹參對(duì)照藥材及水溶性成分丹酚酸B的TLC鑒別，可以有效控制藥品中丹參的質(zhì)量。

3.3 提取方法的優(yōu)化 新增人參中3種人參皂苷的含量測定，并對(duì)提取條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化。以70%乙醇作為提取溶劑同等條件下效率明顯高于甲醇，加熱回流效率略高于超聲；3種目標(biāo)成分均為中性人參皂苷，水飽和正丁醇4次萃取基本實(shí)現(xiàn)全部轉(zhuǎn)移；除雜方法考察了濃氨試液和氨試液，二者較NaOH溶液可實(shí)現(xiàn)洗滌后直接蒸干，減少水洗去除目標(biāo)部位殘留不揮發(fā)堿的步驟，其2次萃取后均能基本去除干擾，考慮到操作時(shí)的強(qiáng)刺激性，確定使用氨試液作為洗滌溶劑。另對(duì)取樣量、提取時(shí)間、萃取次數(shù)等條件進(jìn)行了考察，最終確定了“2.2.3”項(xiàng)下的樣品提取方法。

3.4 色譜條件的優(yōu)化 3種待測人參皂苷最大吸收波長均在(203±2)nm，該區(qū)域靠近紫外末端吸收區(qū)，干擾較大，故流動(dòng)相的優(yōu)選較為必要。在嘗試數(shù)種更為快速的色譜條件未果后，最終確定參照藥典中人參藥材項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，運(yùn)行時(shí)間稍長但可將目標(biāo)成分有效分離，滿足試驗(yàn)需要。另對(duì)多根不同品牌及填料色譜柱(Thermo BDS Hypersil；Waters Symmertry；Kromasil 100-5，規(guī)格均為C18，4.6 mm×250 mm,5 μm)進(jìn)行了考察，耐用性均滿足試驗(yàn)需要。

本研究采用更為便捷、專屬且重現(xiàn)性好的方法可以對(duì)補(bǔ)益強(qiáng)心片中相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行有效檢測，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。