梅道啟 梅世月, 王瀟娜. 王 媛 陳國(guó)洪 楊志曉 陳曉軼 張耀東. 楊秀安

1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院）東區(qū)神經(jīng)內(nèi)科（河南鄭州 450018）；2.河南省遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省兒童神經(jīng)發(fā)育工程研究中心（河南鄭州 450018）；3.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室（河南承德 067000）

國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟（international league against epilepsy，ILAE）將癲癇性腦病（epileptic encephalopathy）定義為由頻繁癲癇發(fā)作和/或癲癇樣放電造成的慢性進(jìn)行性神經(jīng)精神發(fā)育遲滯或倒退、智力低下及語(yǔ)言障礙的一種癲癇綜合征，同時(shí)有發(fā)作期與發(fā)作間期腦電圖持續(xù)癇性放電。早發(fā)性癲癇性腦病（early onset epileptic encephalopathy，EOEE）是指新生兒期或嬰兒早期出現(xiàn)的頻繁癲癇發(fā)作，具有早發(fā)性、多種發(fā)作類型和藥物難治性特點(diǎn)，發(fā)作間期腦電圖呈持續(xù)癇性放電，導(dǎo)致患兒腦功能發(fā)育全面遲滯或倒退[1]。EOEE的遺傳學(xué)病因通常分為兩大類：離子通道相關(guān)基因變異和非離子通道相關(guān)基因變異。隨著二代測(cè)序技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，目前已報(bào)道了977個(gè)與癲癇相關(guān)的基因，多數(shù)癲癇易感基因?yàn)殡x子通道相關(guān)基因。甲基-D-天冬氨酸離子能谷氨酸受體亞基2B（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B，GRIN2B）基因位于染色體12 p 13 區(qū)域，編碼N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體2 B 蛋白，在大腦皮質(zhì)、海馬和邊緣前腦顯著表達(dá)[2]，與EOEE 27型相關(guān)（OMIM：616139），故其變異所致疾病又稱發(fā)育性癲癇性腦病27型，后者多為常染色體顯性遺傳，以新生錯(cuò)義變異為主，患病率尚不清楚。迄今為止，國(guó)外至少報(bào)道了100例GRIN2B基因相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙病例，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)癲癇病例報(bào)道。本文分析1例發(fā)生GRN2B基因新生錯(cuò)義變異的EOEE患兒的臨床資料，總結(jié)其臨床表型、腦電圖及影像學(xué)、基因及分子遺傳學(xué)特征，以提高臨床醫(yī)師對(duì)該病的認(rèn)識(shí)。

1 臨床資料

患兒為12 月齡女童，漢族，因間斷性抽搐42天就診于鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院東區(qū)神經(jīng)內(nèi)科。G2P2，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.7 kg，Apgar評(píng)分10 分，出生前無(wú)宮內(nèi)缺氧及胎兒窘迫病史。無(wú)相關(guān)遺傳病家族史?；純荷蟮? 天起病，表現(xiàn)為左上肢抖動(dòng)，持續(xù)30～40 s自行緩解，3～5次/d，無(wú)面色發(fā)紺、口吐白沫、大小便失禁，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予苯巴比妥（15 mg/d，分2 次）口服無(wú)效。生后18 天患兒出現(xiàn)清醒期雙眼向左側(cè)凝視、左側(cè)面部肌肉抽動(dòng)、左上肢陣攣，伴哭鬧、發(fā)紺，持續(xù)1～5 min自行緩解，1、2 次/d，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院住院，繼續(xù)口服苯巴比妥15 mg/d，同時(shí)加用左乙拉西坦口服液（0.4 mL/d，bid）。生后第23 天起清醒及睡眠期癲癇發(fā)作頻繁，短則3～5 min、長(zhǎng)則半小時(shí)發(fā)作1次，24小時(shí)達(dá)100余次，左乙拉西坦逐漸加至 1.6 mL/d（1天2次）抽搐仍不能控制，予加用丙戊酸鈉溶液（2.4 mL/d，bid），發(fā)作有所減輕。出生后第42天患兒仍有抽搐發(fā)作，遂轉(zhuǎn)至本院。入院時(shí)患兒有兩種癲癇發(fā)作形式：①痙攣發(fā)作，表現(xiàn)為雙上肢屈曲、內(nèi)收，伴或不伴點(diǎn)頭，每次10余下成串或單下發(fā)作，持續(xù)30 s至1 min自行緩解，緩解后哭鬧；②局灶性發(fā)作伴泛化，表現(xiàn)為雙眼左斜5～10 s，左下肢強(qiáng)直，繼之右側(cè)肢體屈曲抖動(dòng)，伴意識(shí)障礙，每小時(shí)10余次，間隔3～5 min發(fā)作1次。父母均體健，非近親結(jié)婚；哥哥出生時(shí)有缺氧缺血性腦病，1歲前予康復(fù)治療，現(xiàn)7歲，學(xué)習(xí)成績(jī)一般，韋氏智力測(cè)試IQ 70分（正常值＞90分）?；純喝朐簳r(shí)體格檢查：體質(zhì)量5 kg，頭圍36 cm，身長(zhǎng)55 cm，追聽(tīng)、追視欠佳；前囟平軟，張力正常，直徑為1.5 cm×2.0 cm，全身皮膚無(wú)牛奶咖啡斑及色素脫失斑，頸軟，心肺無(wú)異常；顱神經(jīng)檢查無(wú)異常，四肢肌肉無(wú)萎縮，四肢肌力、肌張力低下，病理征陽(yáng)性。

患兒主要實(shí)驗(yàn)室檢查顯示，血生化、血氨、乳酸、丙酮酸、銅藍(lán)蛋白、同型半胱氨酸均無(wú)異常，甲狀腺功能無(wú)異常，血、尿遺傳代謝病篩查無(wú)異常。心臟彩超示卵圓孔未閉，左室心內(nèi)膜回聲稍強(qiáng)。未行相關(guān)腦組織及器官病理檢查。

為進(jìn)一步明確患兒病因，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患兒父母簽署知情同意書后，采集先證者及其父母、哥哥全血各2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，送往本院遺傳代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及北京智因東方行拷貝數(shù)變異及全外顯子基因測(cè)序（WES）。結(jié)果顯示，患兒染色體核型及拷貝數(shù)變異分析未見(jiàn)異常。GRIN 2 B基因13號(hào)外顯子發(fā)生雜合錯(cuò)義變異，(NM_000834)：c.2635 G＞A(p.Glu 879 Lys)；父親、母親、哥哥一代Sanger家系測(cè)序驗(yàn)證均為野生型（圖1）。該變異c.2635G＞A(p.Glu879Lys)為新生變異（de novo），符合強(qiáng)致病證據(jù)PS 2；該變異位于變異熱點(diǎn)和/或位于已知無(wú)良性變異的關(guān)鍵功能區(qū)域，符合中等致病證據(jù)等級(jí)1（PM1）；在dbSNP、ESP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及ExAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)收錄，符合中等致病證據(jù)PM2；Polyphen2和Mutation Taster等多種軟件預(yù)測(cè)其可能為有害變異，符合支持致病證據(jù)PP3。根據(jù)2015年《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》[3]，參考HGMD Pro、PubMed、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)，c.2635G＞A變異的致病性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，該變異級(jí)別為PS2+PM1+PM2+PP3，評(píng)定為可能致病變異。

圖1 GRIN2B 基因測(cè)序圖

入院后根據(jù)患兒的臨床特點(diǎn)、腦電圖、頭顱影像學(xué)表現(xiàn)明確診斷為EOEE，結(jié)合基因檢查結(jié)果，考慮為GRIN2B基因變異所致EOEE。應(yīng)用咪達(dá)唑侖1周，維生素B6提高驚厥閾值，逐漸停用苯巴比妥、左乙拉西坦，丙戊酸鈉減量；應(yīng)用托吡酯1月余，由1 mg/(kg·d)逐漸加量至5 mg/(kg·d)，仍不能完全控制發(fā)作；加用奧卡西平口服，劑量由10 mg/(kg·d)逐漸加至30 mg/(kg·d)，聯(lián)合抗癲癇治療4個(gè)月，患兒6個(gè)月時(shí)癲癇發(fā)作逐漸控制（圖2）。

圖2 患兒診療時(shí)間軸

患兒出院后每月隨訪1 次，同時(shí)進(jìn)行康復(fù)功能訓(xùn)練，發(fā)育較正常同齡兒落后，3月齡抬頭，不穩(wěn)；5月齡能翻身；8月齡才會(huì)獨(dú)坐，不能爬行；12月齡稍能扶站，但不穩(wěn)，不能行走。出院后無(wú)癲癇發(fā)作，腦電圖未見(jiàn)異常放電。2月齡長(zhǎng)程視頻腦電圖（VEEG）示醒-睡各期均有多灶性尖波、棘波發(fā)放；4 月齡時(shí)VEEG示睡眠期右側(cè)額葉、中央?yún)^(qū)尖波、棘慢波發(fā)放伴泛化累及全導(dǎo)（圖3）；8及12月齡VEEG均正常。8月齡復(fù)查頭顱磁共振成像（MRI）示雙側(cè)額部蛛網(wǎng)膜下腔增寬（圖4）。12月齡時(shí)體格檢查：體質(zhì)量8 kg，頭圍47 cm，身長(zhǎng)65 cm（＜P3）；前囟未閉，全身皮膚無(wú)牛奶咖啡斑及色素脫失斑，頸軟，心肺無(wú)異常；顱神經(jīng)檢查無(wú)異常；四肢肌肉無(wú)萎縮，四肢肌力、肌張力低下，病理征均陰性。12月齡Gesell神經(jīng)發(fā)育量表評(píng)估示：大運(yùn)動(dòng)功能相當(dāng)于6月齡，精細(xì)動(dòng)作相當(dāng)于6 月齡，語(yǔ)言功能相當(dāng)于7 月齡，適應(yīng)能力相當(dāng)于6月齡，社會(huì)行為相當(dāng)于5月齡，總發(fā)育商（DQ）為52分（正常80～100分）。

圖3 患兒VEEG 檢查結(jié)果

圖4 患兒8 月齡頭顱MRI 檢查結(jié)果

2 討論

EOEE 包括新生兒期發(fā)病的早期肌陣攣癲癇性腦病、嬰兒游走性部分性發(fā)作、大田原綜合征、嬰兒痙攣、嬰兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇（Dravet綜合征）、維生素B6依賴性腦病等疾病，具有早發(fā)性、發(fā)作形式多樣、難治性癲癇、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后及嚴(yán)重腦電圖異常放電特征[4]。EOEE病因目前不完全明確，主要與神經(jīng)遞質(zhì)釋放及合成，突觸修剪和發(fā)生，神經(jīng)元分化、遷移，膜受體、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多個(gè)基因變異有關(guān)[5]。目前癲癇遺傳學(xué)病因研究主要集中在離子通道基因上，一些非離子通道基因也與EOEE神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，從而導(dǎo)致EOEE的發(fā)病機(jī)制不盡相同[6]。

本研究在1例女性E O E E 患兒體內(nèi)檢測(cè)到GRIN2B基因的13號(hào)外顯子上存在一處新生雜合錯(cuò)義變異，(NM_000834)：c.2635G＞A(p.Glu879Lys)，經(jīng)過(guò)WES 數(shù)據(jù)的分析篩選，未發(fā)現(xiàn)其他與患兒臨床表型相關(guān)的變異基因。該基因變異根據(jù)2015 年《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》被評(píng)定為可能致病變異[3]?；純焊改阁w健，哥哥智力稍低下，均無(wú)癲癇發(fā)作，在此位點(diǎn)上的基因型均表現(xiàn)為野生型，表明該變異在此家系中符合家系共分離，提示其為新生位點(diǎn)的錯(cuò)義變異，結(jié)合患兒的臨床特點(diǎn)和基因突變家系分析，推測(cè)該變異為本病可能性遺傳學(xué)病因，根據(jù)患兒的臨床特征可診斷為EOEE 27型（OMIM：616139）。本例患兒GRIN 2 B基因發(fā)生雜合變異(NM_000834)：c.2635G＞A(p.Glu879Lys)，國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)尚無(wú)該位點(diǎn)變異的報(bào)道。

GRIN基因家族編碼3 類NMDA 受體亞基：結(jié)合2個(gè)甘氨酸的GluN1（GRIN1的產(chǎn)物）亞基、結(jié)合2個(gè)谷氨酸的GluN2（GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C和GRIN 2 D）亞基的雙異四聚體或三異四聚體和結(jié)合甘氨酸的GluN 3（GRIN 3 A 和GRIN 3 B），NMDA受體由甘氨酸結(jié)合GluN1亞基和谷氨酸結(jié)合GluN2構(gòu)成。NMDA受體至少可以分為3個(gè)家族，其命名基于對(duì)GRIA、GRIK 產(chǎn)生的選擇性受體激動(dòng)劑AMPA以及NMDA 的GRIN基因。NMDA 受體為離子型谷氨酸受體，是大腦中表達(dá)的配體門控離子通道，介導(dǎo)興奮性神經(jīng)傳遞Ca2+釋放，通過(guò)NMDA 受體發(fā)出的信號(hào)在大腦發(fā)育、學(xué)習(xí)、記憶和其他更高的認(rèn)知功能中起重要作用。GluN1亞基在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，而GluN 2（A-D）亞基的4 個(gè)亞型具有不同的時(shí)空表達(dá)模式，由GRIN 2 B編碼的GluN 2 B亞基在產(chǎn)前得到高度表達(dá)，并且在出生后大部分腦部表達(dá)水平開(kāi)始下降；GluN 2 B 出生后表達(dá)逐漸限制于前腦[7]。含有GRIN 2 B亞基的NMDA 受體具有如下特點(diǎn)：①對(duì)Ca2+有高度通透性；②僅在谷氨酸和甘氨酸共同存在的情況下才能有效激活；③能被Zn2+及GRIN 2 B的非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑所阻斷。

GRIN2B基因位于12p13.1區(qū)域，為離子型谷氨酸鹽受體的NMDA 亞基2 B 基因（GRIN 2 B），在ClinVar、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中均有收錄，由1 484個(gè)氨基酸組成，包含1個(gè)氨基末端結(jié)構(gòu)域、2個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（S1和S2）、4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（M1～M4）和1個(gè)C 末端結(jié)構(gòu)域，致病性錯(cuò)義變體聚集在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域S1和S2以及跨膜結(jié)構(gòu)域M1～M4內(nèi)或相鄰區(qū)域[8]。GRIN2B為長(zhǎng)度約400 kb的基因組DNA，包含13個(gè)外顯子（轉(zhuǎn)錄NM_000834.4），在基因變異致病性中多為新發(fā)錯(cuò)義變異，較少為無(wú)義及移碼變異。鑒于GRIN2B在控制NMDA受體功能中的重要作用，GRIN2B亞基表達(dá)或功能變異的相關(guān)破壞可能會(huì)導(dǎo)致多種神經(jīng)發(fā)育表型，GRIN 2 B亞基表達(dá)在突觸回路的可塑性、細(xì)胞遷移、分化和神經(jīng)興奮性傳遞形成過(guò)程中均起重要作用[7]。

GRIN 2 B基因關(guān)聯(lián)的疾病是嬰兒EOEE 27型（OMIM：616139），主要臨床表型為多種神經(jīng)發(fā)育障礙，包括難治性癲癇發(fā)作、癲癇持續(xù)狀態(tài)、發(fā)育遲緩/智力障礙、自閉癥譜系障礙、注意力缺陷多動(dòng)障礙、小頭畸形、全面性發(fā)育遲緩、共濟(jì)失調(diào)、肌張力異常（痙攣和/或肌張力低下，有時(shí)與進(jìn)食困難有關(guān)）、運(yùn)動(dòng)障礙及視覺(jué)障礙。腦電圖提示多種異常放電，頭顱MRI 示腦部皮質(zhì)發(fā)育畸形，對(duì)多種抗癲癇藥物療效差。有研究表明，NMDA 受體GRIN 2 B 亞基過(guò)度激活是癲癇發(fā)作的一個(gè)重要原因[9-10]。

影響N M D A R 功能和表達(dá)，從而編碼人類GluN 2 B（NP_000825）基因變異可引起包括癲癇發(fā)作、智力障礙、發(fā)育遲緩、肌張力減退/肌張力增高、自閉癥和/或言語(yǔ)障礙等表型[11]，文獻(xiàn)報(bào)道該基因的臨床表型還包括帕金森病。因本患兒年齡較小，目前不能行走，需要繼續(xù)長(zhǎng)期隨訪觀察。相關(guān)研究通過(guò)外顯子基因檢查報(bào)道GRIN2B相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙患兒中，較常見(jiàn)的為癲癇發(fā)作以及自閉癥譜系障礙和自閉癥樣行為，其中癲癇發(fā)作多為全面性、局灶性和/或癲癇性痙攣，部分為多種癲癇發(fā)作類型[12]。

發(fā)育延遲/智力障礙多為輕、中度改變，同時(shí)也包括小頭畸形、肌張力障礙、運(yùn)動(dòng)障礙或舞蹈樣運(yùn)動(dòng)障礙、皮質(zhì)視覺(jué)障礙。嬰幼兒頭顱MRI 顯示蛛網(wǎng)膜下腔增寬，部分為皮質(zhì)發(fā)育不良、基底節(jié)異常及海馬發(fā)育不良等改變。研究報(bào)道，GRIN 2 B基因致病雜合變異類型和智力障礙有一定相關(guān)性[6,8]，其中無(wú)義或移碼變異傾向于表現(xiàn)為輕度或中度智力障礙，而致病性錯(cuò)義變異可表現(xiàn)為嚴(yán)重的智力障礙，GRIN2B相關(guān)神經(jīng)發(fā)育障礙的外顯率被認(rèn)為是100%。本例患兒利用核心家系全外顯子組測(cè)序，檢測(cè)到GRIN 2 B基因(NM_000834)：c.2635G＞A(p.Glu879Lys)變異為新生錯(cuò)義雜合變異，結(jié)合臨床表型特點(diǎn)及基因致病等級(jí)，明確診斷為EOEE，該變異被評(píng)定為可能致病變異，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步蛋白功能驗(yàn)證。

GRIN 2 A基因的變異體通常與癲癇表型相關(guān)，但GRIN 2 B基因的變異體通常存在于神經(jīng)發(fā)育障礙患兒中。GRIN 2 B基因變異引起的早期癲癇性腦病相對(duì)罕見(jiàn)。查閱文獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)NMDA 受體GRIN 2 B亞基基因與癲癇相關(guān)性的報(bào)道。本例患兒起病較早，抽搐頻繁，發(fā)作形式初為局灶性發(fā)作、陣攣發(fā)作，后演變?yōu)榀d攣發(fā)作、局灶性發(fā)作繼發(fā)全面性發(fā)作，伴輕度精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，腦電圖表現(xiàn)為多種放電形式。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，該基因?qū)е略缙诎d癇性腦病，對(duì)多種抗癲癇藥物療效較差，GRIN2B基因的部分錯(cuò)義變異導(dǎo)致有蛋白結(jié)構(gòu)的功能獲得或功能喪失，其中對(duì)功能獲得類型應(yīng)用NMDA受體阻滯劑（如美金剛、拉普洛地爾）治療有效[13-14]。目前無(wú)相關(guān)治療的藥物臨床試驗(yàn)研究，而本病例對(duì)丙戊酸鈉、苯巴比妥、左乙拉西坦等抗癲癇藥物療效差，后應(yīng)用奧卡西平、托吡酯聯(lián)合治療癥狀逐漸得到控制，治療后無(wú)發(fā)作，復(fù)查腦電圖異常放電消失。其中難治性癲癇發(fā)作、發(fā)育遲緩/智力障礙等部分臨床癥狀與國(guó)外報(bào)道相一致[8]，其余小頭畸形、肌張力障礙表現(xiàn)暫不明顯，不排除年齡較小所致的臨床表型輕微的可能，需進(jìn)一步長(zhǎng)期隨訪。

綜上所述，EOEE 主要的臨床表現(xiàn)為頻繁難治的發(fā)作、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩伴共濟(jì)失調(diào)、自閉癥譜系障礙、注意力缺陷/多動(dòng)障礙、小頭畸形、視覺(jué)障礙，MRI示髓鞘發(fā)育不良或額顳部蛛網(wǎng)膜下腔增寬，腦電圖表現(xiàn)為多種異常放電形式，對(duì)多種抗癲癇藥物療效差。因該病臨床表型多樣，輕重不一，診斷相對(duì)困難，預(yù)后較差，嚴(yán)重者可致患兒死亡。對(duì)臨床上病因不明的EOEE 患兒，可盡早行全外顯子或癲癇相關(guān)基因檢測(cè)以明確診斷，可對(duì)治療及遺傳咨詢提供幫助，能夠更好地判斷預(yù)后。由于本研究?jī)H報(bào)道1例家系EOEE 患兒，存在一定局限性，通過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)有GRIN2B基因新生錯(cuò)義突變，而c.2635G＞A(p.Glu879Lys)是患兒可能的病因，尚需較多樣本病例及多家系研究進(jìn)一步探索該病的遺傳機(jī)制及診治經(jīng)驗(yàn)。