魏姍姍， 楊敏生， 梁海永

(1.衡水學(xué)院， 河北 衡水 053000; 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 河北 保定 071000)

桃(Prunuspersica)是薔薇科(Rosaceae) 李屬(Prunus)桃亞屬植物，起源于中國的西部地區(qū)[1]，在長期的人工選育過程中形成了適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境、滿足不同市場需求的品種，現(xiàn)分布在歐、亞、美、澳、非等五大洲，是一種在全球范圍內(nèi)廣泛種植的落葉類核果果樹[2-3]。相關(guān)研究表明，國內(nèi)各種桃品種種質(zhì)資源圃共收集保存了2 000余份桃種質(zhì)資源[4]，了解這些資源是我們更好利用桃種質(zhì)資源的前提。從20世紀(jì)80年代初開始，國內(nèi)已有不少科研工作者對桃的種質(zhì)資源進(jìn)行分類[5]?，F(xiàn)在，已經(jīng)可以從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記等方面對桃品種進(jìn)行分類和鑒定[6]。但上述方法不適合一些雜交的桃品種分類。因此研究桃品種的分子標(biāo)記輔助分類具有重要的意義[7]。

簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat，SSR) 具有標(biāo)記多態(tài)性好、通用性強(qiáng)且穩(wěn)定易重復(fù)等特點(diǎn)，廣泛用于鑒定果樹種質(zhì)資源、分析果樹親緣關(guān)系[8]。但是，桃品種中已報道的SSR引物較少[9]。2013年，Verde等[10]將80 797條桃品種的ESTs 序列上傳至 NCBI，為以后人們利用SSR標(biāo)記對桃品種進(jìn)行遺傳多樣性分析提供了寶貴的資源[11]。凌世鵬等[12]分析了53份桃資源的遺傳多樣性。包文泉等[13]對長柄扁桃10個野生群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析。本研究通過查找分布在桃品種8個連鎖群中的SSR位點(diǎn)，利用Popgene軟件對95個桃品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期更好地揭示桃品種中不同的生物學(xué)性狀與連鎖群間的遺傳關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

95份供試材料主要來源于保定滿城縣林業(yè)局分院果樹種子苗木站，所取材料及編號見表1。采集桃幼嫩葉片，以保鮮袋包裝避免高溫，編號后帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑及設(shè)備：2×TaqMaster Mix(是由TaqDNA Polymerase、PCR buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系)購自北京世紀(jì)生物科技有限公司；相關(guān)的PCR引物序列是由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成的；PCR反應(yīng)由Biometer公司的TG型PCR儀完成。引物分別從桃的8對染色體上各選取4個SSR位點(diǎn)，從中篩選出18對引物。其序列如表2所示[14]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取及純化

采用改良的CTAB法提取桃的基因組DNA，進(jìn)行PCR之前，用微量分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量與濃度。并將DNA稀釋至30 ng/μL以備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)總體積為10 μL，包括：4 μL 2×TaqMaster Mix引物0.5 μmol/L，1 μL模板DNA。SSR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變形5 min，94 ℃變形50 s，53～60 ℃退火50 s，72 ℃復(fù)性50 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，最后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3電泳檢測

將PCR產(chǎn)物與1/2體積的6×Loading Buffer充分混勻，取1.5 μL上樣在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上，之后用230 V電壓進(jìn)行60 min電泳。結(jié)束后，取下凝膠，放在0.1% AgNO3中銀染10 min；之后倒掉液體，用水洗去殘液。再將凝膠放在含有1.5% NaOH和0.4%甲醛的顯色液中直至條帶清晰為止。取出凝膠，并對其拍照記錄[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

假定凝膠上相同位置的條帶是來自于同一連鎖群上的同一個等位基因。按基因型統(tǒng)計(jì)，從下往上，條帶依次記作A、B、C、D、E、F、G、H。對每個樣品的擴(kuò)增電泳譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，構(gòu)成基因型的原始數(shù)據(jù)矩陣。假定桃品種中各個等位基因的頻率與哈迪-溫伯格平衡相符。利用Popgene軟件，計(jì)算桃品種間的觀測雜合值、觀測純和值、Nei’s基因多樣度、Shannon信息指數(shù)、期望雜合值、期望純和值、等位基因頻率及群體間遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 連鎖群遺傳分析

如表3所示，桃品種8個連鎖群觀測到的等位基因數(shù)在4～9之間，有效等位基因數(shù)從2.2～5.5。第7連鎖群的觀測純合值最高，為0.89；其有效等位基因數(shù)最少,為2.2。第6連鎖群的觀測純合值最低，為0.47；其有效等位基因數(shù)最高，為5.45。說明桃品種的7號連鎖群上的等位基因較少且純合較多，表明其連鎖群的保守性較高，不易突變。而桃品種的6號連鎖群上的等位基因較多且宜雜合，表明其連鎖群的保守性較差，易發(fā)生突變。從表2～表10中可以看出，所含有的有效等位基因數(shù)目從小到大依次為：7=2<4<8<1<5<3<6;桃品種8個連鎖群的純合度依次為：7>2>1>3>8>5>4>6。其中,第4連鎖群和第5連鎖群較為特殊。第4連鎖群有效等位基因數(shù)較多,其有效等位基因數(shù)較少,其純合度較低,即雜合度較高;第5連鎖群恰好相反,其有效等位基因數(shù)較多,其純合度較高,即雜合度較低。

表1 試驗(yàn)材料

表2 試驗(yàn)SSR引物

表3 不同連鎖群桃品種的遺傳多樣性

從表4可以看出，等位基因A、B、C和D是桃品種中分布最廣的四種基因,在桃的8個連鎖群中均有分布。等位基因E僅次于上述四種等位基因，分布在除第7連鎖群外的其余連鎖群上。等位基因H和I為6號連鎖群特有基因。從分布較廣的四種基因來看，等位基因C的頻率較高，為0.27，等位基因A的頻率較低，為0.11。從基因在連鎖群上的分布情況來看，等位基因A在第6連鎖群的頻率最高，為0.31，在第7和第8連鎖群的頻率最低，為0.03；等位基因B在第4連鎖群的頻率最高，為0.55，在第7連鎖群的頻率最低，為0.03；等位基因C在第2連鎖群的頻率最高，為0.63，在第6連鎖群的頻率最低，為0.02；等位基因D在第7連鎖群的頻率最高，為0.49，在第2和第6連鎖群的頻率最低，為0.06；等位基因E在第8連鎖群的頻率最高，為0.36，在第2連鎖群的頻率最低，為0.01；等位基因F在第5連鎖群的頻率最高，為0.22，在第3連鎖群的頻率最低，為0.09；等位基因G在第6連鎖群頻率較高，而等位基因H和I僅在6號連鎖群出現(xiàn)。

表4 不同連鎖群桃品種等位基因頻率

2.2 果實(shí)形狀類群遺傳分析

表5所示，球形和扁球形兩個類群觀測到的等位基因數(shù)在4～5之間，有效等位基因數(shù)在2.7左右。兩個類群從雜合值和純合值可以看出，球形果實(shí)品種純合子較多,而扁球形果實(shí)品種雜合子較多?；谔夜涡誀畹念惾哼z傳分析中，扁球形類群的Nei’s基因多樣度高于球形類群，說明扁球形類群遺傳多樣性更為豐富。

表5 不同果實(shí)形狀桃品種的遺傳多樣性

表6列出了球形和扁球形兩個桃類群的平均等位基因頻率。通過分析比較可以看出，扁球形類群等位基因頻率分布較球形類群更為均衡，說明扁球形類群雜合性偏高。等位基因B的頻率在兩個類群中同為最高。通過對表中數(shù)據(jù)分析可知，球形類群等位基因頻率順序與扁球形類群差異較大，這說明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表6 不同果實(shí)形狀桃品種等位基因頻率

從遺傳一致度(表7)看，兩個類群的遺傳一致度很高，為0.96，反映出連續(xù)分布類群間有較小的遺傳分化特點(diǎn)。

表7 兩類群間的Nei氏遺傳一致度的無偏估計(jì)值

2.3 果實(shí)表皮有無毛類群遺傳分析

表8所示,有毛和無毛兩個類群觀測到的等位基因數(shù)在4左右，有效等位基因數(shù)都是2.8。綜合表中數(shù)據(jù)可知，兩類群純合子較多，所占比例接近?；谔矣袩o毛性狀的類群遺傳分析中，有毛類群的Nei’s基因多樣度和Shannons遺傳表型指數(shù)均與無毛類群接近，說明兩者遺傳多樣性相似。

表8 果皮有無毛桃品種類群的遺傳多樣性

如表9，等位基因C的頻率在兩個類群中同為最高。等位基因E與H，B與D，A與F在兩類群中的等位基因頻率順序恰好相反，據(jù)此推測等位基因E，B和A可能與有毛性狀相關(guān)，等位基因H、D和F可能與無毛性狀相關(guān)。

表9 果皮有無毛桃品種類群的等位基因頻率

如表10,兩種群的遺傳一致度很高，為0.93，反映出連續(xù)分布種群間有較小的遺傳分化特點(diǎn)。

表10 兩類群間的Nei氏遺傳一致度的無偏估計(jì)值

3 討 論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)由于其共顯性強(qiáng)、檢測方便且便于重復(fù)等特點(diǎn)，已成為果樹育種中最重要的分子標(biāo)記之一[15]。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已成功用于桃的遺傳分析及品種鑒定[16]。本研究采用來自桃8條染色體18對核心引物，對95份桃品種的基因連鎖群和遺傳性狀進(jìn)行遺傳分析。更好地區(qū)分桃已有的不同性狀，為桃種群分類提供更好的分子鑒定體系。

遺傳多樣性是物種長期進(jìn)化的結(jié)果，是種群生存和發(fā)展的前提[17]。通過Nei’s基因多樣度、Shannons信息指數(shù)不難看出，桃品種群體的8個連鎖群中7號連鎖群上的等位基因較少且純合較多，表明其連鎖群的保守性較高，不易突變。而桃品種的6號連鎖群上的等位基因較多且易雜合，表明其連鎖群的保守性較差，易發(fā)生突變。等位基因A、B、C和D是桃品種中分布最廣的三種基因，在桃的8個連鎖群中均有分布，為未來桃品種的連鎖群基因分析奠定了基礎(chǔ)。

基于桃果形性狀的類群遺傳分析中，扁球形類群的Nei’s基因多樣度略高于球形類群，Shannons遺傳表型指數(shù)極為接近，球形的為1.06，扁球形的為1.05，說明扁球形與球形的品種類群遺傳多樣性比較均衡，果實(shí)的形狀在選種時并沒有作為重要的指標(biāo)。

基于桃有無毛性狀的類群遺傳分析中，有毛類群的Nei’s基因多樣度和Shannons遺傳表型指數(shù)均高于無毛類群，說明有毛類群的遺傳多樣性和基因雜合度高于無毛類群。SSR分析中最重要的環(huán)節(jié)是引物的篩選，只要能開發(fā)出合適的引物，能夠廣泛地覆蓋不同的染色體，并對分析體系進(jìn)行優(yōu)化，就能挖掘SSR在種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用潛力。