李冬桂，呂麗蘭，陸覃昱，吳 鳳，李慧敏，黃嬋嬋，陳羽燁，甘志勇

〔1廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（南寧），廣西南寧 530001；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，廣西南寧 530001〕

高氯酸鹽是一種有毒的無機化學物質(zhì)，其物理化學性質(zhì)及其穩(wěn)定，在環(huán)境中不易分解[1]。高氯酸鹽水溶性高，在地下水和地表水中流動性強，可經(jīng)水、土壤等途徑被植物富集吸收，并通過食物鏈作用進入人體[2-3]。高氯酸鹽在體內(nèi)富集對人體健康造成神經(jīng)毒性、生殖毒性和遺傳毒性等方面危害[4]。隨著經(jīng)濟和科技高速發(fā)展，高氯酸鹽被廣泛應(yīng)用于航空業(yè)、軍火工業(yè)、橡膠制品等領(lǐng)域[5]。高氯酸鹽污染食品的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，蔬菜、牛奶及其制品、飲用水、茶葉、肉類等食品中都檢出不同含量水平的高氯酸鹽[6-7]。

目前，高氯酸鹽分析方法主要有離子色譜法、離子色譜—質(zhì)譜法、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-9]。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法具有抗基質(zhì)干擾優(yōu)異，檢測靈敏度高，檢出限低，儀器使用更為普及、方法優(yōu)化前景更廣闊等優(yōu)點[10]。高氯酸鹽的檢測，較多采用該方法[11]。固相萃取凈化柱可以降低質(zhì)譜基質(zhì)干擾，提高待測物檢測的靈敏度。由于不同類型凈化柱針對不同基質(zhì)樣品，凈化效果和檢測成本存在差異，根據(jù)喀斯瑪商城（https://www.casmart.com.cn）查詢，商品價格PRiME HLB 固相萃取柱＞石墨碳黑柱[12]＞C18固相萃取柱。我國對不同基質(zhì)中高氯酸鹽的檢測標準仍不完善。SN/T 4089-2015《出口食品中高氯酸鹽的測定液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法》推薦使用凈化柱為C18柱[13]，BJS201706《食品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定》推薦使用PRiME HLB 柱[14]，目前尚未有關(guān)于C18柱和HLB 柱針對蔬菜、水果和茶葉樣品中高氯酸鹽檢測凈化效果差異的相關(guān)文獻報道，且現(xiàn)有標準沒有蔬菜基質(zhì)樣品檢測凈化柱的推薦。擬研究采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法考察HLB柱，C18柱和石墨碳黑柱三種凈化柱在蔬菜、水果和茶葉檢測中凈化效果，篩選出適合蔬菜、水果和茶葉中高氯酸鹽檢測的固相萃取凈化柱，為完善農(nóng)產(chǎn)品中高氯酸鹽檢測標準提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：蔬菜水果樣品來自超市和農(nóng)貿(mào)市場的隨機取樣，蔬菜包括葉菜類、蕓薹屬類、根莖類、鱗莖類、茄果瓜類、食用菌類、豆類，水果樣品包括熱帶亞熱帶水果、仁果核果類，漿果類、柑橘類、瓜類等，茶葉樣品購買于超市及茶葉銷售商店，包括黑茶、紅茶、綠茶、花茶。

儀器：LC-20ADXR 超高壓液相色譜儀（日本島津公司）；API3200 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；KQ3200DE 超聲震蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋渦混勻器（德國IKA 公司）；3K30 臺式冷凍離心機（美國Sigma 公司）。

試劑耗材：乙腈、乙酸銨（色譜純，美國Fisher 公司）；高氯酸根標準溶液（ClO-4，1000mg/L，美國Inorganic Ventures 公司）；高氯酸根內(nèi)標溶液（Cl18O-4，100mg/L，美國 Cambridge Isotop Laborltories 公司）；C18固相萃取柱（500mg/6mL，Agilent 公 司）；PRiME HLB固相萃取柱（500mg/6cc，美國Waters 公司），石墨碳黑柱（500mg/6mL，Agilent 公司）。

1.2 溶液配制

準確移取高氯酸根及其內(nèi)標標準溶液適量，以水逐級稀釋分別配制為1mg/L 高氯酸根及其內(nèi)標標準中間液，-20℃冰箱避光保存。用流動相乙腈-20mmol/L 乙酸銨溶液稀釋中間液，配制系列濃度標準工作液為1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L，高氯酸根同位素內(nèi)標液濃度為20 μg/L。配制高氯酸根及其內(nèi)標標準混合液20 μg/L 作為對照溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

蔬菜、水果樣品用組織搗碎機制成勻漿，茶葉樣品用粉碎機粉碎，過40 目篩。準確稱取勻漿好的蔬菜、水果樣品5 g，粉碎的茶葉樣品1 g（精確至0.001 g），置于50 mL 離心管中，加入1 mg/L 高氯酸根同位素內(nèi)標中間液0.4 mL，加入超純水7 mL，混勻。蔬菜、水果樣品常溫振蕩超聲5 min，茶葉樣品60℃水浴振蕩超聲5 min，再加入13 mL 乙腈，混勻，進一步提取。蔬菜、水果樣品常溫振蕩超聲提取30 min，茶葉樣品60℃水浴振蕩超聲提取30 min，提取后樣品經(jīng)10000 r/min 常溫離心10 min，取上清液待凈化。

1.3.2 凈化

分別取5 mL 乙腈/ 水（V/V，13∶7）混合液過C18柱和石墨碳黑柱，重力洗脫活化，棄去洗脫液。當洗脫溶劑全部流出時，吸取離心后的樣品上清液至凈化柱內(nèi)，采用重力過柱。HLB 柱不需活化，直接吸取樣品上清液至凈化柱內(nèi)重力過柱，棄去前1 mL 流出液。收集各凈化柱的續(xù)濾液，過0.22 μm 濾膜供UPLC-MS/MS 測定。

1.3.3 色譜條件

液相色譜條件：色譜柱Acclaim TRINITYP1復合離子交換柱（100 mm×2.1 mm，3 um），流動相乙腈（A）和20 mmol/L 乙酸銨，流速0.4 mL/min，柱溫35℃，進樣量5 μL，梯度洗脫條件：0～0.2 min，70%A，0.2～3 min，70%～90%A，3～7 min，90%A，7～8 min，90%～70%A，8 min～11 min，70%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），負離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；電噴霧電壓（IS）5500 V；離子源溫度550℃；碰撞氣Medium；氣簾氣壓力（CUR）30.0 Psi；霧化氣壓力（Gas 1）55.0 Psi；輔助氣（Gas 2）55.0 Psi。由于氯原子有兩個同位素原子，因此高氯酸根有兩個母離子，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 高氯酸鹽的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.4 三種固相萃取柱凈化效果比較

在樣品凈化環(huán)節(jié)，從加標回收、色素干擾及色譜峰表現(xiàn)等方面對PRiME HLB、C18和石墨碳黑三種不同凈化柱的凈化效果進行考察擇優(yōu)。并用選出的凈化柱對不同樣品進行不同添加水平的回收試驗及對實際樣品進行檢測，檢驗適用性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 三種固相萃取柱對加標樣品絕對回收率比較

選擇空白基質(zhì)樣品，蔬菜以生菜、白菜、蘿卜、荷蘭豆為樣品，水果以柑橘、香蕉、梨、葡萄為樣品，茶葉以紅茶、茉莉花茶、綠茶、六堡茶為樣品。歐盟2020 年設(shè)定蔬菜、水果中高氯酸鹽限量值為0.05 mg/kg，茶葉為0.75 mg/kg。以歐盟對高氯酸鹽限量值為參考，選一個適合濃度添加水平，考察三種固相萃取柱絕對回收率。水果、蔬菜樣品中高氯酸根及其18O 標記高氯酸根添加水平均為80 μg/kg，茶葉樣品中高氯酸根及其18O 標記高氯酸根添加水平均為400 μg/kg，按照1.2.2 方法進行提取，并分別經(jīng)PRiME HLB、C18和石墨碳黑三種凈化柱凈化，考察三種凈化柱對高氯酸鹽及其內(nèi)標的絕對回收率影響，結(jié)果見表2。經(jīng)過HLB 柱和C18柱凈化的樣品，高氯酸鹽及其內(nèi)標絕對回收率相差不大，石墨碳黑柱處理的樣品，絕對回收率最低。

表2 不同基質(zhì)加標樣品過固相萃取柱后高氯酸鹽及其內(nèi)標絕對回收率

HLB 柱采用水浸潤性聚合物吸附劑，不需活化和平衡，可直接使用，可以去除鹽類、蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等常見基質(zhì)。C18柱是在硅膠表面鍵合十八烷基，可以去除色素、鹽、大分子等干擾物。石墨碳黑柱填充材料為石墨化碳顆粒，既可以吸附非極性和弱極性的化合物又可以吸附極性化合物，對化合物表現(xiàn)出很廣的吸附性。石墨碳黑柱處理的樣品，高氯酸鹽及其內(nèi)標絕對回收率最低，可能是因為石墨碳黑柱吸附能力較強，對高氯酸鹽及其內(nèi)標物有吸附。因此選擇HLB 柱和C18柱凈化樣品較適合。

2.2 三種固相萃取柱對加標樣品色素干擾

比較PRiME HLB、C18和石墨碳黑三種凈化柱除色素情況。石墨碳黑柱雖然能較好的吸附樣品中色素，但過凈化柱后，高氯酸鹽及其內(nèi)標絕對回收率最低。HLB 柱、C18柱對蔬菜、茶葉樣品色素的去除能力相當，對部分水果樣品，HLB 柱去除色素能力優(yōu)于C18柱，如葡萄樣品，凈化后效果見圖1，HLB 柱凈化后樣品比C18柱凈化后澄清。因此，水果樣品適用于HLB 柱，蔬菜、茶葉樣品適用于HLB 柱和C18柱。

圖1 經(jīng)HLB 柱、C18 柱和石墨碳黑柱凈化后樣液效果比較

2.3 三種固相萃取柱對加標樣品凈化后的色譜圖

選擇空白基質(zhì)樣品，考察了PRiME HLB，C18和石墨碳黑三種凈化柱對80 μg/kg 蔬菜、水果加標樣品，400 μg/kg 茶葉加標樣品提取液的凈化效果，高氯酸鹽的峰面積信號響應(yīng)值見表3。三種固相萃取柱凈化后的加標樣品色譜圖見圖2、圖3、圖4 所示，凈化后色譜圖峰形尖銳對稱。蔬菜、水果樣品均為過HLB 柱凈化后高氯酸鹽峰面積響應(yīng)最大，石墨碳黑柱最小。且HLB 柱與C18柱相比不用活化，節(jié)省試劑和時間。因此，蔬菜、水果樣品選擇HLB柱做為凈化柱。

圖2 三種固相萃取柱凈化茶葉加標樣品后高氯酸鹽及其內(nèi)標色譜圖

圖3 三種固相萃取柱凈化水果加標樣品后高氯酸鹽及其內(nèi)標色譜圖

圖4 三種固相萃取柱凈化蔬菜加標樣品后高氯酸鹽及其內(nèi)標色譜圖

表3 不同加標樣品經(jīng)過不同凈化柱后高氯酸鹽響應(yīng)值

茶葉樣品過HLB 柱和C18柱凈化后峰面積響應(yīng)值差不多，石墨碳黑柱最小。由于茶葉樣品經(jīng)HLB柱和C18柱凈化后均能獲得較好的絕對回收率，均適用茶葉樣品，但HLB 柱價格比C18柱貴[12]，因此茶葉樣品選擇C18柱凈化。

2.4 樣品加標過固相萃取柱的回收率影響

選擇空白基質(zhì)樣品、生菜、黃瓜、金針菇、香梨和茶葉6 個樣品，添加高、中、低3 個濃度的高氯酸鹽，按照1.3.1 前處理方法處理樣品，進行加標回收率實驗。其中蔬菜、水果用HLB 柱凈化、茶葉用C18柱凈化，每個濃度平行測定6 次，結(jié)果如表4所示。添加回收率平均值為89.25%～117.4%，RSD為0.59%～2.94%。說明HLB 柱滿足蔬菜、水果中高氯酸鹽的檢測要求，C18柱滿足茶葉中高氯酸鹽的檢測要求。

表4 6 種樣品加標過固相萃取柱回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.5 實際樣品檢測

取市售蔬菜、水果和茶葉樣品各10 份，按照1.3.1 前處理方法處理樣品。蔬菜、水果用HLB 柱凈化、茶葉用C18柱凈化，市售樣品檢測結(jié)果見表5所示。蔬菜中高氯酸鹽平均值為23.3 μg/kg，檢出率為90%，水果中高氯酸鹽平均值為1.35 μg/kg，檢出率為40%，茶葉中高氯酸鹽平均值為398.93μg/kg，檢出率為90%，說明蔬菜、水果和茶葉均受高氯酸鹽污染。

表5 市售樣品的高氯酸鹽檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定，對農(nóng)產(chǎn)品中內(nèi)標法檢測高氯酸鹽適用固相萃取柱進行考察。通過比較HLB 柱、C18柱和石墨碳黑柱對蔬菜、水果和茶葉中高氯酸鹽及其18O 標記高氯酸根同位素內(nèi)標物檢測的影響，確定了HLB 柱為蔬菜、水果中高氯酸鹽檢測凈化柱，C18柱為茶葉中高氯酸鹽檢測凈化柱。方法具有回收率高、操作簡單、價格實惠等優(yōu)點，為完善農(nóng)產(chǎn)品中高氯酸鹽檢測標準提供參考依據(jù)。