王玲芳,李尚來(lái),李琦琦,杜星,吳望軍,宋奔馳,李齊發(fā)*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.宿豫區(qū)正博生豬養(yǎng)殖場(chǎng),江蘇 宿遷 223800)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)是一種多功能生長(zhǎng)因子,是TGF-β超家族中被研究最為廣泛的一員,以細(xì)胞類(lèi)型依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性,例如特異性地影響細(xì)胞活力、凋亡、增殖、分化、黏附、遷移和上皮-間充質(zhì)化等[1-4]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1在各種正常的組織、細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中均存在,且在卵巢組織中表達(dá)量較高[5]。TGF-β1在哺乳動(dòng)物卵巢組織的多種細(xì)胞中均有表達(dá),如卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和各級(jí)卵泡的卵泡膜細(xì)胞,并在卵泡液中檢測(cè)到TGF-β1蛋白的存在[2,6]。TGF-β1可調(diào)節(jié)各種卵巢功能,包括類(lèi)固醇激素合成、卵泡發(fā)育和黃體功能[7]。例如,TGF-β1可抑制人黃體化顆粒細(xì)胞凋亡[8]。TGF-β1還參與顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間相互交流,在促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要作用[9]。卵泡液中TGF-β1可以促進(jìn)排卵、受精和早期胚胎發(fā)育,并能抑制顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。TGF-β1在豬黃體化顆粒細(xì)胞中可顯著抑制促黃體素誘導(dǎo)的孕酮升高[10]。TGF-β1與母豬繁殖性能關(guān)系密切,研究發(fā)現(xiàn)妊娠母豬血漿中TGF-β1濃度與繁殖性能有關(guān)[11]。另外,TGF-β1基因突變位點(diǎn)多態(tài)性與母豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián)[11-12]。吳艷萍[11]利用SSCP技術(shù)在大白豬、長(zhǎng)白豬、皮特蘭豬、圣特西豬和二花臉豬等豬種TGF-β1基因中發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變位點(diǎn)[第4內(nèi)含子32核苷酸(nt)處C>T突變,第6內(nèi)含子179 nt處 G>A 突變和1 043 nt處C>T突變,3′-UTR 2 490 nt處G>A突變和2 494 nt處G>A突變],共形成2種單倍型CGCAA(記為A)和TATGG(記為K),關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)大白豬群體中KK型母豬的初產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA型,兩者平均每胎相差1.02頭。為了進(jìn)一步研究TGF-β1基因多態(tài)性與母豬繁殖性能的關(guān)系,本文采用PCR和測(cè)序技術(shù)鑒定大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子全序列和突變位點(diǎn),分析突變位點(diǎn)多態(tài)性與母豬繁殖性能的關(guān)系,以及突變影響母豬繁殖性能的機(jī)制,以篩選可用于大白豬繁殖性狀分子育種的有效標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

325頭大白母豬耳組織樣來(lái)自江蘇省康樂(lè)陽(yáng)光豬場(chǎng),記錄各胎繁殖性能:總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)、產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)、死胎數(shù)(NSW)和出生窩重(LW),共1 145條記錄。豬新鮮卵巢來(lái)自江蘇竹順生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中杜洛克豬TGF-β1基因組序列(GenBank ID:397078)和mRNA序列(GenBank ID:NM_214015.2),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由北京擎科生物有限公司合成。

表1 本試驗(yàn)所用PCR引物

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用苯酚/氯仿抽提法提取豬耳組織樣或卵巢組織樣基因組DNA,使用分光光度計(jì)(Thermo公司)測(cè)濃度后稀釋至50 ng·μL-1,置于-20 ℃冰箱保存,以用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、DNA模板1 μL、2 × VazymeLAmp?Master Mix(南京諾唯贊公司)10 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,退火15 s,72 ℃ 40 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離,切膠、回收,由上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.4 突變位點(diǎn)篩選、分型和關(guān)聯(lián)性分析

以大白豬DNA混池(n=20)為模板,利用引物對(duì)P1(表1)擴(kuò)增和測(cè)定TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列,根據(jù)峰圖尋找潛在的突變位點(diǎn)。利用引物對(duì)P2(表1)對(duì)單個(gè)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,確定突變位點(diǎn),再對(duì)大白豬群體(n=325)進(jìn)行分型。根據(jù)文獻(xiàn)[13]中的方法統(tǒng)計(jì)大白豬群體中突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率,利用SAS 9.2軟件(SAS Institute Inc)進(jìn)行突變位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析。

1.5 克隆測(cè)序和序列分析

從豬新鮮卵巢上直徑為3～5 mm卵泡中抽取卵泡液,分離顆粒細(xì)胞,加入1 mL TRizol試劑(Invitrogen司),用TRizol-氯仿法提取顆粒細(xì)胞總RNA。測(cè)定RNA濃度后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,保存在-20 ℃?zhèn)溆?。具體方法參考文獻(xiàn)[14]。利用引物對(duì)P3(表1)擴(kuò)增豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因編碼區(qū)序列,擴(kuò)增產(chǎn)物切膠、回收后,按文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行克隆并測(cè)序。利用在線軟件miRBase(http://www.mirbase.org/)預(yù)測(cè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn);通過(guò)Jaspar數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);利用在線軟件MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer2/)預(yù)測(cè)CpG島(CGI),參數(shù):序列長(zhǎng)度>100 bp,CG含量>60%,觀察CpG數(shù)/預(yù)期CpG數(shù)>0.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列擴(kuò)增

利用引物對(duì)P1(表1)對(duì)大白豬耳組織樣基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果得到單一清晰的條帶(圖1)。測(cè)序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與GenBank中杜洛克豬TGF-β1基因相應(yīng)序列的一致性為99.69%。

圖1 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列分析

大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列全長(zhǎng)189 bp(圖2-A),序列中A、T、C、G堿基含量分別為13.23%、21.69%、39.15%和25.92%,其中A+T含量34.92%,C+G含量65.07%,可見(jiàn)C+G含量明顯大于A+T含量。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列與杜洛克豬的一致性為98.94%,比后者多2個(gè)堿基。在大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列的131～142 nt處發(fā)現(xiàn)一個(gè)由6個(gè)GT二核苷酸重復(fù)組成的微衛(wèi)星序列。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子上潛在的順式作用元件(cis-acting elements)進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果在這個(gè)區(qū)域預(yù)測(cè)到1個(gè)豬miRNA(ssc-miR-574-3p)結(jié)合位點(diǎn)和芳香烴受體(AHR)、Nrf2相關(guān)因子1(NRF1)和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1A)等多個(gè)與雌性生殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。另外,利用在線軟件MethPrimer在大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子32～132 nt處預(yù)測(cè)到1個(gè)CGI,長(zhǎng)度101 bp,含有14個(gè)CpG位點(diǎn)(圖2-B)。

圖2 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子核苷酸序列分析(A)和CpG島預(yù)測(cè)(B)

2.3 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子突變位點(diǎn)篩選

以大白豬池DNA為模板,利用引物對(duì)P1(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,在大白豬TGF-β1第4內(nèi)含子63～64核苷酸(nt)處發(fā)現(xiàn)1個(gè)2 bp序列(AC)的插入/缺失突變(圖3)。由于這個(gè)插入/缺失突變位于豬TGF-β1基因的8 666～8 667 nt處,因此命名為g.8666_8667delAC。但本試驗(yàn)并沒(méi)有檢測(cè)到武艷萍[11]在大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的32 nt處C>T突變。

圖3 大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC突變位點(diǎn)鑒定

2.4 大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性分析

大白豬群體(n=325)TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)分型顯示大白豬群體中含有3種基因型,分別定義為ins/ins型、ins/del型和del/del型(圖4-A)?；蛐皖l率計(jì)算發(fā)現(xiàn)ins/ins基因型頻率最高(57.8%),在大白豬群體中為優(yōu)勢(shì)基因型(圖4-B)。等位基因型頻率計(jì)算結(jié)果顯示等位基因ins的頻率最高(76.2%),為優(yōu)勢(shì)等位基因(圖4-C)。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)大白豬群體中TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)為0.36,為中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.250.05)。

圖4 TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性分析

2.5 g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬繁殖性能關(guān)聯(lián)性分析

關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示:ins/del基因型母豬的初產(chǎn)死胎數(shù)(NSB)顯著高于ins/ins基因型和del/del基因型母豬(P<0.05)(表2)。在所有胎次中,del/del基因型母豬的總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)比ins/ins基因型和ins/del基因型母豬每胎分別高0.47和0.46頭,雖未達(dá)到顯著水平(P>0.05),但每胎相差近0.50頭,在養(yǎng)豬實(shí)踐中也有一定的意義。

表2 大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.6 g.8666_8667delAC突變對(duì)TGF-β1基因mRNA剪接的影響

內(nèi)含子突變往往通過(guò)改變順式作用元件影響基因轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性,或通過(guò)選擇性剪接影響基因的功能[15-16]。分析發(fā)現(xiàn)g.8666_8667delAC突變未引起大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子順式作用元件的改變(圖2-A)。為了分析g.8666_8667delAC突變對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因選擇性剪接的影響,本試驗(yàn)分離了g.8666_8667delAC位點(diǎn)ins/ins基因型和ins/del基因型豬卵巢顆粒細(xì)胞,克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)同一基因型內(nèi)和不同基因型間卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度完全一致,說(shuō)明g.8666_8667delAC突變對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因選擇性剪接沒(méi)有影響。大白豬TGF-β1基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度1 173 bp,與人、獼猴、牛、豬、綿羊和小鼠等哺乳動(dòng)物一樣,也由390個(gè)氨基酸殘基組成,同樣含有經(jīng)典的N-端疏水信號(hào)肽、潛伏相關(guān)肽和TGF-β樣結(jié)構(gòu)域(圖5)。大白豬TGF-β1蛋白氨基酸序列與杜洛克豬的同源性為100%,與人、獼猴、牛和小鼠等的同源性分別為94.36%、94.62%、94.62%和89.23%,說(shuō)明哺乳動(dòng)物TGF-β1蛋白氨基酸序列比較保守。

圖5 大白豬和哺乳動(dòng)物其他物種TGF-β1基因編碼蛋白氨基酸序列比對(duì)分析

3 討論

TGF-β1是一個(gè)重要的雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育命運(yùn)(成熟排卵或閉鎖退化)決定因子,影響雌性繁殖力[17-18]。在豬卵巢組織中,TGF-β1在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中高表達(dá),在體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中添加 TGF-β1 可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖,抑制顆粒細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)雌激素(E2)和孕酮(P4)等類(lèi)固醇激素的分泌[13,19-20]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),TGF-β1可調(diào)節(jié)豬卵巢顆粒細(xì)胞狀態(tài)(增殖或凋亡)相關(guān)信號(hào)通路如FoxO、TGF-β、Wnt、PIK3-Akt、p53和Ras等通路信號(hào)分子的表達(dá);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)多個(gè)已知的影響母豬繁殖性狀的候選基因,如胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3基因(IGFBP3)[21]和WNT家族成員10B基因(WNT10B)[22-23]等也是TGF-β1的下游靶基因。本文在TGF-β1基因第4內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的與大白豬繁殖性能顯著關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)g.8666_8667delAC,進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1基因是大白豬繁殖性狀的關(guān)鍵基因。但我們并未在研究的大白豬群體中發(fā)現(xiàn)前人鑒定的第4內(nèi)含子上的另一個(gè)突變位點(diǎn)。武艷萍[11]研究發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子的32 nt處C>T突變位點(diǎn)與第6內(nèi)含子的179 nt處G>A突變和1 043 nt處C>T突變、3′-UTR的2 490 nt處G>A突變和2 494 nt處G>A突變的合并基因型與大白豬初產(chǎn)TNB顯著關(guān)聯(lián)。Du等[13]研究發(fā)現(xiàn) miR-130a 啟動(dòng)子區(qū)-573G>A、-540T>C位點(diǎn)與TGF-β1基因c.1583A>G位點(diǎn)合并基因型與大白豬NBA、NSB和LW顯著關(guān)聯(lián)。

目前一些功能和作用機(jī)制被注釋的與家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)主要為啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)和3′-UTR上的突變位點(diǎn)[13,24],而大量的內(nèi)含子區(qū)突變位點(diǎn)則很少被關(guān)注[25]。實(shí)際上,內(nèi)含子突變與宿主基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性和功能關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子可作為基因內(nèi)部啟動(dòng)子或增強(qiáng)子,這些內(nèi)含子突變可引起與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合力的變化,從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[26-27]。在海腎螢光素酶的開(kāi)放閱讀框(ORF)中,插入人磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)基因的第6內(nèi)含子序列,可以增強(qiáng)海腎螢光素酶基因的表達(dá)[28]。Li等[25]在骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB(BMPR1B)基因第1內(nèi)含子中ESR1反應(yīng)元件(ERE)上發(fā)現(xiàn) 4個(gè)突變位點(diǎn),高繁殖力豬種特異的單倍型ERE與轉(zhuǎn)錄因子ESR1結(jié)合力強(qiáng),子宮中BMPR1B基因mRNA和蛋白表達(dá)水平高。另外,內(nèi)含子突變還通過(guò)影響基因的選擇性剪接來(lái)影響基因的功能[15-16],研究發(fā)現(xiàn)A型血友病患者F8基因中的內(nèi)含子突變c.6430_3C>G導(dǎo)致F8基因剪接效率低或剪接錯(cuò)誤,影響F8蛋白的正常功能[16]。本文研究發(fā)現(xiàn)g.8666_8667delAC突變未引起大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子上順式作用元件的改變,也不影響豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因的選擇性剪接。因此,g.8666_8667delAC位點(diǎn)突變影響大白豬繁殖性能的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上,本文獲得了大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子全序列,發(fā)現(xiàn)了大量的順式作用元件,鑒定到1個(gè)新的小插入/缺失突變(g.8666_8667delAC),其多態(tài)性與大白豬繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián),證實(shí)TGF-β1基因是影響大白豬繁殖性狀的關(guān)鍵基因,其中del/del基因型是TNB的有利基因型,ins/del基因型母豬的NSB較高。另外,本文還證實(shí)第4內(nèi)含子的g.8666_8667delAC位點(diǎn)突變不是通過(guò)影響豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因的選擇性剪接來(lái)影響繁殖性狀的。