吳佳慶,李潤林,李盼盼,雷銘康,楊雅杰,汪晶,朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心/動物科學類國家級實驗示范中心,江蘇 南京 210095)

腸道屏障是機體抵御病原體入侵的第一道屏障,并且是影響腸道健康的關鍵因素。腸黏膜的物理屏障、化學屏障、微生物屏障及免疫屏障這四大屏障的有機結合,可以發(fā)揮對營養(yǎng)素的選擇性吸收、防御病原微生物入侵等作用[1]。其中,微生物屏障功能在維持腸道健康中發(fā)揮重要作用:一方面腸道微生物通過上調腸黏膜緊密連接基因mRNA的相對表達量,促進杯狀細胞分化,提高黏蛋白分泌,增強腸道屏障功能[2-3];另一方面腸道微生物代謝碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)等物質,能促進腸上皮細胞的能量吸收,并可以降低腸道pH值,從而抑制致病菌的生長。所以,一旦腸道菌群結構失衡,大量致病菌會在腸道內定殖,從而引發(fā)腸道炎癥等疾病[4]。盲腸是腸道中細菌密度最高、種類最豐富的區(qū)域,也是微生物發(fā)酵碳水化合物的重要場所[5-6]。

植物提取物是從植物中提取出來的天然活性物質,綠色無污染,具有多種益生作用,如緩解炎癥反應,調節(jié)腸道菌群平衡等[7]。目前,單一植物提取物添加量大、效果單一的缺點使得復合植物提取物的開發(fā)利用越來越受到關注[8]。百里香酚(thymol)是百里香油和牛至油的主要組成成分,其可以促進仔豬腸道消化吸收,改善腸道菌群[9]。還有研究發(fā)現(xiàn),迷迭香中的迷迭香酸(rosmarinic acid)等酚酸類物質,具有抗氧化、抗菌、抗炎等藥理作用[10],還能顯著抑制二甲苯誘導的耳殼腫脹小鼠毛細血管的通透性,并降低血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、C型反應性蛋白(CRP)的產(chǎn)生[11]。近年來,關于百里香酚和迷迭香酸緩解炎癥反應,改善腸道健康等方面的研究報道較多[12-16],但未見關于這2種植物提取物組合使用的研究報道,且本實驗室前期體外研究發(fā)現(xiàn)百里香酚和迷迭香酸兩者組合具有協(xié)同抑菌和抗氧化的作用。因此,我們推測百里香酚和迷迭香酸組合可以通過提高腸道屏障功能、調節(jié)腸道菌群結構以及緩解炎癥反應來改善動物腸道健康。因此,本試驗擬通過脂多糖(LPS)誘導的大鼠腸道炎癥模型,研究百里香酚和迷迭香酸組合對大鼠盲腸屏障功能、菌群結構及炎癥反應的影響,為其在緩解腸道炎癥反應,改善動物腸道健康等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年12月至2020年7月在南京農(nóng)業(yè)大學實驗動物房完成。試驗用無特定病原菌(SPF)Sprague-Dawley(SD)大鼠購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心;LPS購自上海生工生物工程有限公司;試驗用百里香酚和迷迭香酸(純度≥98%)購自百靈威公司。

1.2 試驗動物與試驗設計

試驗選取40只初始體重為(54.86±2.26)g的21日齡SD大鼠,在適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為5組:空白對照組(Con)、攻毒對照組(LPS)、百里香酚組(Thy)、迷迭香酸組(RosA)、百里香酚×迷迭香酸組(Thy × RosA)。每組8只,公母各半。Thy組、RosA組和Thy × RosA組每天分別按照20 mg·kg-1Thy、20 mg·kg-1RosA、20 mg·kg-1Thy × RosA(1∶1)的劑量對大鼠進行灌胃操作,Con組和LPS組每天灌胃等量生理鹽水。正式試驗期共14 d。在正式試驗第13 天,除Con組外,對LPS組、Thy組、RosA組和Thy × RosA組大鼠腹腔注射500 μg·kg-1的LPS溶液建立急性腸道炎癥模型,Con組注射等量生理鹽水。在第14天將大鼠處死,采集盲腸中段組織、黏膜及食糜樣品。試驗期間大鼠自由采食和飲水,按照常規(guī)免疫、消毒程序飼養(yǎng)管理。大鼠飼料購自南京青龍山動物繁殖場。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 盲腸組織形態(tài)結構的觀察將采集的盲腸組織置于4%(體積分數(shù))多聚甲醛溶液中固定。參照常規(guī)方法制作石蠟切片并進行蘇木精-伊紅(HE)染色。利用虛擬顯微鏡(Simon-01)觀察腸道切片的形態(tài)結構。

1.3.2 盲腸黏膜相關因子濃度的測定稱取0.1 g左右的盲腸黏膜加到勻漿介質試劑中制備成10%的勻漿液,于4 ℃、3 000 r·min-1條件下離心15 min,收集上清液。采用蛋白質定量檢測試劑盒(南京建成)的BCA法測定總蛋白濃度后用ELISA試劑盒(南京建成)測定盲腸黏膜上清液中白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的濃度。

1.3.3 盲腸黏膜緊密連接相關基因mRNA的表達參照Chomczynski等[17]的方法提取盲腸黏膜總RNA,反轉錄體系和反應程序參照試劑盒(TaKaRa)說明書。以β-actin作為內參基因進行相關基因的實時熒光定量PCR(qPCR)分析。反應體系和反應程序參照SYBRPremixExTaq試劑盒(TaKaRa)說明書。引物序列如表1所示。計算盲腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin基因mRNA的相對表達量。

表1 PCR所用引物序列

1.3.4 盲腸食糜中菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的測定稱取0.3 g左右的盲腸食糜于1.5 mL離心管中,加入1.2 mL雙蒸水混勻。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。取上清液0.8 mL,加入 0.16 mL 25%偏磷酸巴豆酸混合溶液,-20 ℃保存過夜。用進樣針取0.1 μL上清液,瞬時注入氣相色譜儀(日本島津GC-14B型)中,氣相色譜儀參數(shù)設置參照Mao等[18]的方法:毛細管色譜柱柱長30 m、內徑0.32 mm、膜厚0.25 μm(美國Sigma-Aldrich),柱溫135 ℃,氫火焰離子檢測器溫度200 ℃,載氣為氮氣,壓力60 kPa,氧氣和氫氣壓力均為50 kPa。

1.3.5 盲腸菌群的高通量測序參考Wang等[19]的方法,提取和純化盲腸食糜總DNA后,使用微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度,并將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到500 ng·mL-1。以稀釋后的DNA為模板,以前端引物序列319F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和后端序列806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)的特異引物,對盲腸菌群16S rRNA基因的V3—V4區(qū)進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物用20 g·L-1瓊脂糖凝膠進行電泳檢測;使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(美國Axygen生物科技公司)對PCR產(chǎn)物進行純化處理。最后,在Illumina MiSeq平臺上對PCR產(chǎn)物進行末端配對測序。每組8個生物學重復。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 脂多糖(LPS)攻毒對大鼠盲腸形態(tài)結構的影響

由HE染色的組織切片(圖1)觀察發(fā)現(xiàn):Con組大鼠盲腸組織結構完整,形態(tài)正常,無明顯病變;LPS組大鼠盲腸結構損傷嚴重,出現(xiàn)炎性細胞浸潤,黏膜層水腫等情況。Thy組、RosA組和Thy × RosA組大鼠盲腸形態(tài)結構完整,絨毛排列整齊,無明顯病變。

圖1 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸形態(tài)結構的影響

2.2 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸菌群結構及代謝產(chǎn)物的影響

2.2.1 對盲腸食糜微生物多樣性的影響α多樣性通常用來描述微生物群落的多樣性和豐富度。使用辛普森(Simpson)指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon)來表示菌群多樣性,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表菌群豐富度。α多樣性試驗結果(表2)表明:LPS組、Thy組、RosA組、Thy × RosA組盲腸菌群α多樣性無顯著差異(P>0.05)。層次聚類樹可對不同層次的群落進行劃分,從而形成聚類結構,而主坐標分析(PCoA)用于研究樣本間距離的相似性。基于OTU水平的層次聚類樹(圖2-A)和PCoA分析(圖2-B)結果表明,4組間盲腸微生物菌群顯著分開,并且組間具有顯著差異(R2=0.538 1,P=0.001)。

表2 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸食糜微生物α多樣性指數(shù)的影響

圖2 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸菌群β多樣性指數(shù)層次聚類樹(A)和主坐標分析(PCoA,B)的影響

2.2.2 對盲腸食糜菌群結構的影響盲腸菌群在門水平上相對豐度結果(圖3-A)表明:厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)為4組間盲腸菌群的優(yōu)勢菌門。與LPS組相比,厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度在Thy組、RosA組和Thy × RosA組中顯著增加(P<0.05),擬桿菌門(Bacteroidota)豐度顯著降低(P<0.05)(圖3-B)。

圖3 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸微生物門水平菌群組成(A)和菌群變化(B)的影響

屬水平上豐度>1%的菌屬中(圖4-A),未定義的鼠桿菌科、乳酸桿菌屬、毛螺菌科NK4A136組、阿克曼菌屬和Romboutsia為4組的優(yōu)勢菌屬。與LPS組相比,乳酸桿菌、Turicibacter和致狹窄梭狀芽胞桿菌1的相對豐度在RosA組和Thy × RosA組中顯著增加(P<0.05),Romboutsia在Thy × RosA組中顯著增加(P<0.05)。與LPS組相比,未定義的鼠桿菌科、未分類的毛螺菌科、羅斯氏菌屬、Alistipes的豐度在Thy × RosA組中顯著降低(P<0.05)(圖4-B)。

圖4 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸微生物屬水平菌群組成(A)和菌群變化(B)的影響

2.2.3 對盲腸食糜短鏈脂肪酸濃度的影響對短鏈脂肪酸濃度的測定結果(表3)表明:Thy × RosA組盲腸中乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸濃度顯著高于Con組、LPS組、Thy組和RosA組,丙酸濃度顯著高于Con組、LPS組和RosA組(P<0.05)。

表3 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸食糜短鏈脂肪酸濃度的影響

2.3 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸屏障功能的影響

2.3.1 LPS攻毒對大鼠盲腸D-乳酸含量和二胺氧化酶活性的影響由圖5可知:與Con組相比,LPS攻毒顯著降低了盲腸D-乳酸含量(P<0.05)。與LPS組相比,Thy組、RosA組和Thy × RosA組中D-乳酸含量顯著升高(P<0.05),二胺氧化酶活性在RosA組和Thy × RosA組中顯著升高(P<0.05)。

圖5 LPS攻毒對大鼠盲腸D-乳酸含量和二胺氧化酶(DAO)活性的影響

2.3.2 對盲腸緊密連接相關基因mRNA表達的影響由圖6可知:與LPS組相比,ZO-1、Occludin、Claudin-1基因mRNA表達量在Thy × RosA組中顯著增加(P<0.05),且Thy × RosA組的ZO-1和OccludinmRNA表達量顯著高于RosA組,Claudin-1mRNA表達量顯著高于Thy組和RosA組(P<0.05)。

圖6 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸緊密連接基因mRNA相對表達量的影響

2.4 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸炎癥因子IL-1β、 IL-6、TNF-α和IL-10水平的影響

由圖7可知:與LPS組相比,IL-1β水平在Thy組、RosA組和Thy × RosA組中顯著降低(P<0.05),IL-6水平在RosA組和Thy × RosA組中顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比,Thy × RosA組中TNF-α水平呈下降趨勢(P=0.084),IL-10水平呈上升趨勢(P=0.082)。

圖7 百里香酚和迷迭香酸對大鼠盲腸炎癥因子水平的影響

3 討論

目前,利用脂多糖(LPS)攻毒大鼠建立急性腸道炎癥模型來探究藥物的抗炎效果和作用機制逐漸成為研究炎癥的常用方法。研究表明,LPS刺激會導致腸道功能紊亂,腸道屏障功能受損,進而使病原體等有害物質移位到血流中,并誘導炎癥因子產(chǎn)生,從而引發(fā)炎癥反應[7]。因此,LPS經(jīng)常被用作誘導炎癥反應的物質[20]。據(jù)報道,小鼠腹腔注射10 mg·kg-1LPS溶液后狀態(tài)萎靡不振,且肝臟組織切片出現(xiàn)炎性病理變化[20],本研究結果與之相一致。本試驗選用500 μg·kg-1LPS攻毒斷奶大鼠來建立炎癥反應模型,結果發(fā)現(xiàn),LPS組大鼠腹腔注射LPS后出現(xiàn)戰(zhàn)栗、顫抖、呼吸急促、精神萎靡不振等癥狀,并且,HE染色結果顯示,LPS攻毒使大鼠盲腸形態(tài)結構出現(xiàn)了明顯的炎性病理變化。以上結果說明腹腔注射500 μg·kg-1LPS使大鼠出現(xiàn)了炎癥反應。

越來越多的研究表明,維持腸道菌群的動態(tài)平衡在緩解炎癥反應,改善動物腸道健康方面發(fā)揮重要作用。在生物統(tǒng)計學中,α多樣性和β多樣性通常用來分析微生物群落的組成和豐度。在本試驗中,微生物多樣性的結果表明,LPS組、Thy組、RosA組和Thy × RosA組4組間盲腸菌群α多樣性無顯著變化,但β多樣性的結果顯示,4組微生物菌群顯著分離,表明4組間盲腸菌群組成具有顯著差異。

盲腸菌群門水平相對豐度的結果表明,與LPS組相比,厚壁菌門的相對豐度在Thy組、RosA組和Thy × RosA組中顯著升高,擬桿菌門的相對豐度顯著降低。研究證實,厚壁菌門與纖維素的降解和抗炎作用有關[21],而擬桿菌門屬于革蘭氏陰性菌,在一定條件下(腸道屏障受損、菌群結構失衡、機體抵抗力下降等)有可能成為條件致病菌[22]。在屬水平上,與LPS組相比,乳酸桿菌、Romboutsia、Turicibacter和致狹窄梭狀芽胞桿菌1的相對豐度在Thy × RosA組中顯著增加,未定義的鼠桿菌科、未分類的毛螺菌科、羅斯氏菌屬、Alistipes的豐度顯著降低。乳酸桿菌、Romboutsia、Turicibacter和致狹窄梭狀芽胞桿菌1等通常被認為是有益于腸道健康的潛在益生菌[23-25]。例如,乳酸桿菌具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境,增強腸道屏障功能和提高機體免疫力的作用[26]。有研究發(fā)現(xiàn),運動和維生素C攝入的大鼠腸道中短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌Romboutsia和Turicibacter的相對豐度顯著上調[27],致狹窄梭狀芽胞桿菌1的代謝產(chǎn)物以短鏈脂肪酸為主[23]。而Alistipes在先天性免疫防御機制缺失的大鼠菌群中顯著富集[28],且與炎癥及代謝相關基因的表達顯著相關[29]。與LPS組相比,未定義的鼠桿菌科、未分類的毛螺菌科和羅斯氏菌屬的相對豐度在Thy × RosA組顯著降低,可能是由于乳酸桿菌、Romboutsia和Turicibacter所占比例較高,導致其相對豐度降低。門水平和屬水平相對豐度的結果表明百里香酚和迷迭香酸組合顯著增加盲腸食糜中乳酸桿菌和Romboutsia等潛在益生菌的相對豐度,降低Alistipes機會致病菌的相對豐度,優(yōu)化了盲腸菌群結構。

腸道菌群可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物,如短鏈脂肪酸等物質,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,它們有可緩解腸道炎癥反應,促進腸上皮細胞的能量吸收和維持腸道微生態(tài)平衡的作用[30]。本研究中,與LPS組相比,乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸濃度在Thy組、RosA組和Thy × RosA組中顯著升高,且在Thy × RosA組中濃度高于或顯著高于Thy組和RosA組。這可能與高通量測序結果中盲腸乳酸桿菌、Romboutsia、Turicibacter和致狹窄梭狀芽胞桿菌1在Thy × RosA組的相對豐度增加有關,而乳酸桿菌、Romboutsia、Turicibacter和致狹窄梭狀芽胞桿菌1均與碳水化合物的代謝、短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有關[23-25]。表明百里香酚和迷迭香酸組合可顯著提高大鼠盲腸食糜短鏈脂肪酸的濃度,且濃度高于Thy組和RosA組。

大量研究表明,某些益生菌(如乳酸桿菌和雙歧桿菌)的定殖會導致短鏈脂肪酸濃度的升高,有助于緩解腸道炎癥反應,提高腸道黏膜的屏障功能,抵御病原體的入侵[31-32]。腸道菌群自身構成的微生物屏障作為腸道屏障功能的4大屏障之一,對腸道的健康發(fā)揮重要作用。腸道中D-乳酸含量和DAO活性的降低標志腸道通透性增加,腸黏膜屏障功能受損[33]。本研究中,與Con組相比,LPS組D-乳酸含量顯著降低,表明LPS攻毒使大鼠腸道通透性增加,屏障功能受損。與LPS組相比,D-乳酸含量和DAO活性在Thy × RosA組中顯著升高,表明百里香酚和迷迭香酸組合能夠緩解LPS攻毒引起的腸黏膜損傷,降低腸道通透性,增強腸道屏障功能。緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1常作為檢驗腸道緊密連接功能的重要指標。ZO-1、Occludin、Claudin-1可調節(jié)上皮屏障,保護腸道黏膜的完整性,阻止腸道中病原體和有害物質向細胞膜內轉移和侵襲[34-35]。本研究中,與LPS組相比,ZO-1、Occludin、Claudin-1基因mRNA表達量在Thy × RosA組顯著提高,且在Thy × RosA組表達量高于或顯著高于Thy組和RosA組。此結果表明百里香酚和迷迭香酸組合可顯著提高大鼠盲腸黏膜的緊密連接功能,且百里香酚和迷迭香酸組合的緊密連接功能優(yōu)于Thy組和RosA組。

腸道內炎癥因子水平可反映腸道的免疫狀態(tài)。促炎因子和抑炎因子在腸道炎癥和免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。IL-1β作為重要的促炎因子,可參與機體的免疫反應和信號傳導,被認為是炎癥反應的啟動劑[35-36]。IL-6由2型輔助(Th2)細胞分泌,可調節(jié)先天性和獲得性免疫[37]。TNF-α是一種高度促炎性的細胞因子,可促進白細胞向感染部位募集以及內皮細胞的活化[38-39]。IL-10由適應性免疫細胞分泌,具有免疫調節(jié)作用[40]。本研究中,與LPS組相比,百里香酚和迷迭香酸組合顯著降低了促炎因子IL-1β和 IL-6 水平,且有降低促炎因子TNF-α水平,提高抑炎因子IL-10水平的趨勢。因此,以上結果表明百里香酚和迷迭香酸組合通過抑制炎癥因子的分泌來緩解盲腸的炎癥反應。這可能與百里香酚和迷迭香酸的藥理作用和對腸道菌群結構的調節(jié)有關。有研究表明,百里香酚可以通過阻斷細胞中IκBα、NF-κBp65、細胞外信號激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化,從而抑制Toll樣4受體(TLR-4)介導的NF-κB通路的表達來發(fā)揮抗炎作用[41]。迷迭香酸的抗炎作用可能與抑制ERK、JNK、NF-κB等通路的激活有關[42]。此外,百里香酚和迷迭香酸也能通過調節(jié)盲腸的菌群結構,協(xié)助潛在益生菌(乳酸桿菌、Romboutsia等)的定殖和促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生來抵御病原微生物的入侵,提高機體免疫力,緩解盲腸的炎癥反應。

綜上所述,百里香酚和迷迭香酸組合增加了盲腸中乳酸桿菌、Romboutsia和Turicibacter等細菌的相對豐度,降低了Alistipes的相對豐度,提高了代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的濃度。此外,百里香酚和迷迭香酸組合能通過降低腸道通透性,提高盲腸黏膜的緊密連接基因的mRNA相對表達量來提高腸道屏障功能,并有助于緩解腸道炎癥反應,且效果優(yōu)于單一添加的百里香酚組或迷迭香酸組。