張志凌,王凱,張茹,徐晴玉,羅光華*,方繼朝

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地),江蘇 南京210014;3.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

Halloween家族基因參與昆蟲(chóng)蛻皮激素合成,昆蟲(chóng)蛻皮激素/蛻皮酮(ecdysone,E)是其生命過(guò)程中的重要激素之一,其發(fā)揮功能的活化形式是20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)。20E參與昆蟲(chóng)的蛻皮、化蛹變態(tài)發(fā)育、成蟲(chóng)羽化和生殖等生命過(guò)程,當(dāng)蛻皮激素滴度水平異常時(shí),昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)出現(xiàn)異常[1-3]。Peng等[4]對(duì)小菜蛾(Plutellaxylostella)的研究顯示,Halloween家族基因Cyp314a1被干擾后,試蟲(chóng)體內(nèi)的20E滴度顯著降低,個(gè)體發(fā)育歷期延長(zhǎng)、化蛹率降低;個(gè)體的卵黃原蛋白和卵黃原蛋白受體基因表達(dá)顯著降低,產(chǎn)卵量也顯著減少。赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)的Cyp314a1基因被干擾后,卵黃原蛋白基因表達(dá)量顯著降低[5]。果蠅(Drosophilamelanogaster)和家蠶(Bombyxmori)的蛻皮激素合成基因Cyp306a1被干擾或突變后,試蟲(chóng)體內(nèi)20E的滴度顯著降低并且變態(tài)發(fā)育異常[6-7]。

昆蟲(chóng)蛻皮激素是其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要激素之一,合成蛻皮激素的一系列基因統(tǒng)稱為Halloween家族基因。蛻皮激素由Halloween家族基因利用昆蟲(chóng)從食物中獲取的植物甾醇或動(dòng)物膽固醇來(lái)合成[8-9]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Halloween家族基因有:spook(Spo,Cyp307a1)、phantom(Phm,Cyp306a1)、disembodied(Did,Cyp302a1)、shadow(Sad,Cyp315a1)和shade(Shd,Cyp314a1)等。Cyp307a1參與7-脫氫膽固醇(7-dehydro cholesterol)至三脫氧蛻皮酮(2,22,25-trideoxyecdysone)的合成,Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1協(xié)同將三脫氧蛻皮酮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的蛻皮酮/蛻皮激素(E),以上過(guò)程在昆蟲(chóng)前胸腺細(xì)胞中完成;蛻皮酮(E)釋放至血淋巴中,Cyp314a1將無(wú)活性的蛻皮酮(E)催化形成具有生物學(xué)功能的20-羥基蛻皮酮(20E),該過(guò)程在昆蟲(chóng)周緣組織中完成[10-11]。其中,7-脫氫膽固醇至三脫氧蛻皮酮的具體催化合成過(guò)程并沒(méi)有完全明確,有待深入研究。

二化螟(Chilosuppressalis)是水稻上的常發(fā)性重大害蟲(chóng),由于其鉆蛀性為害,很難有效防控,并且其已對(duì)多種藥劑產(chǎn)生高水平抗性[12-14]。從生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控角度出發(fā),研發(fā)新的二化螟防控藥劑以及探尋新的防控策略,對(duì)于二化螟的有效防控具有現(xiàn)實(shí)意義。目前,二化螟Halloween家族基因的研究尚不全面,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因檢索,發(fā)現(xiàn)二化螟Halloween家族基因中Cyp302a1和Cyp315a1在數(shù)據(jù)庫(kù)中尚沒(méi)有完整的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)序列。同時(shí),二化螟Halloween家族基因5個(gè)成員的時(shí)空表達(dá)譜未見(jiàn)詳細(xì)研究,功能研究方面也未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)Cyp302a1和Cyp315a1基因進(jìn)行了完整轉(zhuǎn)錄本序列的克隆,并且分析了二化螟Halloween家族5個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)譜特征,為后續(xù)深入研究Halloween家族基因的功能及二化螟生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

二化螟試蟲(chóng)是在室內(nèi)利用人工飼料[15-16]連續(xù)傳代飼養(yǎng)多年的品系。飼養(yǎng)條件:溫度(28±1)℃,相對(duì)濕度70%～80%,光/暗培養(yǎng)時(shí)間為16 h/8 h。

1.2 樣本收集

利用12孔板單頭飼養(yǎng)二化螟試蟲(chóng),從初孵幼蟲(chóng)開(kāi)始,收集每個(gè)齡期的每個(gè)日齡1次樣本。初孵至 3齡,由于個(gè)體小,收集的是群體樣本(15～30頭);從4齡開(kāi)始,收集單頭樣本。每個(gè)收樣節(jié)點(diǎn)收集3組樣本,作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。此外,在冰上解剖二化螟5齡幼蟲(chóng)60頭,分別收集頭、中腸、表皮、脂肪體樣本。每份組織樣本收集3組,作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有樣本經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)總RNA的提取。

1.3 總RNA提取與cDNA模板制備

利用Promega公司的總RNA提取試劑盒(SV Total RNA Isolation System Kit)分別提取各樣本的總RNA。提取方法根據(jù)試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行。提取完成后利用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,并利用Nano-Drop 1000分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。

總RNA經(jīng)檢驗(yàn)合格后,進(jìn)行cDNA模板第1鏈合成。采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行cDNA第1鏈合成,具體操作方法依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA模板于-20 ℃冰箱保存,用于反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的擴(kuò)增。利用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)制備用于時(shí)空表達(dá)模式分析的cDNA模板。具體操作方法依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,模板制備完成后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因克隆

基于二化螟Cyp302a1和Cyp315a1基因已知的核酸序列片段,分別設(shè)計(jì)用于5′和3′的cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)的特異引物(表1)。RACE擴(kuò)增利用Clontech公司的RACE試劑盒參照說(shuō)明書進(jìn)行操作。以二化螟各齡期幼蟲(chóng)的混合總RNA為模板制備RACE模板,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究所用引物

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),將潛在目標(biāo)產(chǎn)物條帶切膠回收后連接到T3(pEASY-T3 Cloning Kit,北京全式金生物技術(shù)有限公司)克隆載體上,再轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,隨機(jī)挑選6個(gè)單克隆,經(jīng)LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)并進(jìn)行菌液檢測(cè)確認(rèn)后,送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

通過(guò)RACE擴(kuò)增分別獲得目標(biāo)基因完整轉(zhuǎn)錄本的5′端和3′端序列,經(jīng)過(guò)拼接后再設(shè)計(jì)每條基因完整轉(zhuǎn)錄本的End-to-End擴(kuò)增引物(表1)。所用擴(kuò)增酶為TaKaRa公司的LATaq酶(Premix Taq LATaqVersion 2.0 plus dye),50 μL擴(kuò)增體系,具體操作方法按照說(shuō)明書。所有目標(biāo)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 序列分析

測(cè)序結(jié)果利用GeneDoc 2007軟件(http://www.nrbsc.org/downloads/)進(jìn)行序列比對(duì)。利用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析目標(biāo)序列的ORF框,同時(shí)獲得對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。利用NCBI網(wǎng)站上的在線軟件CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對(duì)氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與GenBank中的nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索?；讷@得的不同物種的同源基因氨基酸序列利用MEGA 7.0軟件[17]構(gòu)建分子進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),構(gòu)建方法為最大似然法(maximum likelihood method,ML),各分支 bootstrap 值設(shè)定為1 000。

1.6 二化螟Halloween家族基因時(shí)空表達(dá)模式分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)二化螟Halloween家族基因在二化螟不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)水平。RT-qPCR采用TaKaRa公司的TB Green Premix ExTaqⅡ試劑盒(Tli RNaseH Plus),按照操作說(shuō)明書進(jìn)行,擴(kuò)增體系為20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)檠由煲蜃?EF1α),引物序列見(jiàn)表1。目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔCT法計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

基因表達(dá)量顯著性差異統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA);在假定方差齊性參數(shù)條件下利用LSD法進(jìn)行多重比較差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二化螟2個(gè)Halloween家族基因的序列及特征

基于二化螟基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆獲得二化螟Halloween家族基因的Cyp302a1(disembodied,Did)和Cyp315a1(shadow,Sad)基因完整轉(zhuǎn)錄本序列。二化螟的Cyp302a1完整轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)1 707 bp,5′端有62 bp非編碼區(qū)(untranslated region,UTR);3′端有52 bp的UTR,其中polyA尾含26個(gè)A堿基;含1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),長(zhǎng)1 593 bp,編碼530個(gè)氨基酸,命名為CsCyp302a1(GenBank登錄號(hào):MZ848381)。二化螟的Cyp315a1完整轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)1 659 bp,5′端UTR長(zhǎng)115 bp;3′端UTR長(zhǎng)71 bp,polyA尾含32個(gè)A堿基;含1個(gè)ORF,長(zhǎng)1 473 bp,編碼490個(gè)氨基酸,命名為CsCyp315a1(GenBank登錄號(hào):MZ848382)。

多重序列比對(duì)分析表明,CsCyp302a1氨基酸序列與煙草天蛾(Manducasexta)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和家蠶(Bombyxmori)的Cyp302a1氨基酸序列相似性均在75%以上。CsCyp315a1氨基酸序列與亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、煙草天蛾、家蠶和大蠟螟(Galleriamellonella)的Cyp315a1氨基酸序列相似性均在75%以上。CsCyp302a1和CsCyp315a1與其他昆蟲(chóng)相應(yīng)的家族成員基因一樣,均具有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和PFxxGxRxCxG/A(heme-binding domain),其中“x”代表任意氨基酸,表明CsCyp302a1和CsCyp315a1都是典型的線粒體酶(圖1、2)。

圖1 二化螟Cyp302a1及其他昆蟲(chóng)氨基酸同源序列多重比對(duì)

基于氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析顯示:對(duì)于Cyp302a1,二化螟與大蠟螟、煙草天蛾以及家蠶在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中關(guān)系較近,聚為一支;二化螟Cyp315a1與亞洲玉米螟、煙草天蛾、家蠶以及大蠟螟的在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中關(guān)系近并聚為一支。二化螟Halloween家族基因成員,在系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析中均與其他昆蟲(chóng)相應(yīng)的同源序列聚在一起,進(jìn)一步證明本研究所克隆的基因?qū)儆贖alloween家族基因?qū)?yīng)的家族成員。表明昆蟲(chóng)Halloween家族基因各成員在不同昆蟲(chóng)體內(nèi)都有較高的保守性,各個(gè)基因均各自聚成一簇(圖3)。

2.2 二化螟5個(gè)Halloween家族基因時(shí)空表達(dá)模式

二化螟不同發(fā)育階段的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示,Halloween家族基因成員的表達(dá)都有各自的特點(diǎn)(圖4)。5個(gè)基因都在5齡階段處于高水平表達(dá)狀態(tài),但不同基因在5齡不同日齡時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平。在5齡階段從低日齡到高日齡,Cyp307a1基因表達(dá)量逐漸上升;Cyp306a1基因表達(dá)量逐漸下降;Cyp302a1基因表達(dá)量先下降再上升然后再下降,中間階段處于最高水平;Cyp315a1基因表達(dá)量在末日齡快速上升;Cyp314a1基因表達(dá)量前期總體低于后期。

二化螟5個(gè)Halloween家族基因全生育期的總體相對(duì)表達(dá)水平:Cyp307a1基因的相對(duì)表達(dá)量在這 5個(gè)基因中最高,Cyp315a1基因的相對(duì)表達(dá)量在這5個(gè)基因中最低。每個(gè)基因的表達(dá)都呈現(xiàn)波動(dòng)狀,在二化螟各個(gè)齡期轉(zhuǎn)換前后節(jié)點(diǎn)處,Cyp307a1基因表達(dá)水平呈現(xiàn)升高狀態(tài),其他4個(gè)基因的表達(dá)水平無(wú)明顯的規(guī)律。Cyp306a1基因在1齡前期呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)狀態(tài)。Cyp314a1基因在2齡中后期與3齡前期呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)狀態(tài)(圖4)。

圖2 二化螟Cyp315a1及其他昆蟲(chóng)氨基酸同源序列多重比對(duì)

圖3 基于氨基酸序列構(gòu)建的昆蟲(chóng)Halloween分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(最大似然法)

圖4 二化螟Halloween家族基因不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式

二化螟5齡幼蟲(chóng)不同組織的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示,Halloween家族基因成員在4種不同組織中的表達(dá)有較大差異(圖5)。Cyp307a1基因在頭部的表達(dá)量最高,極顯著高于其他組織;Cyp306a1基因在中腸中的相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于其他組織;Cyp302a1在頭部和表皮中的表達(dá)量極顯著高于中腸和脂肪體組織;Cyp315a1在頭部和表皮中的表達(dá)量顯著高于中腸和脂肪體;Cyp314a1基因在脂肪體中的相對(duì)表達(dá)量與在表皮中的表達(dá)量無(wú)顯著差異,但顯著高于頭和中腸組織。

圖5 二化螟5齡幼蟲(chóng)Halloween家族基因在不同組織中的表達(dá)模式

3 討論

蛻皮激素是調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要激素之一,Halloween家族基因參與合成蛻皮激素從而調(diào)控昆蟲(chóng)發(fā)育、繁殖等重要生命過(guò)程[8-9,18]。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到二化螟蛻皮激素合成途徑Halloween家族基因的CsCyp302a1和CsCyp315a1完整轉(zhuǎn)錄本序列。各基因與各個(gè)家族成員都有較高的序列相似性?；诎被嵝蛄械耐椿蚨嘀乇葘?duì)以及分子系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析結(jié)果顯示,CsCyp302a1和CsCyp315a1分別與各自的Halloween家族基因成員聚為一支,表明本研究所克隆的基因是二化螟的Halloween家族基因成員。昆蟲(chóng)體內(nèi)Halloween家族基因的研究比較廣泛,果蠅、煙草天蛾、家蠶等均有研究報(bào)道,序列比對(duì)分析顯示不同物種的同源基因均有很高的保守性[8-9,19-20]。Halloween家族基因成員在序列結(jié)構(gòu)上的保守性,表明該類基因在進(jìn)化過(guò)程中的生物學(xué)功能較為保守,也暗示不同昆蟲(chóng)的蛻皮激素合成與調(diào)控機(jī)制具有較大的相似性[6,8,21]。

對(duì)昆蟲(chóng)Halloween家族基因不同發(fā)育階段表達(dá)模式的研究,鮮有從昆蟲(chóng)個(gè)體初孵至蛹的全發(fā)育過(guò)程檢測(cè)分析。本研究檢測(cè)了二化螟Halloween家族基因的5個(gè)主要成員從初孵至蛹的基因表達(dá)水平,結(jié)果顯示各基因的表達(dá)伴隨著不同齡期的蛻皮過(guò)程呈波動(dòng)狀態(tài),但無(wú)明顯的周期規(guī)律性,這與其他昆蟲(chóng)中的研究有相似之處但也存在差異[4,9,12,18]。白背飛虱(Sogatellafurcifera)從2齡至4齡伴隨個(gè)體蛻皮,spook(Cyp307a1)基因表達(dá)水平呈明顯的周期性變化[22]。煙草天蛾末齡階段的不同發(fā)育日齡,Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1基因的表達(dá)在前期和后期均出現(xiàn)2個(gè)峰[23],二化螟這4個(gè)基因的表達(dá)在末齡不同日齡無(wú)此現(xiàn)象,表明不同昆蟲(chóng)之間Halloween家族基因的表達(dá)模式存在差異。褐飛虱(N.lugens)和?；页嵋苟?Spodopteralittoralis)Halloween家族基因在幼蟲(chóng)末齡階段的表達(dá)變化趨勢(shì)與其體內(nèi)的蛻皮激素滴度變化趨勢(shì)相適應(yīng)[18-19]。二化螟體內(nèi)蛻皮激素的滴度動(dòng)態(tài)變化未有詳細(xì)研究,可以推測(cè)二化螟Halloween家族基因的表達(dá)變化也應(yīng)當(dāng)與其體內(nèi)的蛻皮激素滴度變化相匹配,相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。

蛻皮激素還參與昆蟲(chóng)的生殖等重要生命過(guò)程[4,8,24-26]。昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)末齡是由幼蟲(chóng)階段向蛹或成蟲(chóng)階段轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)期,這期間涉及個(gè)體生殖相關(guān)的細(xì)胞、組織等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[4,24-25]。二化螟Halloween家族基因在末齡階段的表達(dá)均有一個(gè)顯著上升的過(guò)程,并且比其他幼蟲(chóng)齡期的總體表達(dá)水平都高。由此推測(cè),末齡階段蛻皮激素除了需要保障個(gè)體的正?；夹枨笸?還需要滿足個(gè)體的生殖發(fā)育需求,相關(guān)研究結(jié)果在多種昆蟲(chóng)中已有報(bào)道。黑腹果蠅在末齡進(jìn)入預(yù)蛹之前,蛻皮激素滴度呈現(xiàn)急速升高的狀態(tài)且顯著高于其他幼蟲(chóng)階段,但與卵期的滴度水平相當(dāng)[27]。在沙漠飛蝗、煙草天蛾、赤擬谷盜幼蟲(chóng)末齡后期體內(nèi)蛻皮激素滴度均出現(xiàn)快速升高的狀態(tài)[9,28-30]。Halloween家族基因被干擾后卵黃原蛋白和卵黃原蛋白受體基因表達(dá)量顯著降低,生殖細(xì)胞發(fā)育異常,產(chǎn)卵量明顯減少[4-5,9]。Halloween家族基因在二化螟生殖過(guò)程中的作用尚未有研究,本研究結(jié)果為進(jìn)一步在二化螟體內(nèi)開(kāi)展這方面的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

Halloween家族基因家族成員共同參與昆蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素的合成,各個(gè)基因在不同時(shí)期、不同組織的表達(dá)變化不完全協(xié)同一致。Rewitz等[23]對(duì)煙草天蛾的研究顯示,Cyp306a1在5齡中后期以及成蟲(chóng)初期的前胸腺內(nèi)表達(dá)水平較高,其他時(shí)期和其他組織中表達(dá)量均很低;Cyp302a1在5齡第7日齡和成蟲(chóng)第1日齡時(shí),在多種組織中均處于較高表達(dá)水平;Cyp315a1在5齡第3日齡時(shí),在前胸腺內(nèi)表達(dá)水平處于高位,但在其他時(shí)期和其他組織中均低水平表達(dá)[9]。研究表明,小菜蛾體內(nèi)的Cyp307a1、Cyp302a1和Cyp315a1在前胸腺中表達(dá)量均很高,但Cyp314a1在前胸腺中表達(dá)量卻很低;相反,Cyp314a1在脂肪體中表達(dá)量很高,而Cyp307a1、Cyp302a1和Cyp315a1在脂肪體中表達(dá)量均很低[4]。?；页嵋苟闟.littoralis與小菜蛾相似,海灰翅夜蛾的Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1在前胸腺中表達(dá)量也很高,但Cyp314a1在前胸腺中表達(dá)量很低[19]。本研究發(fā)現(xiàn)二化螟體內(nèi)Halloween家族基因成員在不同組織中的表達(dá)同樣存在較大差異,與其他昆蟲(chóng)的研究結(jié)果相似。蛻皮激素合成過(guò)程中,無(wú)活性的蛻皮酮(E)是在昆蟲(chóng)前胸腺內(nèi)由Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1合成[8-9],本研究顯示二化螟Cyp307a1、Cyp302a1和Cyp315a1基因在頭部(前胸腺所在位置)表達(dá)處于高水平狀態(tài),與已有研究結(jié)論一致;Cyp306a1基因在頭部的表達(dá)并不是處于高表達(dá)狀態(tài),反而是中腸組織中表達(dá)水平最高,這是否意味著Cyp306a1基因在中腸中還發(fā)揮其他生物學(xué)功能,有待進(jìn)一步研究。無(wú)活性的蛻皮酮(E)在周緣組織中由Cyp314a1基因?qū)⑵滢D(zhuǎn)變成有生物活性的20-羥基蛻皮酮(20E)[10-11],本研究中Cyp314a1基因在二化螟不同組織中表達(dá)水平差異較小,這與已有研究結(jié)論一致。此外,二化螟Cyp302a1和Cyp315a1基因在表皮中相對(duì)表達(dá)水平高,但Cyp307a1和Cyp316a1基因在表皮中相對(duì)表達(dá)水平低,這種表達(dá)差異進(jìn)一步表明,Halloween家族基因家族成員除了參與昆蟲(chóng)的蛻皮過(guò)程,還參與其他諸如生殖等生物學(xué)過(guò)程[4-5],而且在不同組織中發(fā)揮的作用也很可能存在差異,這些有待更深入的研究。本文的研究結(jié)果為深入開(kāi)展二化螟蛻皮激素功能的研究奠定了重要基礎(chǔ)。