周露,劉楊,崔群香,陳火英*

(1.金陵科技學院園藝園林學院,江蘇 南京 210038;2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院,上海 200240)

植物生長發(fā)育和各類代謝物的合成均受到各種逆境的影響,包括低溫、強光、干旱和高鹽等。植物常通過調(diào)節(jié)逆境響應基因的表達來適應這些逆境,其中低溫響應(cold responsive,COR)基因的啟動子上含有1個或多個CRT(C-repeat element)順式作用元件。在低溫環(huán)境下,AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子CBF(CRT binding factor)通過與CRT元件結(jié)合來激活COR基因的表達從而響應低溫[1]。過表達CBF基因可以在室溫環(huán)境下激活下游COR基因的表達并增加植株的抗寒性[1]。研究發(fā)現(xiàn)MYC型bHLH轉(zhuǎn)錄因子ICE1(inducer of CBF expression)可以調(diào)控CBF基因的表達[2]。常溫下,組成型表達的ICE1呈現(xiàn)鈍化狀態(tài),而當植株處于低溫時,ICE1則作為低溫馴化中主要的正調(diào)控因子激活CBF基因的表達[2-3]。在擬南芥中,AtICE1在低溫馴化過程中直接結(jié)合到AtCBF3啟動子的MYC識別位點(CANNTG)上,過表達AtICE1基因可以增加植株的抗寒性,而ice1突變體中CBF3和COR基因表達降低,且植株抗寒性和低溫馴化能力下降[4]。

花青素作為重要的類黃酮次生代謝產(chǎn)物,賦予植物豐富多彩的顏色。低溫、UVB輻射和水分脅迫等多種環(huán)境逆境可誘導花青素合成[5]。植物中的花青素由苯丙氨酸經(jīng)過一系列關鍵酶的催化反應合成。多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控關鍵酶基因的表達,其中研究最多的為MYB、bHLH和WD40類轉(zhuǎn)錄因子。除此以外,AP2/ERF、YABBY和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族也參與花青素的生物合成[6]。前期研究表明,茄子AP2/ERF類低溫響應因子SmCBF可以通過與花青素合成正調(diào)控因子SmMYB113互作來調(diào)控花青素的生物合成[7]。茄子SmYABBY則可以結(jié)合到SmTT8啟動子上,且參與非光敏茄子的花青素的積累[6]。在擬南芥中異源表達毛子草IaYABBY2基因可以增加逆境環(huán)境下植株的花青素含量[8]。過表達蘋果MdWRKY11可以增加蘋果愈傷組織中類黃酮和花青素的積累[9]。

茄子(Solanummelongena)為一種富含花青素的喜溫蔬菜,低溫是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因子,探究抗冷相關基因的功能不僅有助于闡明茄子抗冷機制,而且有利于解析果實色澤形成機制。在前期研究中,我們已經(jīng)從茄子中克隆了1個MYC型ICE1-like轉(zhuǎn)錄因子SmICE1a,并明確了其通過調(diào)控SmCBF的表達來影響植物的抗冷性[10]。本研究中,我們克隆獲得另一個ICE1-like轉(zhuǎn)錄因子SmICE1,并對其進行生物信息學、表達水平、亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄激活分析,同時利用轉(zhuǎn)基因株系進行功能驗證,通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗驗證其互作蛋白,旨在探究SmICE1在茄子低溫響應和花青素生物合成中的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為光敏型茄子品種‘藍山禾線’。將生長至4葉期的茄子植株放置于4 ℃光照培養(yǎng)箱中低溫處理24 h,于不同時間點選取植株葉片迅速放入液氮速凍,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1SmICE1的克隆與生物信息學分析按照植物RNA提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit,TaKaRa公司)說明書提取茄子RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa公司)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用茄子基因組數(shù)據(jù)庫(http://eggplant.kazusa.or.jp/)的BLASTp程序比對擬南芥AtICE1蛋白序列,找到同源性較高的茄子蛋白序列,進一步通過ORF Finder與其他ICE1蛋白進行比對來確認其編碼區(qū)的正確性。設計引物SmICE1-F/R(表1),以上述cDNA為模板使用高保真DNA聚合酶(TaKaRa公司)進行PCR擴增。使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并回收目的條帶,將其連接到pEasy-Blunt Simple(北京全式金生物技術有限公司)克隆載體上并測序。

表1 本研究所用引物

通過Prot Param tool(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)在線軟件分析SmICE1蛋白的相對分子質(zhì)量和理論等電點。采用Clustal W 1.7和GeneDoc 2.7.0軟件進行蛋白序列比對。采用Clustal W 1.7和MEGA 6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析。

1.2.2SmICE1的表達水平分析對生長至4葉期的茄子幼苗進行4 ℃低溫處理,分別在0、1、3、6、12和24 h時取樣,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以此為模板進行RT-qPCR分析。根據(jù)CDS序列,使用Premier Primer 5軟件設計定量引物SmICE1-Q-F/R(表1),并以茄子SmAPRT(JX448345)[11]為內(nèi)參基因。反應體系:cDNA模板100 ng,前、后引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL,TB Green酶(2×)10 μL,ddH2O補齊至20 μL。反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。通過2-ΔΔCT法計算相對于內(nèi)參的表達水平。將未處理條件下(即0 h)的表達值設為1,獲得相對于0 h的基因表達情況并繪圖。通過SPSS 17軟件中ANOVA方法的Duncan’s New Multiple Range test(Puncan)統(tǒng)計各個時間點的顯著性差異。

1.2.3 SmICE1蛋白的亞細胞定位分析使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SpeⅠ對含有YFP序列的PHB植物表達載體(PHB-YFP)進行線性化雙酶切。設計PHB-SmICE1-F/R引物(表1)擴增SmICE1。利用同源重組酶In-Fusion HD Cloning Plus(TaKaRa公司)將獲得的目的基因回收產(chǎn)物連接到線性化的載體上,構(gòu)建重組載體PHB-SmICE1-YFP。測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中,通過菌液PCR檢測獲得陽性克隆。將上述陽性農(nóng)桿菌接種在含50 mg·L-1Kan和25 mg·L-1Rif的LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床過夜培養(yǎng)至D600值為0.6～0.8后,離心后去上清液,使用含30 g·L-1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基(含200 μmol·L-1乙酰丁香酮和10 mmol·L-1MES)重懸使D600值達到0.8,室溫條件下靜置3 h后,使用1 mL無菌注射器吸取菌液將其從葉片背面注入煙草中。將注射后的煙草置于人工氣候室3 d后,收集葉片,利用激光掃描共焦顯微鏡(Leica TCS SP5-Ⅱ,Germany)檢測YFP蛋白的熒光信號。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄激活活性檢測利用同源重組酶將茄子SmICE1和擬南芥AtCBF1(陽性對照)全長片段連接到pGBKT7酵母表達載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒SmICE1-pGBKT7和AtCBF1-pGBKT7。將測序正確的重組質(zhì)粒與空載體質(zhì)粒pGBKT7分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中,涂布于SD/-Trp缺陷型培養(yǎng)基中。30 ℃培養(yǎng)3 d后,用無菌水重懸挑選的酵母菌株,接種并培養(yǎng)于含有或不含X-α-Gal的SD/-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基中,30 ℃倒置培養(yǎng)3 d后拍照記錄。

1.2.5 雙熒光素酶報告檢測試驗以上述獲得的PHB-SmICE1-YFP農(nóng)桿菌菌株為效應子,PHB-YFP農(nóng)桿菌為陰性對照。根據(jù)前期研究獲得的3個茄子SmCBF的啟動子序列[12],設計引物pGreen-SmCBF1pro-F/R、pGreen-SmCBF2pro-F/R、pGreen-SmCBF3pro-F/R(表1),利用同源重組酶分別將其構(gòu)建到線性化的pGreenII 0800-LUC載體上獲得3個報告載體(SmCBF1pro-LUC、SmCBF2pro-LUC和SmCBF3pro-LUC),隨后轉(zhuǎn)化GV3101(pSoup)農(nóng)桿菌菌株。根據(jù)上述煙草瞬時轉(zhuǎn)化法將效應子與報告載體農(nóng)桿菌組合注射入煙草葉片中。注射2 d后將部分煙草置于4 ℃環(huán)境下3 h[13],分別收集常溫和4 ℃處理的煙草葉片樣品,根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒的說明進行雙熒光素酶的測定。每個組合至少3次生物學重復,使用t-test分析0.01水平的顯著性差異(**P<0.01)。

1.2.6 在擬南芥中異源表達SmICE1基因?qū)⑸鲜霁@得的PHB-SmICE1-YFP農(nóng)桿菌按1∶100(體積比)接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Kan和25 mg·L-1Rif),28 ℃搖床過夜培養(yǎng)至D600值為0.6～0.8后,8 000 r·min-1離心5 min,棄上清液,使用轉(zhuǎn)化液重懸菌體并調(diào)D600值為0.8。將擬南芥花蕾浸入重懸液1 min,重復3次。侵染后置于人工氣候箱中黑暗過夜培養(yǎng),隨后進行正常光照培養(yǎng)直至其完全成熟后收種。將收獲的種子消毒后用無菌水沖洗4～5次,隨后將種子均勻平鋪于含有50 g·L-1蔗糖和50 mg·L-1潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上,4 ℃春化3 d。隨后置于正常光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后,挑選生長良好的轉(zhuǎn)基因植株移栽至土壤中。2周后提取DNA進行PCR鑒定,篩選陽性單株進行獨立編號并收種。篩選獲得 2個表達量高的T3家系進行后續(xù)研究,命名為L1和L2。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株耐寒性和生理指標測定將上述篩選出的轉(zhuǎn)基因家系種子播種于MS固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)1周后移栽至土壤中。移栽2周后取轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥各50株進行低溫處理(-6 ℃處理 8 h),隨后將其移入正常環(huán)境下生長1周,統(tǒng)計其存活率并拍照記錄[14]。3次生物學重復。

選取生長3周的轉(zhuǎn)基因和野生型植株置于0 ℃環(huán)境下2 d,分別于0、3、12、24和48 h取樣并測定電解質(zhì)滲透率(electrolyte leakage,EL)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、脯氨酸(proline,Pro)含量。其中MDA和Pro含量的測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒。選取0.2 g擬南芥植株置于離心管中,用ddH2O清洗4～5次后室溫下振蕩24 h,使用電導儀測定初始EL值(E1),121 ℃高溫高壓15 min后,測定最終EL值(E2),以ddH2O的EL值(E0)作為對照。離子滲透率=(E1-E0)/(E2-E0)×100%。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株中AtCBF基因表達分析將生長3周的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥在0 ℃環(huán)境下處理48 h。使用RNA提取試劑盒抽提葉片RNA,測定轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3的表達情況,以擬南芥Actin作為內(nèi)參基因。通過2-ΔΔCT方法計算相對于內(nèi)參的表達水平。將未處理條件下(即0 h)的表達值設為1,獲得相對于0 h的基因表達情況并繪圖。3次生物學重復。

1.2.9 酵母雙雜交試驗同源克隆茄子SmYABBY(Sme2.5_03738.1_g00001.1)[6],利用同源重組酶將SmICE1和SmYABBY分別構(gòu)建到酵母雙雜交pGADT7和pGBKT7載體上作為獵物載體和誘餌載體。將pGADT7與pGBKT7組合轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)AH109中,再涂布在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上。30 ℃培養(yǎng)3 d后,用無菌水重懸挑選的酵母菌株并點接種于SD/-Trp-Leu-His及SD/-Trp-Leu-His-Ade固體培養(yǎng)基上,30 ℃倒置培養(yǎng)3 d后拍照記錄。

1.2.10 雙分子熒光互補試驗將SmYABBY編碼區(qū)全長構(gòu)建到含有N端YFP的pXY106載體上,構(gòu)建SmYABBY-nYFP。將SmICE1終止密碼子去除后連接到含有C端YFP的pXY104載體上,構(gòu)建SmICE1-cYFP。隨后將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。SmYABBY-nYFP與SmICE1-cYFP、SmYABBY-nYFP與空cYFP、空nYFP與SmICE1-cYFP農(nóng)桿菌菌液按照1∶1(體積比)的比例混合后注射煙草葉片,48 h后通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子SmICE1的克隆及結(jié)構(gòu)分析

使用AtICE1蛋白序列在茄子基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,篩選獲得ICE1同源基因SmICE1(登錄號:MH992119),對SmICE1編碼區(qū)進行克隆,發(fā)現(xiàn)其全長為1 524 bp,編碼507個氨基酸。使用Prot Param tool在線軟件預測SmICE1蛋白相對分子質(zhì)量為54.75×103,理論等電點為5.6。同源多序列比對分析其結(jié)構(gòu)保守性,發(fā)現(xiàn)SmICE1含有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域、ZIP(zipper)結(jié)構(gòu)域、 N端保守的S-rich基序、C端保守的ACT-like結(jié)構(gòu)域和預測的類泛素化(SUMO)修飾位點(圖1)。進化樹分析顯示,SmICE1與番茄低溫調(diào)控因子SlICE1(XP_004235842.1)[15]同源性最高(圖2),而前期報道的SmICE1a(MH992120)則與番茄SlICE1a(AGG38826)親緣關系較近[10]。

圖1 SmICE1與其他植物物種同源蛋白間的多序列比對

圖2 SmICE1與其他植物物種ICE蛋白間的進化樹分析

2.2 低溫處理下SmICE1的表達分析

由圖3可見:SmICE1在低溫處理1 h后表達量顯著增加,為0 h的2.2倍,隨后表達量降低,12 h時再次升高,說明SmICE1表達受低溫調(diào)控。

圖3 低溫處理后SmICE1基因的表達模式

2.3 SmICE1蛋白的亞細胞定位分析

為了驗證SmICE1蛋白的亞細胞定位,構(gòu)建PHB-SmICE1-YFP植物表達載體,通過農(nóng)桿菌侵染使其在煙草葉片中瞬時表達。由圖4可見:對照PHB-YFP的熒光信號遍布整個細胞,而PHB-SmICE1-YFP蛋白的熒光信號僅定位于細胞核中。表明SmICE1為一個核蛋白。

圖4 SmICE1在煙草表皮細胞中的亞細胞定位

2.4 SmICE1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

如圖5所示:含有SmICE1-pGBKT7和AtCBF1-pGBKT7載體的酵母菌株在篩選培養(yǎng)基(SD/-Trp-His-Ade)上生長良好,并且具有α-半乳糖苷酶活性,而空載體pGBKT7(陰性對照)則不能在篩選培養(yǎng)基上生長。表明SmICE1蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖5 酵母中SmICE1的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

2.5 SmICE1轉(zhuǎn)錄因子對SmCBF表達的調(diào)控作用分析

如圖6所示:低溫環(huán)境下,PHB空載可以增強SmCBF啟動子的活性。常溫(room temperature,RT)環(huán)境下,加入PHB-SmICE1-YFP后,SmCBF啟動子活性被明顯激活,且低溫(low temperature,LT)處理后,SmICE1對SmCBF啟動子的激活作用更加顯著。表明低溫和SmICE1可以促進SmCBF的表達。

圖6 SmICE1在SmCBF基因表達中的作用

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定分析

為了驗證SmICE1在植物低溫響應中的作用,構(gòu)建了35S組成型啟動子驅(qū)動的SmICE1過表達載體,再通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥(wild type,WT)。通過潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株至純合T3代,并通過PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株后選擇2個家系(L1和L2)進行后續(xù)研究(圖7-A)。進一步研究發(fā)現(xiàn)在正常生長環(huán)境下,WT與轉(zhuǎn)基因植株間無顯著差異(圖7-B)。將轉(zhuǎn)基因植株和WT置于-6 ℃處理8 h,隨后在正常生長環(huán)境下恢復1周后對植株存活率進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)野生型植株存活率僅有20%左右,而SmICE1過表達植株存活率達50%～56%(圖7-C)。這表明SmICE1可顯著增強擬南芥的抗寒性。

圖7 SmICE1轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性分析

由圖8可見:在低溫處理前(0 h),野生型植株中電解質(zhì)滲透率和丙二醛(MDA)含量及脯氨酸(Pro)含量與轉(zhuǎn)基因植物無顯著差異。在低溫處理后,所有植株中EL和MDA、Pro含量均隨著處理時間的延長呈增加的趨勢,但野生型中電解質(zhì)滲透率高于轉(zhuǎn)基因植株,Pro含量低于轉(zhuǎn)基因植株,而轉(zhuǎn)基因植株與野生型的MDA含量差異相對較小。表明過表達SmICE1能夠增強擬南芥對于低溫的耐受性。

圖8 轉(zhuǎn)基因和野生型植株的電解質(zhì)滲透率(A)、丙二醛含量(B)和脯氨酸含量(C)分析

由圖9可見:低溫處理后,SmICE1轉(zhuǎn)基因植株中AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因表達量均高于野生型,尤其是AtCBF2。表明SmICE1正調(diào)控植株低溫抗性。

圖9 低溫處理下轉(zhuǎn)基因植株中AtCBF基因表達量

2.7 SmICE1與SmYABBY蛋白間的互作分析

由圖10可見:SmYABBY-pGBKT7與SmICE1-pGADT7共轉(zhuǎn)酵母可以在缺陷型培養(yǎng)基上正常生長,而SmYABBY-pGBKT7與空載體pGADT7或SmICE1-pGADT7與空載體pGBKT7共轉(zhuǎn)均無法在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade培養(yǎng)基上生長,表明SmICE1與SmYABBY蛋白在酵母中存在相互作用關系。

圖10 SmICE1與SmYABBY在酵母中的互作分析

如圖11所示:當SmICE1-cYFP與SmYABBY-nYFP共轉(zhuǎn)煙草時,可以在細胞核中檢測到明顯的熒光信號。而SmICE1-cYFP與空載體nYFP共轉(zhuǎn)或SmYABBY-nYFP與空載體cYFP共轉(zhuǎn)則檢測不到熒光信號,表明SmICE1與SmYABBY蛋白在植物體內(nèi)仍舊能夠發(fā)生相互作用。

圖11 SmICE1與SmYABBY在煙草葉片表皮細胞中的互作分析

3 討論

低溫影響植物的生長發(fā)育,也是造成果實品質(zhì)和產(chǎn)量下降的主要非生物脅迫之一。植物響應低溫具有多種分子機制,其中ICE1-CBF-COR冷馴化轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路存在于多種植物中。前期研究表明茄子SmICE1a作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)植物低溫響應[10]。本研究中,從茄子中分離了另一個ICE1-like轉(zhuǎn)錄因子SmICE1,該蛋白與番茄SlICE1具有很高的同源性。與其他植物ICE1蛋白一樣,SmICE1蛋白含有保守的S-rich基序、ZIP、bHLH、ACT-like結(jié)構(gòu)域以及預測的類泛素化(SUMO)修飾位點。與番茄SlICE1a相似[14],低溫環(huán)境下SmICE1基因表達有輕微的上調(diào),這可能是由于低溫可誘導ICE1蛋白進行翻譯后修飾,包括磷酸化、泛素化和類泛素化修飾等,這些修飾作用對調(diào)控CBF基因表達具有更為重要的作用[16]。在低溫環(huán)境下,擬南芥AtICE1可以結(jié)合到AtCBF3啟動子的MYC識別位點上,從而增強AtCBF3基因的表達[4]。本研究中Dual-LUC試驗表明SmICE1轉(zhuǎn)錄因子可以促進SmCBF基因的表達,而酵母單雜交試驗顯示SmICE1并不能直接結(jié)合到SmCBF啟動子全長和CANNTG基序上(結(jié)果未列出),這可能是SmICE1對SmCBF啟動子的結(jié)合需要低溫誘導SmICE1蛋白進行翻譯后修飾等,后期需要進一步通過其他技術手段驗證SmICE1與SmCBF啟動子間的相互作用。在擬南芥中異源過表達茄子SmICE1,低溫處理后轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著高于野生型,說明過表達SmICE1可以提高植株的抗寒性。電解質(zhì)滲透率、游離脯氨酸和丙二醛含量是衡量植物受凍害程度的重要生理指標。本試驗表明,低溫條件下轉(zhuǎn)基因植株具有更低的電解質(zhì)滲透率以及更高的脯氨酸含量,這與在擬南芥中異源表達不結(jié)球白菜BcICE1的結(jié)果相似[17]。同時,相對于野生型,低溫處理后轉(zhuǎn)基因植株中3個AtCBF基因的表達量也均有不同程度的增加。茄子SmICE1a轉(zhuǎn)基因植株也具有抗寒性增強、低溫下AtCBF基因表達增加和電解質(zhì)滲透率等生理指標改變的表型[10],因此茄子中2個ICE1-like轉(zhuǎn)錄因子在低溫響應上可能存在功能冗余。

ICE1在常溫下組成型表達,在低溫逆境下,ICE1蛋白誘導下游低溫響應基因表達,從而增強植株抗冷性[2-3]。除了參與低溫響應,ICE1還參與氣孔發(fā)育[18]和花青素積累[19]等進程的調(diào)節(jié)。研究表明,ICE1作為氣孔發(fā)育過程中重要的正調(diào)控因子,可以與氣孔發(fā)育過程中最關鍵的3個轉(zhuǎn)錄因子SPCH(SPEECHLESS)、MUTE和FAMA發(fā)生相互作用[18]。目前關于低溫促進花青素合成的研究也有較多報道。在蘋果中,低溫可以誘導蘋果愈傷組織中冷響應基因MdICE1及花青素合成調(diào)節(jié)基因MdMYB10和MdbHLH3表達,且MdICE1與MdMYB10存在相互作用,該互作可能會促進下游花青素結(jié)構(gòu)基因的表達,從而促進蘋果花青素的積累[19]。ZF-HD家族成員YABBY作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛參與植物的生長發(fā)育,包括調(diào)節(jié)番茄果實大小[20],調(diào)控玉米小花發(fā)育和花分生組織發(fā)育[21]等。對紫葉桑葚進行低溫處理發(fā)現(xiàn),低溫可以調(diào)控YABBY基因的表達[22]。在擬南芥中,YABBY1可以調(diào)節(jié)MYB75基因表達從而參與花青素生物合成[23]。我們前期研究表明,對光敏和非光敏茄子進行套袋遮光處理,開袋后進行轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)果皮中SmYABBY和SmICE1與花青素合成相關結(jié)構(gòu)基因具有相似的表達趨勢,且SmYABBY可以結(jié)合到SmTT8啟動子上,可能參與茄子花青素合成[6]。ICE1和YABBY均可在常溫下表達并行使部分功能。本研究通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗驗證了SmICE1與SmYABBY蛋白間的相互作用,但它們是否協(xié)同參與茄子花青素的生物合成,以及是調(diào)節(jié)常溫還是低溫環(huán)境下花青素的積累還需要后續(xù)試驗進行系統(tǒng)驗證。