譚嵩娟,陶蓉,何俊,劉裕強*,萬建民,2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇 南京 210095;2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所,北京 100081)

目前,已克隆的水稻葉片發(fā)育相關(guān)基因主要為葉寬和卷葉基因,其中葉寬基因7個,包括NAL1、NAL2、NAL3、NAL4、NAL5、NAL6和NAL7[1-7]。NAL1編碼植物特有的功能未知蛋白,通過調(diào)控生長素極性運輸、改變維管束排列方式影響水稻葉片小維管束數(shù)目和葉寬[1,8-9]。NAL2和NAL3均編碼OsWOX3A(OsNS)轉(zhuǎn)錄激活因子,nal2/3雙突變體表現(xiàn)葉片維管束數(shù)目減少和葉片變窄的表型[2-3,10]。NAL7編碼YUCCA家族黃素單氧化酶,通過影響生長素合成調(diào)控植物泡狀細胞的大小、數(shù)目和葉型發(fā)育[4,7]。卷葉基因REL1編碼一個單子葉植物高度保守的功能未知蛋白,通過油菜素內(nèi)酯(BR)信號途徑調(diào)控泡狀細胞的數(shù)目和大小,影響葉片形態(tài)[11]。矮稈窄葉基因DNL1編碼一個類纖維素合酶OsCSLD4[12-14]。Srs5編碼α微管蛋白,通過不依賴于BR的途徑調(diào)控葉片發(fā)育[15-16]。葉片卷曲基因REL2編碼一個包含DUF結(jié)構(gòu)域的蛋白,影響泡狀細胞發(fā)育及生長素合成和轉(zhuǎn)運[17]。ADL1編碼一個鈣蛋白酶,參與葉片發(fā)育及葉片近-遠軸維持[18]。PSL1編碼細胞壁定位的多聚半乳糖醛酸酶,psl1突變體泡狀細胞增多,導致其在強光和低濕度下,葉片向內(nèi)卷曲成管狀[19]。稻顯性卷葉基因CFL1編碼含有WW結(jié)構(gòu)域的蛋白,調(diào)控角質(zhì)層的發(fā)育從而影響葉片的形態(tài)[20]。TL為R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子OsMYB60的反義長鏈非編碼RNA(lncRNA),通過對OsMYB60的組蛋白修飾,負調(diào)控OsMYB60的表達,從而影響葉片形態(tài)發(fā)育[21]。此外,DGL1編碼一個負責切斷微管的類劍蛋白,在細胞和器官的伸長中發(fā)揮重要作用,dgl1突變體株高變矮,葉片變短,葉尖略呈圓狀[22]。雖然已經(jīng)克隆了多個水稻葉寬和卷葉基因,但水稻葉片分化和葉片邊界形成相關(guān)基因還少見報道,水稻葉片起始和分化的分子機制尚不清楚。

本研究在粳稻品種‘02428’的組織培養(yǎng)過程中獲得了一個葉片融合生長的突變體lf1(leaffusion1),并完成了LF1基因的圖位克隆及初步功能分析,為解析水稻葉片的發(fā)育調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在粳稻品種‘02428’組織培養(yǎng)過程中篩選并分離到1個葉片融合突變體,命名為lf1(leaffusion1),利用lf1與葉片表型正常的秈稻品種‘N22’雜交,構(gòu)建F2分離群體,種植在南京農(nóng)業(yè)大學水稻研究所土橋試驗基地。從包含1 460個單株的F2分離群體中挑選葉片融合突變體單株和正常單株用于基因定位。

1.2 DNA樣品制備

采集新鮮的水稻葉片,立即提取DNA或保存于-20 ℃冰箱備用。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取葉片總DNA:將葉片用液氮冷凍后打碎成粉末狀,加入600 μL CTAB提取液,搖勻,65 ℃水浴30 min;加入600 μL氯仿抽提液(氯仿與異戊醇體積比為24∶1),12 000 r·min-1離心10 min;取上清液400 μL,加入-20 ℃預冷過的異丙醇240 μL,置于-20 ℃冰箱冷凍30 min;12 000 r·min-1離心5 min,去除上清液,在沉淀中加入70%乙醇溶液洗滌,晾干后加ddH2O 200 μL溶解,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)及電泳檢測

PCR擴增體系包括:DNA模板(約40 ng)1 μL,前、后引物(2 μmol·L-1)各1 μL,dNTPs(10 mmol·L-1)0.03 μL,rTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1,TaKaRa)0.1 μL,10×緩沖液(含有Mg2+)1 μL,加ddH2O至10 μL。PCR程序為:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s(退火溫度視引物而定),72 ℃ 40 s,34個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增完成后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后檢測,或采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,用1 g·L-1AgNO3溶液進行銀染顯色。突變基因定位使用的分子標記列于表1。

1.4 LF1的精細定位及候選基因確定

從223個SSR標記和118個Indel標記中篩選出親本間有多態(tài)性的DNA分子標記。利用10株葉片融合突變體和10株正常單株,進行突變體基因的初步定位。根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)和RAP-DB網(wǎng)站(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)的‘日本晴’和‘9311’基因組序列,利用Primer Premier 5.0軟件在初步定位的區(qū)間內(nèi)開發(fā)分子標記,并利用256個極端個體縮小定位區(qū)域。進一步對‘lf1’和‘02428’進行重測序,分析定位區(qū)間內(nèi)的差異位點,再經(jīng)PCR驗證,確定候選基因。

1.5 轉(zhuǎn)基因后代鑒定

以粳稻品種‘02428’為背景親本,設(shè)計候選基因的靶位點,利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得敲除植株。提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA,利用引物Seq-lf1(表1)進行PCR檢測,獲得陽性敲除植株,進一步加代,經(jīng)PCR檢測獲得純合敲除突變植株,并考察表型。

表1 本研究用到的引物

1.6 RNA提取以及qRT-PCR分析

使用植物總RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取水稻孕穗后期不同組織的總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄使用SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa);qRT-PCR使用SYBR?PremixExTaqTMKit(TaKaRa),以水稻Ubiqutin基因(Os03g0718100)作為內(nèi)參,每個樣品3次重復,在美國ABI7500型熒光定量PCR儀(ABI-PRISM7500HT)上擴增。試驗中得到的CT值(樣品達到閾值水平的循環(huán)數(shù))在15～28較為合理,試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法分析處理。反應(yīng)體系(20 μL)包括:SYBR?PremixExTaq(TaKaRa)10 μL,2 μmol·L-1前、后引物混合液5 μL,模板cDNA 5 μL(10～30 ng),加ddH2O補足20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預變性30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s。

1.7 生物信息學分析

在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索并下載不同物種同源蛋白,使用MEGA7軟件構(gòu)建進化樹,在PHYRE2網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)預測獲得蛋白的二級結(jié)構(gòu),使用ESPript3.0網(wǎng)站(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)進行氨基酸序列比對。

1.8 亞細胞定位分析

用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-ver.2(TOYOBO日本公司)從野生型cDNA中擴增LF1基因的全長cDNA(去除終止密碼子),采用雙切雙連方法連接到瞬時表達載體pAN580和pCAMBIA1305上,載體均由CaMV35S強啟動子驅(qū)動,序列分別融合到GFP蛋白的N端和C端。成功構(gòu)建LF1片段與GFP融合載體后挑選單克隆,測序驗證正確后采用TIANGEN公司的無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(DP117)提取質(zhì)粒。

LF1的水稻原生質(zhì)體亞細胞定位分析:參照水稻原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化的方法[23],將生長7～10 d的幼苗近根處莖稈切成0.5～1 mm的切片,放入盛有20 mL 0.6 mol·L-1甘露醇溶液的100 mL燒瓶中,用鋁箔覆蓋,靜置10 min;去除上清液,加入事先配制好的20 mL酶液(含1.5%纖維素酶和0.3%離析酶,配制好的酶液要避光保存),立即真空減壓40～60 min,28 ℃、40 r·min-1黑暗酶解4～6 h;濾除酶液,向沉淀中加入20 mL W5溶液,緩慢搖晃,80g離心5 min;去除濾液,加入20 mL W5溶液,緩慢搖晃,80g離心5 min;去除上清液,沉淀用適量的MMG溶液輕輕懸浮;在2.0 mL聚丙烯管中加入10 μg質(zhì)粒,加ddH2O補至 20 μL;將之前的原生質(zhì)體懸浮液分裝到2.0 mL聚丙烯管中,輕輕混勻;加入40% PEG溶液220 μL,輕輕顛倒混勻,靜置20 min,加入1 mL W5溶液,輕輕混勻,80g離心5 min;去除上清液后加入2 mL W5溶液,之后加入經(jīng)5% BSA浸潤并在超凈工作臺吹干、經(jīng)UV照射30 min以上、W1溶液浸潤的細胞培養(yǎng)板孔中,輕輕混勻,錫箔紙包裹,28 ℃黑暗培養(yǎng)15～20 h。使用Leica公司SP8型激光共聚焦顯微鏡觀察LF1-GFP和GFP-LF1的亞細胞定位。

LF1的煙草亞細胞定位分析:播種煙草種子,每天12 h光照培養(yǎng),培養(yǎng)30 d左右。將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(EHA105),30 ℃培養(yǎng)2 d;用接種環(huán)將農(nóng)桿菌從固體培養(yǎng)皿刮下,接于10 mL YEB液體培養(yǎng)基中,170 r·min-1培養(yǎng)1 h;4 000 r·min-1離心4 min,去上清液;用10 mmol·L-1MgCl2(含120 μmol·L-1AS)懸浮液重懸菌體,調(diào)D600值至0.6左右;挑選生長狀況良好的煙草植株,用去針頭的1 mL注射器從煙草葉片下表皮注射,并做好標注;將注射完成的煙草植株弱光培養(yǎng)2 d,在共聚焦顯微鏡下觀察LF1-GFP和GFP-LF1的亞細胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型特征

從圖1可見,突變體lf1和野生型‘02428’均種植在南京長日照條件下。與野生型‘02428’相比,lf1突變體植株在株高、分蘗和生育期等主要農(nóng)藝性狀上與野生型差異不明顯,但部分不同部位相鄰葉片膠連在一起,不能正常分離,表現(xiàn)不同程度的融合生長表型,且融合的部位沒有規(guī)律。

圖1 野生型和lf1突變體的植株和葉片表型

2.2 lf1的基因定位及候選基因確定

挑選10株葉片融合突變體單株和10株正常個體,利用從223個SSR標記和118個Indel標記中篩選出的分布于水稻12條染色體上的多態(tài)性分子標記,進行l(wèi)f1突變體基因的初步定位。結(jié)果表明,lf1初步定位在第6染色體分子標記InDel6-6和RM30之間(圖2)。進一步根據(jù)Gramene(http://www.gramene.org/)和RAP-DB(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)中的‘日本晴’和‘9311’的參考基因組序列,在初定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)分子標記,并利用265個極端單株將lf1精細定位在標記InDel6-6和RM6818之間,其物理距離約為3.2 Mb,并與區(qū)間內(nèi)的分子標記InDel6-6和RM20049共分離(圖2)。

圖2 lf1的精細定位及差異基因分析

鑒于定位區(qū)間跨著絲粒,無法獲得新的重組個體以縮小定位區(qū)間,對野生型‘02428’及突變體lf1進行了重測序。通過序列比較分析發(fā)現(xiàn),與野生型‘02428’相比,在精細定位區(qū)間的3.2 Mb內(nèi)的121個基因中,有9個基因與突變體lf1存在差異,包括1個假定蛋白基因(Os06g0344201),1個表達蛋白基因(LOC_Os06g25420),6個轉(zhuǎn)座子基因(LOC_Os06g24640、LOC_Os06g25580、LOC_Os06g26210、LOC_Os06g27990、LOC_Os06g28100和LOC_Os06g29200)和1個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因(Os06g0344900)(表2)。其中,假定蛋白基因、表達蛋白基因及6個轉(zhuǎn)座子基因均發(fā)生單堿基替換;而NAC轉(zhuǎn)錄因子基因Os06g0344900中存在一個33 bp的缺失。鑒于僅有Os06g0344900有明確功能注釋,將該基因確定為lf1的候選基因。

表2 定位區(qū)間內(nèi)差異基因分析

從圖3可見:通過NCBI和Gramene(http://www.gramene.org/)網(wǎng)站對基因功能進行預測,Os06g0344900基因?qū)儆贜AC轉(zhuǎn)錄因子家族,編碼無頂端分生組織蛋白(no apical meristem protein),基因全長1 799 bp,編碼區(qū)序列CDS全長1 122 bp。測序發(fā)現(xiàn)lf1突變體中Os06g0344900的第1外顯子上存在33 bp(5′-GGCG-GGCGGCTGGACGGCGAGCTGCCGCCGGGG-3′)的缺失(圖3-A),導致其編碼的氨基酸與野生型相比缺少11個氨基酸(圖3-B)。并進一步通過野生型和突變體全長cDNA測序驗證了該缺失。

圖3 野生型及l(fā)f1突變體Os06g0344900的序列比較分析

Os06g0344900編碼一個具有373個氨基酸的蛋白,進化樹分析顯示該蛋白在真核生物中廣泛存在(圖4-A)。同源蛋白序列比對發(fā)現(xiàn):Os06g0344900編碼蛋白具有一個高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域,lf1中該基因的突變位點位于核心結(jié)構(gòu)域的保守位點(圖4-B、C)。

圖4 LF1與其同源蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

2.3 lf1的克隆及序列分析

為進一步驗證Os06g0344900是否是目的基因LF1,設(shè)計了針對Os06g0344900的sgRNA,利用CRISPR/Cas9,創(chuàng)制以‘02428’為背景的敲除突變體。經(jīng)測序驗證,獲得4種不同類型的敲除突變體LF1-K01、LF1-K02、LF1-K03和LF1-K04,4種突變體類型均導致Os06g0344900的移碼及翻譯提前終止(圖5-A)。經(jīng)表型觀測,4種敲除突變體均出現(xiàn)了與lf1類似的表型,表現(xiàn)為部分葉片融合生長(圖5-B、C),表明Os06g0344900即為導致lf1突變體葉片融合生長表型的目的基因LF1。此外,與lf1不同,4個敲除家系,除表現(xiàn)葉片融合生長表型外,還具有植物畸形矮化和生長后期致死等表型?？赡苁怯捎趌f1編碼的蛋白僅存在11個氨基酸的缺失,還具有部分功能,而敲除家系中LF1幾乎完全缺失。上述結(jié)果表明,該基因不僅參與調(diào)控水稻葉片的發(fā)育,而且在其他組織及器官的發(fā)育過程中也具有重要作用。

圖5 LF1敲除突變體的表型

2.4 LF1的表達模式分析

為探究LF1在各器官中的表達,利用qRT-PCR進行檢測,發(fā)現(xiàn)其在植株根、莖、葉、鞘、穗中均有表達,在幼穗中表達量最高(圖6)。

圖6 LF1在水稻器官中的表達量

功能注釋表明,LF1編碼NAC類轉(zhuǎn)錄因子,為了進一步驗證其是否在細胞核中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,我們研究了LF1的亞細胞定位。構(gòu)建了LF1的C端融合綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標簽和N端融合GFP標簽2類瞬時表達載體,轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中觀察熒光信號,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論GFP融合在LF1的C端還是N端,GFP熒光信號均定位在細胞核中,證實LF1是一個核定位的蛋白,且GFP標簽對其定位沒有影響(圖7-A、B)。此外,該結(jié)果也在煙草系統(tǒng)中得到了驗證(圖7-C、D)。

圖7 LF1亞細胞定位

3 討論

葉是高等植株重要的營養(yǎng)器官之一,除進行光合作用合成有機物外,還是蒸騰作用的重要場所,為根系從外界吸收水和礦質(zhì)營養(yǎng)提供動力。但水稻葉片發(fā)育的分子機制仍然不清楚,特別是對葉片由葉原基分化和不同葉片邊界形成的機制知之甚少。因此,發(fā)掘葉片分化缺陷突變體,克隆相關(guān)基因,對解析水稻葉片發(fā)育的分子機制具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)了一個葉片融合生長突變體lf1,突變體部分葉片膠連生長,相鄰葉片邊界分化異常,表明該突變基因參與了水稻葉片的分化和邊界的形成。進一步通過精細定位并結(jié)合重測序和基因敲除試驗證實了LF1編碼一個NAC類轉(zhuǎn)錄因子,突變體中該基因保守結(jié)構(gòu)域中33 bp的缺失導致11個氨基酸的缺失,造成基因功能部分缺失,產(chǎn)生了突變表型。

近年來,已經(jīng)克隆了多個水稻NAC類轉(zhuǎn)錄因子基因,但多參與各種非生物脅迫。如SNACI調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因的表達,通過關(guān)閉氣孔來提高水稻耐旱和耐鹽性[24];SNAC2受干旱、鹽堿、冷、機械損傷和ABA處理誘導表達,在植物適應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮作用,在整合非生物和生物脅迫信號中也發(fā)揮作用[25-27];OsNAC5受脫落酸通路調(diào)控,參與水稻衰老、耐鹽和抗旱等[28];OsNAC10在水稻根部特異表達,調(diào)控水稻根系發(fā)育,增強抗旱性[29];ONAC095在干旱和冷脅迫耐受性中發(fā)揮相反的作用,負調(diào)控水稻耐旱而正調(diào)控耐冷[30];ONAC106抑制葉片衰老,增加分蘗角度,并提高水稻耐鹽性[31];ONAC022通過調(diào)控脫落酸信號傳導,正調(diào)控水稻的耐鹽性和耐旱性[32]。此外,水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子OMTN2除參與水稻抗旱,還調(diào)控水稻株高、開花時間、根系和分蘗發(fā)育等[33-36]。但關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控水稻葉片發(fā)育的研究報道還比較少,此類基因調(diào)控水稻葉片發(fā)育的分子機制還知之甚少。

莖尖分生組織(SAM)對于分生組織/器官原基與器官的邊界建立和器官形成至關(guān)重要。LF1與擬南芥CUC(Cup-ShapedCotyledon)和矮牽牛NAM(NOAPICALMERISTEM)同源。研究表明,擬南芥CUC1和CUC2參與植物SAM的形成[37]。CUC1和CUC2存在功能冗余的現(xiàn)象,cuc1和cuc2單突變體沒有明顯的表型,而cucl/cuc2雙突變體表現(xiàn)出嚴重的子葉融合和SAM缺失的表型[38-39]。CUC3與CUC1和CUC2共同參與擬南芥子葉邊界和莖分生組織的建立[40-41]。金魚草(Antirrhinummajus)中的CUC同源基因CUP(CUPULIFORMIS)突變,在整個發(fā)育過程中觀察到顯著的器官融合。除了子葉和花器官融合外,在葉和花序中發(fā)現(xiàn)嚴重的側(cè)器官融合,頂端分生組織變得高度束狀[42]。上述研究表明,CUCs在植物器官的邊界形成過程中發(fā)揮了重要的作用,且在不同物種中是保守的。但關(guān)于CUCs調(diào)控葉片邊界形成的分子機制還缺乏系統(tǒng)性研究。本研究克隆的LF1與擬南芥CUCs是否通過相同的機制調(diào)控水稻葉片的發(fā)育及葉片邊界的形成還有待進一步研究。此外,本研究通過基因編輯技術(shù)獲得4種LF1功能缺失的突變體,這些突變體中出現(xiàn)葉片融合的頻率和程度比lf1突變體更高和更嚴重,可能是由于在lf1突變體該基因還存在部分功能。這4個敲除LF1的突變體不僅出現(xiàn)葉片融合生長的表型,還表現(xiàn)出植株畸形矮化和生長后期致死的表型,表明該基因不僅參與調(diào)控水稻葉片的發(fā)育,而且在水稻其他器官生長發(fā)育過程中也具有重要作用。經(jīng)水稻基因組分析,在水稻基因組中存在6個CUC2的同源基因,但其他同源基因是否也參與葉片的發(fā)育及邊界的形成還有待進一步研究。

致謝:農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學與遺傳育種重點實驗室和江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心對本研究給予支持,謹致謝意。