張雪蒙，亢 超，滕元旭，陳靜怡，崔輝梅

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

土壤鹽漬化是限制植物生產(chǎn)潛力發(fā)揮的主要非生物逆境脅迫之一[1]。土壤鹽漬化使植物受不同程度脅迫傷害，鹽脅迫破壞植物體內(nèi)離子平衡和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，制約根系水分和養(yǎng)分吸收利用，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[2]。中國(guó)絕大部分加工番茄種植在西北地區(qū)鹽漬土壤中，而新疆又是中國(guó)最大的加工番茄種植和加工基地[3]。加工番茄作為新疆主要的特色經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)新疆農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)起著重要的作用[4]。因此，研究加工番茄耐鹽性，對(duì)指導(dǎo)加工番茄生產(chǎn)有實(shí)際意義。

作物鹽害或耐鹽機(jī)理的研究結(jié)果表明，化學(xué)調(diào)控手段是提高作物耐鹽性的有效措施之一[5]。水楊酸別名鄰苯羥基苯甲酸(SA)，是一種簡(jiǎn)單的酚類化合物，它普遍存在于高等植物的細(xì)胞體內(nèi)，參與植物的種子發(fā)芽、開(kāi)花和生理生化離子吸收的生命進(jìn)程，是植物主要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子[6]。研究表明，SA可以誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性(SAR)的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化機(jī)制以及調(diào)控植物光合作用，從而增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性[7]。水楊酸能夠調(diào)控鹽脅迫下植物的抗氧化代謝，調(diào)控植物的抗鹽性，已在辣椒[8]、西瓜[9]、冬小麥[10]等植物的研究中得到證實(shí)。

近幾年的研究表明，H2S是植物體內(nèi)繼 CO和NO后的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[11]。研究發(fā)現(xiàn)低濃度的H2S參與調(diào)控植物氣孔關(guān)閉、種子萌發(fā)和根系發(fā)育等多種生理過(guò)程以及緩解干旱、重金屬等逆境脅迫帶來(lái)的氧化損傷[12]；H2S可作為SA 的下游信號(hào)分子，參與調(diào)控?cái)M南芥對(duì)Cd的耐受性和玉米對(duì)熱脅迫的響應(yīng)[13]。潘東云等研究也發(fā)現(xiàn)H2S可作為 SA 的下游信號(hào)參與調(diào)控低溫弱光下黃瓜幼苗的光合作用[14]。然而SA和H2S兩種信號(hào)分子在植物響應(yīng)鹽脅迫方面是否存在互作還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以加工番茄幼苗為試驗(yàn)材料，探討SA、H2S這兩種信號(hào)分子緩解鹽脅迫生理機(jī)制的相互關(guān)系，為提高加工番茄的耐鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

以課題組前期篩選的KT-7加工番茄品系為試驗(yàn)材料；外源硫化氫(H2S) 供體為 NaHS，購(gòu)自 Sigma 公司，其他化學(xué)試劑購(gòu)于當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2020年11月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站進(jìn)行。選取籽粒飽滿、大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害的加工番茄種子，41 ℃浸種3 h，后用10%高錳酸鉀溶液消毒10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，再放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃發(fā)芽箱內(nèi)催芽。當(dāng)種子大約80%露白后，播種在以蛭石為主要基質(zhì)的育苗盤(pán)中，待真葉完全展開(kāi)后每天灑施營(yíng)養(yǎng)液1次，當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)趨近一致的植株定植到Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，每桶5棵苗，定植前需要用清水清凈幼苗根部的基質(zhì)。幼苗定植恢復(fù)生長(zhǎng)后進(jìn)行不同處理。

在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：CK，不添加處理試劑；NaCl，添加 150 mmol/L NaCl； H2S，添加150 mmol/L NaCl+ 50 μmol/L H2S；SA，添加150 mmol/L NaCl+0.15 mmol/L SA；H2S+SA，添加150 mmol/L NaCl+50 μmol/L H2S+0.15 mmol/L SA。每個(gè)處理3次重復(fù)(桶)。其中，NaCl和SA在處理時(shí)直接溶于營(yíng)養(yǎng)液中，NaHS 溶液以葉片噴施的方式于每日 10:00 噴施。脅迫處理 6 d后各處理選取5株分別測(cè)定第4片完全展開(kāi)葉的快速葉綠素?zé)晒?，然后摘下葉片，一部分用于電解質(zhì)滲透率的測(cè)定，另一部分以液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存，用于其他生理指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)水培桶24 h進(jìn)行充氣泵充氣，營(yíng)養(yǎng)(處理)液每2 d更換1次。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 幼苗形態(tài)指標(biāo)幼苗處理6 d 后，取樣3株測(cè)定株高、莖粗、苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量，105 ℃殺青15 min，80 ℃烘干至恒重，測(cè)定苗干質(zhì)量，根干質(zhì)量。

1.3.2 葉片生理指標(biāo)葉綠素含量的測(cè)定采用95%酒精浸提法測(cè)定[15]。葉片相對(duì)含水量測(cè)定采用稱重法[16]；葉片電解質(zhì)滲透率測(cè)定采用電導(dǎo)法[17]；脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2含量的測(cè)定參照高俊鳳[18]的方法。SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT) 法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；CAT、APX 活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]的方法。

1.3.3 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定NaCl 處理6 d后，每個(gè)處理選取5株加工番茄幼苗進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前先將葉片暗適應(yīng)30 min，然后利用 M-PEA-2 多功能植物效率分析儀(Hansatech，英國(guó))測(cè)定葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線，將獲得的O-J-I-P熒光誘導(dǎo)曲線用于JIP-test分析，參照 Schansker[20]等的方法，通過(guò)快速熒光誘導(dǎo)曲線可以計(jì)算出每個(gè) PSⅡ反應(yīng)中心的光能吸收(ABS/CS)、激發(fā)能捕獲(TRO/CS)、電子傳遞(ETO/CS)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算3次重復(fù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用 Microsoft Excel 2010 進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理，用 SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用 Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤(Means ± SD) 表示，用 Origin2017作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下加工番茄幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

如表1所示，與對(duì)照(CK)相比，加工番茄幼苗的株高、莖粗、苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、苗干質(zhì)量、根干質(zhì)量在150 mmol/L NaCl脅迫處理(NaCl)下均顯著降低，而施加外源H2S、SA單一和復(fù)配處理(H2S+SA)均能在不同程度上增加鹽脅迫下加工番茄幼苗的生物量、株高和莖粗。其中，復(fù)配處理(H2S+SA)的效果最好，其株高、苗鮮質(zhì)量和苗干質(zhì)量分別比鹽脅迫處理(NaCl)顯著增加了36.59%、17.82%和28.53%。說(shuō)明鹽脅迫會(huì)顯著抑制加工番茄幼苗的生長(zhǎng)，而外源H2S、SA單一處理和復(fù)配處理均能有效緩解鹽脅迫對(duì)加工番茄幼苗的生長(zhǎng)抑制，并在復(fù)配處理下的緩解效果最佳。

表1 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下加工番茄幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.2 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉片相對(duì)含水量和脯氨酸含量的影響

圖1,A顯示，同CK相比，NaCl脅迫使加工番茄幼苗葉片中脯氨酸含量顯著增加；H2S、SA處理使幼苗葉片脯氨酸含量較NaCl處理分別顯著提高29.9%和27.52%；而在H2S和SA復(fù)配處理后，加工番茄幼苗葉片脯氨酸含量較H2S、SA單一處理分別顯著提高了17.49%和16.45%(P<0.05)。同時(shí)，加工番茄幼苗葉片的相對(duì)含水量在鹽脅迫下顯著降低(圖1,B)，在H2S、SA單一處理以及H2S和SA復(fù)配處理后均有所增加，但各處理間差異均不顯著，卻均顯著低于對(duì)照。說(shuō)明單一或者復(fù)合施加外源H2S和SA能夠誘導(dǎo)加工番茄幼苗葉片滲透調(diào)解物質(zhì)脯氨酸含量顯著增加，增強(qiáng)加工番茄抵御鹽脅迫的能力，有效緩解鹽脅迫傷害，且復(fù)合處理的效果更佳。

2.3 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下加工番茄幼苗丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率的影響

由圖2，A可知，加工番茄幼苗葉片中MDA含量在NaCl脅迫下比CK顯著增加了79.21%，在H2S、SA和H2S與SA復(fù)配處理下分別較NaCl脅迫處理降低了30.84%、12.28%和38.15%，且單一H2S處理和復(fù)配處理的降幅達(dá)到顯著水平，并兩者的MDA含量與對(duì)照無(wú)顯著差異，其中以復(fù)合處理的緩解效果最佳。

同時(shí)加工番茄幼苗葉片電解質(zhì)滲出率在NaCl脅迫下也比對(duì)照顯著升高(圖2，B)；與NaCl脅迫處理相比，H2S和SA單一處理可使加工番茄幼苗電解質(zhì)滲出率顯著降低，降幅分別為15.61%、14.32%，但仍顯著高于對(duì)照；而H2S與SA復(fù)配處理會(huì)使幼苗電解質(zhì)滲出率比單獨(dú)H2S和SA處理進(jìn)一步顯著下降，并接近對(duì)照水平。以上結(jié)果說(shuō)明外源H2S和SA單獨(dú)或者復(fù)配使用均可以有效緩解NaCl脅迫對(duì)細(xì)胞膜透性造成的破壞，且復(fù)合處理緩解鹽脅迫的效果更為明顯。

2.4 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下加工番茄幼苗抗氧化酶活性和過(guò)氧化氫含量的影響

APX和CAT是植物體內(nèi)清除H2O2的抗氧化酶，其活性受H2O2誘導(dǎo)。圖3顯示：加工番茄幼苗葉片內(nèi)APX和CAT活性在NaCl脅迫下明顯增加，但增幅不顯著；在單獨(dú)施加外源H2S后，APX、CAT活性均比NaCl脅迫處理進(jìn)一步增加，但未達(dá)到顯著水平；在SA單獨(dú)處理后，APX活性也比NaCl脅迫處理顯著上升，而CAT活性則比NaCl脅迫處理稍有降低，回復(fù)到對(duì)照水平；在外源H2S和SA復(fù)合處理后，APX和CAT活性與單獨(dú)處理和NaCl脅迫處理均無(wú)顯著差異。

同時(shí)，加工番茄幼苗葉片內(nèi)SOD活性在NaCl脅迫下比對(duì)照顯著增加，而在施加單一H2S、SA后均比NaCl脅4迫處理不同程度降低，在H2S與SA復(fù)配處理下顯著高于H2S、SA單一處理，也稍高于NaCl脅迫處理。幼苗葉片內(nèi)POD活性卻在NaCl脅迫下比對(duì)照顯著降低，在H2S、SA單一或者復(fù)合處理下均顯著高于NaCl脅迫處理，并恢復(fù)到與對(duì)照相近水平。

另外，NaCl脅迫會(huì)誘導(dǎo)加工番茄幼苗葉片H2O2的產(chǎn)生，其含量比對(duì)照顯著增加，造成氧化損傷；加工番茄幼苗葉片H2O2含量在H2S、SA單一或者復(fù)合處理下均較NaCl脅迫處理大幅度顯著下降，并恢復(fù)到甚至低于對(duì)照水平，且單獨(dú)SA處理和復(fù)合處理的降幅更大(圖3)。表明鹽脅迫條件下添加外源H2S、SA處理可顯著增強(qiáng)加工番茄幼苗葉片內(nèi)APX、POD的抗氧化酶活性，有效去除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多H2O2等活性氧，緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害，且SA和H2S復(fù)配處理的效果更好。

2.5 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉綠素含量的影響

由圖4可知，加工番茄幼苗葉綠素a、b、a+b和類胡蘿卜素含量在NaCl脅迫下均比CK有不同程度降低，但未達(dá)到顯著水平；在單獨(dú)施用外源H2S后，加工番茄幼苗葉綠素 a、b和a + b含量比NaCl脅迫處理分別顯著提升了14.39%、12.72%和13.97%，而單獨(dú)施加外源SA和復(fù)合處理后，各光合色素含量比單一鹽脅迫處理有所增加，但增加幅度均未達(dá)到顯著水平。說(shuō)明外源施加H2S處理能夠有效緩解加工番茄幼苗因NaCl脅迫而引起的葉綠素含量下降。

2.6 外源H2S和SA對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線及其參數(shù)的影響

2.6.1 葉綠素快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線在150 mmol/L NaCl脅迫下，加工番茄幼苗葉片葉綠素快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線在J相較對(duì)照處理未發(fā)生顯著的變化,各處理間熒光的差異在I相和P相之間較為明顯，單一NaCl處理下 J相、I 相和 K相的熒光值均低于對(duì)照(圖5，A)。說(shuō)明NaCl處理下加工番茄幼苗葉片放氧復(fù)合體(OEC)受到了傷害。同時(shí)，由Vt繪制的OJIP曲線(圖5，B)可以看出，在O-J-I段，單一NaCl脅迫處理較對(duì)照處理明顯降低；而在外源H2S、SA處理及其復(fù)合處理則逐漸升高，說(shuō)明外源SA、H2S處理下加工番茄葉片的受傷程度要低于單一鹽脅迫處理，且復(fù)合處理效果更明顯。

2.6.2 PSⅡ反應(yīng)中心活性參數(shù)單位面積吸收的光能(ABS/CSm)、單位面積捕獲的光能(TRo/CSm)和單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/CSm) 可以反映PSⅡ反應(yīng)中心的狀況。從圖6可以看出，加工番茄幼苗葉片ABS/CSm、TRo/CSm 和ETo/CSm在鹽脅迫下均出現(xiàn)下降,降幅分別為5.25%、5.60%、3.24%，而在施加了外源H2S、SA后均有不同程度增加，但各處理之間及其與對(duì)照之間均無(wú)顯著性差異。這可能表明外源H2S與SA可以不同程度提高鹽脅迫下加工番茄葉片PSⅡ反應(yīng)中心活性，增強(qiáng)其對(duì)鹽脅迫抗性。

3 討 論

硫化氫(H2S)、水楊酸(SA)是植物體內(nèi)潛在的信號(hào)分子，均能在逆境條件下調(diào)節(jié)植物的代謝發(fā)揮重要的作用[21]。施加外源H2S[22]或SA[23]均可緩解鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。植物在遭受鹽脅迫時(shí)，由于植物吸水能力的降低，會(huì)導(dǎo)致植物的生長(zhǎng)受到抑制[24]。本研究表明，NaCl脅迫降低了加工番茄幼苗的生長(zhǎng)和葉片的相對(duì)含水量。單一施加外源H2S或SA均能有效緩解鹽脅迫對(duì)加工番茄幼苗生長(zhǎng)的抑制作用；當(dāng)H2S和SA復(fù)配處理時(shí)，可顯著降低鹽脅迫對(duì)加工番茄幼苗的抑制作用，且與H2S或SA單一處理相比緩解效果明顯提高，表明SA和H2S共同作用下會(huì)進(jìn)一步提高加工番茄幼苗對(duì)鹽脅迫的耐受性。

植物體內(nèi)電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的高低可以反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化強(qiáng)弱和細(xì)胞質(zhì)膜受破壞程度，細(xì)胞質(zhì)膜破壞會(huì)使細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性喪失，代謝功能紊亂[22]。鹽脅迫會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，而抗氧化酶系統(tǒng)是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫發(fā)生的一個(gè)重要的防御系統(tǒng)，它可以有效緩解脅迫環(huán)境對(duì)植物造成的損傷[25]。本試驗(yàn)表明，單獨(dú)施用H2S和SA在緩解鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片的膜脂過(guò)氧化、保護(hù)酶活性和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)方面效果幾乎相同，進(jìn)而緩解了鹽脅迫對(duì)加工番茄幼苗的不利影響。同時(shí)施加H2S和SA處理在調(diào)節(jié)膜脂過(guò)氧化等方面顯著優(yōu)于單一H2S、SA處理，說(shuō)明H2S和SA復(fù)配處理對(duì)提高加工番茄幼苗的抗鹽性具有明顯的加性效應(yīng)。這與在黃瓜[26]低溫脅迫上的研究結(jié)果相似。

脯氨酸作為植物細(xì)胞內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物受到鹽脅迫時(shí)會(huì)進(jìn)行積累[27]。本研究顯示，單一施加外源H2S或SA均能顯著提高鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片的脯氨酸含量，而在H2S和SA復(fù)配處理下鹽脅迫番茄幼苗葉片的脯氨酸含量會(huì)進(jìn)一步提高，這與Kaya Cengiz等的研究結(jié)果基本一致[28]。在本研究中，加工番茄幼苗在鹽脅迫處理后通過(guò)顯著提高H2O2產(chǎn)量表現(xiàn)出氧化應(yīng)激；在鹽脅迫下，單一施加外源H2S、SA或二者的復(fù)配處理均顯著降低H2O2產(chǎn)量，表明他們可協(xié)同作用，去除H2O2并維持細(xì)胞氧化還原平衡。本研究中檢測(cè)到的抗氧化酶防御系統(tǒng)的主要依據(jù)是氧化應(yīng)激，這是由鹽脅迫誘導(dǎo)H2O2的生成所引起的，表明加工番茄可以通過(guò)增加抗氧化防御系統(tǒng)活性在一定程度上緩解鹽脅迫造成的毒害。

外源施加SA可以誘導(dǎo)玉米內(nèi)源H2S含量的積累，進(jìn)而提高玉米幼苗的耐熱性，其中H2S與SA共同處理時(shí)緩解效果最佳[29]。本研究中H2S和SA復(fù)配在提高鹽脅迫加工番茄幼苗耐鹽性方面具有明顯的協(xié)同作用，至于H2S和SA協(xié)同處理提高植物耐鹽性的機(jī)理尚不明確，需更進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，鹽脅迫對(duì)加工番茄幼苗的各生理生化特性都有不利的影響。施加外源 H2S 和SA這 2 種信號(hào)分子在降低氧化應(yīng)激、增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)和光合性能方面都具有積極作用，且二者在 NaCl 脅迫下存在著一定程度的協(xié)同作用。H2S和SA同時(shí)處理可降低植物葉片的失水，從而促進(jìn)生物量的積累。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，H2S和SA復(fù)配處理可以誘導(dǎo)增加鹽脅迫下加工番茄幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，使加工番茄幼苗仍保持較完整的光合結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的活力，進(jìn)一步表明H2S和SA在減輕加工番茄鹽脅迫傷害方面存在相互調(diào)控的機(jī)制。