劉盈，周滿如，周春

(1.廣州新華學(xué)院藥學(xué)院，廣東 廣州510520；2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

人參皂苷Rg1作為人參皂苷中主要的活性成分之一，不僅存在于人參的根中，在其非藥用部位莖、葉、花和果中也有較高的含量，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)血管生成等多種藥理作用。陳羨人等[1]研究表明，人參皂苷Rg1可通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，使血清和心肌丙二醛(MDA)水平明顯降低，從而有效緩解糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。容偉等[2]研究表明，人參皂苷Rg1可抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)缺血后的腦組織的保護(hù)作用。此外人參皂苷Rg1可通過(guò)抑制Cytc釋放、調(diào)控凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮對(duì)高脂大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[3]，也可通過(guò)PERK-eIF2、ATF4信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]。但目前對(duì)于人參皂苷Rg1的研究大多數(shù)集中在其對(duì)心、腎、肝、大腦等組織臟器能量代謝紊亂上[5]，而關(guān)于人參皂苷Rg1對(duì)HaCaT細(xì)胞抗衰老的相關(guān)研究卻甚少。本文以100 μg·mL-1H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型，探討人參皂苷Rg1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為今后人參皂苷Rg1在延緩皮膚衰老的研究進(jìn)程中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT cell)細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司

1.1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(純度≥98%)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；CCK-8試劑盒(美國(guó)Biosharp公司)；Hochest33342試劑(美國(guó)Sigma公司)；30%H2O2試劑(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；10%胎牛血清(德國(guó)PAN Biotech公司)；PBS粉末(博士德生物)；活性氧檢測(cè)試劑盒(廣州碧云天生物公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海市貝侖儀器設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(tái)(青島海爾公司)；5%CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；-80 ℃低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；酶熒光多功能檢測(cè)儀(美國(guó)Biotek公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Falon公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；冷凍干燥機(jī)(日本EYELA公司)；離心機(jī)(Beckman Coulter公司)；蛋白印跡轉(zhuǎn)膜槽(美國(guó)Bio-rad Criterion)；蛋白垂直電泳槽(賽默飛公司)；蛋白電泳儀(賽默飛公司)；FluorChem HD2 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(賽默飛公司)。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) 取適量已活化的HaCaT細(xì)胞原液于含10%精制小牛血清和青霉素、鏈霉素各100 μg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培育。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HaCaT細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL密度的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞板中，每孔200 μL，常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)24 h，備用。

1.2.2 細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn) 將HaCaT細(xì)胞分為空白組和損傷組，每組設(shè)5個(gè)平行孔。損傷組以1×105個(gè)/mL密度的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞板中，每孔200 μL，空白組加入相同體積培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。采用CCK-8法篩選H2O2濃度的分組為25、50、100、150、200 mmol·L-1每組5個(gè)復(fù)孔。取出事先培養(yǎng)好的HaCaT細(xì)胞，將原培養(yǎng)基吸出后分別加入對(duì)應(yīng)體積的0.03% H2O2溶液和DMEM培養(yǎng)基使每孔體積為200 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)作用2 h。換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值。細(xì)胞存活率通過(guò)以下公式計(jì)算：存活率(%)=(OD處理/OD空白)×100%。

1.2.3 CCK-8染色法測(cè)定細(xì)胞存活率 將HaCaT細(xì)胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護(hù)組?？瞻捉M給予完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入H2O2溶液使體系終濃度為最佳損傷濃度；人參皂苷Rg1保護(hù)組分為3個(gè)濃度計(jì)量組：5、10、15 mg·L-1。先按濃度加入人參皂苷Rg1預(yù)處理2 h，再加入最佳濃度的H2O2溶液作用2 h進(jìn)行氧化損傷。換培養(yǎng)基終止反應(yīng)后再在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值。計(jì)算每孔中細(xì)胞存活率。

1.2.4 Hochest染色觀察細(xì)胞凋亡 將HaCaT細(xì)胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護(hù)組(15 mg·L-1)。24孔板中的細(xì)胞經(jīng)預(yù)處理及培養(yǎng)后，使用PBS緩沖液反復(fù)清洗3次，加入Hochest33342熒光試劑，染色30 min。使用光學(xué)顯微鏡觀察HaCaT細(xì)胞形態(tài)變化及凋亡情況。

1.2.5 活性氧檢測(cè)試劑盒(ROS Assay Kit)測(cè)定細(xì)胞ROS水平 將HaCaT細(xì)胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護(hù)組，每組設(shè)5個(gè)平行孔，將HaCaT細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5 mL，接種密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。人參皂苷Rg1保護(hù)組加入5、10、15 mg·L-1的人參皂苷，每孔250 μL，空白組和損傷組補(bǔ)充相同體積的DMEM空白培養(yǎng)基，孵育3 h。損傷組與人參皂苷Rg1保護(hù)組加入損傷濃度的H2O2，每孔250 μL，孵育2 h，孵育結(jié)束后移除培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2次，按照ROS檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行后續(xù)操作，最后置于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。以各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度代表ROS水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)增殖凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白 將HaCaT細(xì)胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護(hù)組。每組設(shè)5個(gè)平行孔，將HaCaT細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5 mL，接種密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。人參皂苷Rg1保護(hù)組加入5、10、15 mg·L-1的人參皂苷，每孔250 μL，空白組和損傷組補(bǔ)充相同體積的DMEM空白培養(yǎng)基，孵育3 h。損傷組與人參皂苷Rg1保護(hù)組加入損傷濃度的H2O2，每孔250 μL，孵育2 h，孵育結(jié)束后移除培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2次，結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)caspase-3、caspase-6、caspase-8、GAPDH增殖凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)及磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1 H2O2損傷后 HaCaT細(xì)胞存活率 與空白組比較，25、50、100、150、200 mmol·L-1的H2O2損傷處理HaCaT細(xì)胞后，各組HaCaT細(xì)胞存活率均有下降(P<0.05)。在H2O2濃度為100 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞損傷率達(dá)50%左右，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)損傷組中H2O2的加入量(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同濃度H2O2損傷后HaCaT細(xì)胞存活率

2.2 人參皂苷Rg1預(yù)處理后各組HaCaT細(xì)胞存活率 與空白組比較，H2O2損傷組HaCaT細(xì)胞存活率明顯降低，與H2O2損傷組比較，5、10、15mg·L-1的人參皂苷Rg1保護(hù)組HaCaT細(xì)胞存活率明顯升高，10、15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護(hù)組中HaCaT細(xì)胞存活率升高最為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明人參皂苷Rg1對(duì)H2O2氧化損傷后的HaCaT細(xì)胞增殖有一定的作用(見(jiàn)圖2)。

圖2 人參皂苷Rg1預(yù)處理后各組HaCaT細(xì)胞存活率

2.3 人參皂苷Rg1預(yù)處理后各組HaCaT細(xì)胞凋亡情況 與空白組比較，H2O2損傷組細(xì)胞呈亮藍(lán)色，出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)聚集的現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與H2O2損傷組比較，5、15 和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護(hù)組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，表明人參皂苷Rg1對(duì)氧化損傷后的HaCaT細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用(見(jiàn)圖3)。

圖3 人參皂苷Rg1預(yù)處理后各組HaCaT細(xì)胞凋亡情況

2.4 人參皂苷Rg1處理后各組HaCaT細(xì)胞ROS水平 與空白組比較，H2O2損傷組細(xì)胞中ROS水平升高，與H2O2損傷組比較，5、15和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護(hù)組細(xì)胞中ROS水平均有所降低，表明人參皂苷Rg1在一定程度上可降低細(xì)胞中ROS水平(見(jiàn)圖4)。

圖4 人參皂苷Rg1處理后各組HaCaT細(xì)胞ROS水平

2.5 Western blot檢測(cè)增殖凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白 與空白組比較，H2O2損傷組細(xì)胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8水平均有所升高，與H2O2損傷組比較，5、15和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護(hù)組細(xì)胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8水平均有所降低，表明人參皂苷Rg1在一定程度上可降低細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)(見(jiàn)圖5)。

圖5 Western blot檢測(cè)增殖凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白

3 討論

ROS被認(rèn)為是造成機(jī)體氧化應(yīng)激的主要原因，包括氧自由基和非自由基的含氧產(chǎn)物，如羥自由基(-OH)、超氧陰離子(O2-)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(ROO-、RO-與ROOH)及過(guò)氧化氫(H2O2)等[6]。大量的ROS超出了機(jī)體清除能力，破壞了機(jī)體正常的氧化/還原平衡狀態(tài)，造成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)氧化損傷和功能紊亂，從而影響機(jī)體正常代謝。本研究發(fā)現(xiàn),與H2O2損傷組比較，5、15 和15 mg·L-1的人參皂苷Rg1保護(hù)組中HaCaT細(xì)胞中ROS含量呈濃度依賴性降低，表明人參皂苷Rg1可通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生和累積從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，提高細(xì)胞活力，維持正常細(xì)胞形態(tài)。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶族，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)途徑[7]。在正常的細(xì)胞內(nèi)，caspase家族以非酶活性前體存在，經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)外多種促凋亡的信號(hào)激活，進(jìn)而介導(dǎo)凋亡。其可分為兩大類，一類是起始觸發(fā)蛋白caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10，另一類是效應(yīng)執(zhí)行蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7。起始觸發(fā)caspase在外來(lái)蛋白信號(hào)的作用下被切割激活，激活的起始caspase對(duì)效應(yīng)執(zhí)行caspase進(jìn)行切割并使之激活，被激活的效應(yīng)執(zhí)行caspase通過(guò)對(duì)caspase靶蛋白的水解，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[8]。caspase-3 是凋亡最直接的執(zhí)行者，caspase-8位于caspase-3的上游，構(gòu)成級(jí)聯(lián)激活[9]。在本研究中，與H2O2損傷組比較，5、15和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護(hù)組中，HaCaT細(xì)胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8蛋白水平均有所降低，表明人參皂苷Rg1在一定程度上可降低細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)。此外，caspase-8和caspase-3的水平變化一致，提示二者可能存在級(jí)聯(lián)反應(yīng)，caspase-8對(duì)caspase-3有一定程度的激活作用。

本研究采用100 μg·mL-1的H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞，建立氧化應(yīng)激損傷模型，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可顯著提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞存活率，緩解細(xì)胞核的損傷狀態(tài)，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)有效降低HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示人參皂苷Rg1一定程度上可降低細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-8 水平，綜上所述，人參皂苷Rg1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基能力及抑制凋亡相關(guān)。