楊俊松，鐘穎穎，余 倩

（廣東工業(yè)大學 輕工化工學院, 廣東 廣州 510006）

相比于價格昂貴、提純困難、易失活變性的天然酶，近年來，高穩(wěn)定性、高催化活性、低成本的納米酶在食品、化工、環(huán)境、免疫分析、生物傳感等領域引起了人們廣泛的關注。特別是不需要使用H2O2的氧化酶樣納米酶越來越受到研究者們的關注，并被廣泛應用于生物傳感系統(tǒng)中以提高對分析物的檢測靈敏度。例如，Zhang等[1]將具有氧化酶模擬活性的磁性多孔氧化石墨烯應用于高靈敏檢測細胞裂解物中的谷胱甘肽。Jin等[2]制備了具有氧化酶樣活性的PdPt雙金屬納米線用于酸性介質(zhì)中酸性磷酸酶的檢測。Hayat等[3]開發(fā)了基于氧化酶樣活性的納米氧化鈰比色傳感策略用于高靈敏地檢測多巴胺和兒茶酚。IrO2作為一種貴金屬氧化物，因其獨特的性能在檢測、傳感、燃料電池及催化等各個領域引起了廣泛的關注[4-5]。例如，Quesada-González等[6]創(chuàng)建了基于IrO2NPs的電催化傳感系統(tǒng)用于快速、靈敏地檢測多溴聯(lián)苯醚。文獻[7-9]將IrO2NPs作為陽極催化劑用于氧氣析出反應中。此外，基于深藍色的IrO2NPs能與生物標記物綴合，Quesada-González等[10]成功創(chuàng)建側(cè)向流動生物傳感器用于靈敏地檢測人體免疫球蛋白。然而，IrO2的酶活性幾乎沒有被探索過，特別是將IrO2和MnO2原位整合形成復合納米酶還未見相關報道。

抗壞血酸(AA)是許多水果和蔬菜中天然存在的水溶性維生素，也是維持人類健康的必需營養(yǎng)素。攝取足夠的抗壞血酸對保持人體的健康至關重要，但AA不能在人體內(nèi)產(chǎn)生，只能從食品或藥品中獲得。長期缺乏抗壞血酸，會導致人體免疫系統(tǒng)功能降低，并引發(fā)壞血病等疾病，但過量攝入也會對身體有害，例如會導致尿結石、胃痙攣等。因此，通過簡單、快速的方法分析食品和藥物制劑中AA的含量至關重要。通過納米酶催化反應來測定AA越來越受到人們的青睞[11-16]。

因此，本文首先通過原位整合法制備IrO2@MnO2納米復合物。然后通過穩(wěn)態(tài)動力學探究該復合物的氧化酶模擬催化能力，并與IrO2NPs和MnO2NPs進行比較以驗證IrO2@MnO2納米復合物具有協(xié)同提高的氧化酶模擬活性。接著優(yōu)化IrO2@MnO2納米復合物用于AA檢測的條件。最后在最優(yōu)檢測條件下，通過測定AA的檢測范圍和檢測限以探究IrO2@MnO2納米復合物用于AA檢測的潛力。

1 實驗儀器與設備

1.1 實驗材料

檸檬酸鈉二元倍半水合物，六氯銥酸鉀(K2IrCl6)，五水合四甲基氫氧化銨(TMA·OH)，四水合氯化錳(MnCl2·4H2O)購自阿拉丁(中國上海)。抗壞血酸(AA)，3,3', 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，氫氧化鈉，硫酸，超純水，氧氣和其他試劑購自麥克林(中國上海)。

1.2 實驗儀器

高速離心機(中科中佳，HC-2066，中國)，酶標儀(Infinite 200，Tecan，奧地利)。透射電子顯微鏡(TEM，HT7700，日本日立)，紫外可見分光光度計(UV2450，日本島津市)，Zeta電位分析儀(ZetasizerNanoZS，英國馬爾文)，X射線光電子能譜儀(XPS， Escalab 250Xi，美國賽默飛)。

2 實驗方法

2.1 MnO2 NPs的制備

參考文獻[17]制備了MnO2NPs。具體如下：在室溫劇烈攪拌下將10 mL 0.3 mol/L的MnCl2·4H2O水溶液快速加入到20 mL由12 mL TMA·OH(0.6 mol/L)、2 mL H2O2(質(zhì)量分數(shù)為30%)和6 mL H2O組成的混合溶液中；所得混合溶液懸浮液繼續(xù)在室溫下劇烈攪拌12 h，以8 000 r/min離心20 min，所得沉淀用無水乙醇和去離子水洗滌至中性，得到MnO2NPs。

2.2 IrO2@MnO2復合納米酶的制備

參考文獻[10]制備了IrO2@MnO2復合納米酶。首先將制備所得的MnO2NPs分散于去離子水中配成質(zhì)量濃度(ρ)為125，62.5，31.3和15.6 μg/mL的MnO2NPs溶液；然后將50 mg檸檬酸二鈉鹽倍半水合物和30 mg K2IrCl6加入到上述不同質(zhì)量濃度的50 mL MnO2NPs溶液中，用0.25 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5；劇烈攪拌下將溶液加熱至沸騰，直至顏色變成藍灰色，保持溶液顏色繼續(xù)加熱30 min后室溫冷卻，檢查溶液pH是否維持在7.5，若不是，則調(diào)節(jié)溶液pH至7.5，接著重復煮沸30 min，直至pH穩(wěn)定在7.5；所得溶液在氧氣鼓泡下煮沸2 h，得到深灰色的IrO2@MnO2復合納米酶溶液[10,17]。

用去離子水代替上述IrO2@MnO2復合納米酶制備方法中的MnO2NPs溶液制備得到IrO2NPs。

2.3 催化活性比較

通過穩(wěn)態(tài)動力學探究了IrO2NPs、MnO2NPs和IrO2@MnO2復合納米酶的催化活性，具體如下：往96孔板中加入150 μL不同濃度的TMB(208, 104, 52,26, 13, 6.5 μmol/L)，接著加入50 μL IrO2NPs、MnO2NPs或IrO2@MnO2復合納米酶，在37 ℃下反應15 min后測定體系的吸光值(650 nm)，空白組不加TMB。根據(jù)朗伯比爾定律(式(1))可計算得到在總反應時間內(nèi)產(chǎn)生oxTMB的濃度c(μmol/L)。

式中：A為體系吸光度值，ε為吸光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)(oxTMB的摩爾吸光系數(shù)為3.9 ×104mol?1·cm?1·L)，c為吸光物質(zhì)濃度，b為吸收層厚度(實驗所用比色皿厚度為1 cm)。將c除以總反應時間得到單位時間內(nèi)產(chǎn)生oxTMB的量v(μmol·L?1·min?1)。

最后根據(jù)式(2)以1/cTMB為橫坐標，1/v為縱坐標作雙倒數(shù)曲線，由曲線截距和斜率可計算得最大反應速度Vmax和米氏常數(shù)Km[2,18]。

式中：V0為初始反應速率，Cs為底物濃度。

2.4 抗壞血酸檢測條件的優(yōu)化

為了實現(xiàn)對AA準確、靈敏的檢測，本文優(yōu)化了IrO2@MnO2復合納米酶檢測AA的條件，包括體系pH、反應溫度、反應時間和IrO2@MnO2復合納米酶濃度。具體步驟為：往96孔板中加入150 μL 416 μmol/L TMB和50 μL一定質(zhì)量濃度的IrO2@MnO2復合納米酶(16.67，32，46.15，59.26，71.43，82.76，93.33 μg/mL)，在一定溫度下(25，31，37，43，49，55，61 ℃)反應一定時間(5，10，15，20，25，30 min)后加入80 μL 2 mol/L H2SO4終止，最后在450 nm處測定體系吸光值。在此過程中，反應體系的pH維持在一定數(shù)值(2，3，4，5，6，7，8，9或10)，另設置空白組(不加TMB)。最終將反應體系最大吸光度值設為100%相對活性，以相對活性為縱坐標，體系pH、反應溫度、反應時間或IrO2@MnO2復合納米酶質(zhì)量濃度為橫坐標作圖。

2.5 抗壞血酸檢測范圍、定量限和檢測限測定

往96孔板中加入50 μL 71.43 μg/mL的IrO2@MnO2復合納米酶和不同濃度的AA(0～1 250 μmol/L)，在37 ℃下反應10 min后加入150 μL 416 μmol/L TMB，37 ℃下反應5 min后加入80 μL 2 mol/L H2SO4，然后用酶標儀在450 nm處測定體系吸光值，反應體系的pH為4，空白對照組不加TMB。最后，以AA濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標進行線性擬合。當信噪比(S /N)為3時，檢測限(LOD)由式(3)得出。

當信噪比(S / N)為10時，定量限(LOQ)由式(4)得出。

式中：SD代表空白組中多次測量的信號的標準偏差，m代表標準曲線的斜率。

3 結果與分析

3.1 IrO2@MnO2復合物制備條件的優(yōu)化

為了獲得具有最優(yōu)氧化酶樣活性的IrO2@MnO2復合物，通過穩(wěn)態(tài)動力學探究了其催化活性，結果如表1所示。根據(jù)表1可得，當MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL時所制備的IrO2@MnO2復合納米酶的Km最小(6.50 × 10?3mmol/L)，這表明其對底物TMB的親和力最高。因此選擇MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL制備IrO2@MnO2復合物。

表1 不同MnO2 NPs質(zhì)量濃度下制備的IrO2@MnO2復合納米酶的Km和Vmax比較Table1 Comparison of Km and Vmax of IrO2@MnO2 composite prepared under different MnO2 NPs concentrations

3.2 IrO2@MnO2復合納米酶表征

使用透射電鏡(TEM)、Zeta電位分析儀和X射線光電子能譜(XPS)對實驗制備的IrO2@MnO2復合納米酶進行表征，通過ImageJ軟件對所得TEM圖進行統(tǒng)計得到納米酶的平均粒徑。圖1(a)為MnO2NPs的TEM圖，結果顯示所制備的MnO2NPs為無規(guī)則納米顆粒。在不同MnO2NPs質(zhì)量濃度下制備的IrO2@MnO2復合物的TEM圖像如圖1(b～e)所示?？芍?，當MnO2NPs質(zhì)量濃度為125，62.5，15.6 μg/mL時，可能由于MnO2NPs過量或不足，都不能很好地形成形態(tài)均一的IrO2@MnO2復合物。而當MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL時能形成粒徑約為136 nm、形態(tài)均一的方塊狀IrO2@MnO2納米顆粒(圖1(c))，這表明MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL是制備IrO2@MnO2復合物的最佳濃度。

圖1 不同質(zhì)量濃度MnO2溶液制備的IrO2@MnO2復合納米酶及IrO2@MnO2粒徑分布圖(ρMnO2=31.3 μg/mL)Fig.1 IrO2@MnO2 composite nanozyme prepared with different MnO2 solution concentration and partical size distribution of IrO2@MnO2(ρMnO2=31.3 μg/mL)

IrO2@MnO2復合納米酶的XPS測試結果如圖2(a～c)所示：圖2(a)為XPS全譜圖，IrO2@MnO2復合納米酶中含有Ir、Mn和O元素。圖2(b)結果顯示Ir 4f在61.80 eV和64.83 eV處具有兩個峰，這可歸因于IrO2的Ir 4f5/2和Ir 4f7/2的結合能[19]。Mn 2p XPS窄譜(圖2(c))顯示在641.50 eV和653.20 eV處有兩個峰，這分別屬于Mn 2p3/2和Mn 2p1/2的結合能[20]。這些結果表明成功合成了IrO2@MnO2復合納米酶。圖2(d)為Zeta電位圖，結果顯示MnO2NPs和IrO2NPs的Zeta電位分別為?15.21 mV和?4.45 mV。而IrO2@MnO2復合納米酶的Zeta電位為?16.38 mV，進一步證明了IrO2@MnO2的成功合成。

圖2 IrO2@MnO2復合納米酶的和XPS譜圖（a，b，c），IrO2 NPs, MnO2 NPs 和 IrO2@MnO2 復合納米酶的Zeta 電位（d）Fig.2 XPS spectra (a, b and c) of IrO2@MnO2 composite nanozyme, Zeta potentials (d) of IrO2 NPs, MnO2 NPs and IrO2@MnO2 composite nanozyme

3.3 IrO2@MnO2復合納米酶的固有氧化酶樣活性驗證

為了驗證IrO2@MnO2復合物的固有氧化酶樣活性，本文用酶標儀測定了體系IrO2@MnO2+ TMB、IrO2@MnO2+ H2O、TMB + H2O在37 ℃下反應15 min后的紫外吸收光譜。結果如圖3所示，只有IrO2@MnO2+TMB體系在650 nm附近有明顯的吸收峰，而對照組體系IrO2@MnO2+ H2O和TMB + H2O均無明顯吸收，這表明IrO2@MnO2復合納米酶具有固有的氧化酶樣活性。

圖3 IrO2@MnO2復合納米酶的氧化酶樣活性Fig.3 Oxidase-like activity of IrO2@MnO2 composite nanozyme

3.4 IrO2 NPs、MnO2 NPs和IrO2@MnO2復合納米酶的催化活性比較

為了驗證經(jīng)過原位整合后能協(xié)同提高IrO2NPs和MnO2NPs的氧化酶樣活性，本實驗通過穩(wěn)態(tài)動力學探究了IrO2NPs、MnO2NPs和IrO2@MnO2復合物的催化活性，結果如表2所示，其中Km值越小代表催化劑對底物的親和力越大。從表2可得，經(jīng)過IrO2NPs和MnO2NPs原位整合形成的IrO2@MnO2復合納米酶的Km(6.50 × 10?3mmol/L)顯著低于IrO2NPs(9.73 ×10?2mmol/L)和 MnO2NPs(2.41 × 10?1mmol/L)，這表明通過原位整合能協(xié)同提高IrO2NPs和MnO2NPs的氧化酶樣催化活性。

表2 IrO2@MnO2，IrO2 NPs和MnO2 NPs 的Km和Vmax比較Table2 Comparison of Km and Vmax of IrO2@MnO2, IrO2 NPs and MnO2 NPs

3.5 抗壞血酸(AA)檢測條件的優(yōu)化

為了實現(xiàn)對AA準確、靈敏的檢測，本文對檢測條件進行了優(yōu)化，包括體系pH、反應溫度、反應時間或IrO2@MnO2復合納米酶濃度，結果如圖4所示。從圖4(a)可得，IrO2@MnO2復合物的酶催化活性受pH的影響較大，在pH為4時達到最佳。圖4(b)顯示在不同的反應溫度下，IrO2@MnO2復合物的酶催化活無明顯差異，這間接表明該復合物具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，最終選擇檢測溫度為37 ℃。從圖4(c)～(d)可得，當IrO2@MnO2復合物濃度達到71.43 μg/mL，反應時間達到5 min時，IrO2@MnO2復合物的酶催化活性即達到最大值，這表明5 min足夠讓所添加的IrO2@MnO2復合物充分氧化底物TMB，因此選擇5 min為最佳反應時間，71.43 μg/mL為最佳復合物濃度。最終選定AA的檢測條件為：反應體系pH為4、反應溫度為37 ℃、反應時間為5 min、IrO2@MnO2復合納米酶濃度為71.43 μg/mL。

圖4 AA檢測條件優(yōu)化結果Fig.4 detection condition optimization results

3.6 抗壞血酸檢測范圍和檢測限的測定

在上述最優(yōu)檢測條件下，對AA的檢測范圍和檢測限進行了測定，結果如圖5所示。從圖5中可以看出隨著AA濃度的增加，體系的吸光值逐漸下降，其中在AA濃度為0～312.5 μmol/L內(nèi)體現(xiàn)出良好的線性關系。線性方程為y= ?0.002 01x+ 0.984 57(R2= 0.998 3)。另外經(jīng)計算得AA的定量限為14.2 μmol/L，檢測限為1.42 μmol/L，低于其他文獻所報道(見表3)，這表明該檢測方法對AA檢測具有高靈敏度。

表3 不同材料檢測AA檢測限比較Table3 Comparison of AA detection limits of different materials

圖5 AA的劑量響應曲線Fig.5 Dose response curve of AA

3.7 方法精確度和穩(wěn)定性的測量

為了研究該檢測方法對于AA檢測在實際樣品中的應用，首先將22.50 mgAA配置成10 mL水溶液，接著取10 μL 上述AA的濃溶液，加入到稀釋20倍的4種含AA的飲料中。然后往96孔板中加入50 μL 71.43 μg/mL的IrO2@MnO2復合納米酶，50 μL各組飲料稀釋液或加標飲料稀釋液，37 ℃下反應10 min后加入100 μL 416 μmol/L TMB，37 ℃下反應5 min后加入80 μL 2 mol/L H2SO4。最后用酶標儀在450 nm處測定體系吸光值，結果如表4所示。從表4中可得在不同加標濃度下，AA的加標回收率為93.95%～103.17%，相對標準偏差(Relative Standard Deviation， RSD，n=3)為2.87%～5.79%。此外，選取飲料1進行了日內(nèi)和日間RSD的測定以考察方法的穩(wěn)定性。結果表明，在同一天內(nèi)對飲料1進行3次加標回收測量(AA的加標量為23.72 μmol/L)所得的日內(nèi)RSD為3.14%，連續(xù)3天對飲料1進行加標回收測量(AA的加標量為23.72 μmol/L)所得的日間RSD為3.27%。以上結果表明IrO2@MnO2復合納米酶用于食品中AA的檢測具有良好的精確度和穩(wěn)定性。

表4 從市售飲料樣品中測定AA的回收率Table4 4Determination of AA recovery rate from commercial beverage samples

4 結論

本文通過原位整合法制備了具有協(xié)同提高氧化酶樣活性的方塊狀IrO2@MnO2復合納米酶，并將其用于抗壞血酸的靈敏檢測，獲得了較寬的檢測范圍(0～312.5 μmol/L)和較低的檢測限(1.42 μmol/L)。因此其在食品監(jiān)測、生物醫(yī)藥、臨床診斷和免疫分析等領域具有較高的潛在應用價值。