李柏茹，秦雙建，#，蔡 穎，李閏冰，關(guān) 嵐，肖 芳，曾 明，徐新云

(1．中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長沙410078；2．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽 421001；3．深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055)

大氣細(xì)顆粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)污染是國內(nèi)外一直關(guān)注的公共衛(wèi)生問題?！?015年全球疾病負(fù)擔(dān)(global burden of disease，GBD)研究》將PM2.5列為第五大死亡因素，并且PM2.5導(dǎo)致了全球420萬人死亡和1.031億殘疾調(diào)整生命年(disability adjusted life year，DALYs)損失[1]。據(jù)估計，2017年中國有124萬人的死亡可歸因于空氣污染，其中85.166萬人的死亡來自環(huán)境PM[2]。PM2.5可通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫紊亂、DNA損傷和遺傳毒性、信號通路改變等機(jī)制對機(jī)體造成損傷[3]。長期的PM2.5暴露會使肺癌患者的死亡率明顯增加，并且確診后的肺癌患者生存期也會縮短，說明PM2.5在肺癌進(jìn)展方面具有一定的促進(jìn)作用[4]。作為人體主要代謝器官的肝臟也是PM2.5的作用器官之一，調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)確診的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者暴露于PM2.5可能會縮短其生存期，并且隨著暴露濃度的升高產(chǎn)生更加嚴(yán)重的影響[5]。同時國外一項流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)室外空氣污染與腎癌的發(fā)生密切相關(guān)[6]。將A549細(xì)胞暴露于25和50μg/mL的北京市可吸入顆粒物PM10水溶性成分持續(xù)48 h，可顯著抑制miR-26a并上調(diào)lin-28同源物B(lin-28 homolog B，LIN28B)，進(jìn)而激活A(yù)549細(xì)胞中的白介素6(interleukin 6，IL-6)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，從而促進(jìn)上皮-間質(zhì)并加速細(xì)胞侵襲遷移能力[7]。岳慧峰等[8]收集太原市郊區(qū)住宅區(qū)PM2.5和PM10，隨后實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5和PM10可以通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)活化和細(xì)胞外基質(zhì)降解途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞遷移和侵襲增強。PM2.5可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤血管新生、激活腫瘤細(xì)胞生成擬態(tài)直接形成腫瘤血管、使腫瘤干細(xì)胞向腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘發(fā)局部慢性炎癥反應(yīng)從而發(fā)生EMT、破壞血管穩(wěn)態(tài)、增加血管通透性等途徑促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移[9]。

目前有很多關(guān)于PM2.5增強癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的假說，但鮮有見到低濃度PM2.5急性染毒也可以促進(jìn)肺、肝和腎癌細(xì)胞遷移及侵襲的實驗研究，因此本研究旨在探究低濃度PM2.5是否可以促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移。課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以刺激人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，HBE)、人正常肝細(xì)胞(human liver cell L02，L02)和人腎上皮細(xì)胞(human kidney 2 cells，HK-2)中部分原癌基因表達(dá)升高，表明PM2.5染毒對正常細(xì)胞中癌基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用[10-11]，但PM2.5對相應(yīng)的癌細(xì)胞是否具有促進(jìn)作用即對其侵襲遷移的影響亟待發(fā)現(xiàn)。因此本文以人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞和人腎癌A498細(xì)胞3種癌細(xì)胞為研究對象，檢測PM2.5對3種細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，為探討PM2.5對癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

A549細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和A498細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購于美國Corning公司；結(jié)晶紫購于上海碧云天公司；多聚甲醛購于國藥集團(tuán)生物有限公司；DMEM培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、胎牛血清及0.25%Trpsin-EDTA購于美國Gibco公司；生物顯微鏡Leica DM3000購于德國Leica公司；TH150F中流量采樣器購于武漢天虹公司。

1.2 PM2.5樣品采集與制備

用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣24 h，連續(xù)采樣3 d，采樣地點設(shè)置在太原山西大學(xué)校園，采樣時間為秋冬季。采集前后對濾膜稱重，采集后將濾膜剪成2 cm×2 cm放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，杯口用錫箔紙密封，超聲震蕩30 min后取出濾膜，將PM2.5樣品懸液轉(zhuǎn)移到干凈的真空冷凍物料盤中，再次密封物料盤口后，于-80℃冰箱冷凍24 h；取出后，用封口膜替換錫箔紙密封物料盤，扎孔，于真空冷凍干燥機(jī)中至PM2.5完全干燥；將物料盤放在超凈工作臺中紫外燈滅菌2 h，用高壓滅菌的超純水溶解干燥的PM2.5顆粒，混合均勻完成PM2.5混懸液的制備，分裝標(biāo)記后于-20℃保存待用，每次使用前振蕩混勻。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

使用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM或MEM)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、HepG2和A498細(xì)胞，傳代時將細(xì)胞傳至6孔板，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定且匯合度達(dá)80%時進(jìn)行染毒。本課題組前期開展大量實驗探索短時間低劑量的PM2.5染毒正常細(xì)胞后產(chǎn)生的危害作用，已經(jīng)利用10和50 μg/mL的PM2.5染毒人支氣管上皮細(xì)胞、人正常干細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞24 h，并發(fā)現(xiàn)這兩個濃度的PM2.5染毒24 h可以導(dǎo)致正常細(xì)胞癌基因表達(dá)發(fā)生明顯的變化[11-13]，所以本實驗擬在此基礎(chǔ)上初步探索相同終濃度的PM2.5染毒24 h對3種癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。故本實驗將終濃度為10和50μg/mL的PM2.5設(shè)定為低劑量染毒組和高劑量染毒組，將不含血清的DMEM或MEM培養(yǎng)基作為陰性對照組，染毒3種癌細(xì)胞24 h。

1.4 Transwell小室侵襲和遷移實驗

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含10%FBS的DMEM或MEM培養(yǎng)基，取出4℃冰箱中解凍的Matrigel(基質(zhì)膠)按1∶8的比例用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基稀釋，取100 μL鋪滿Transwell小室底部(Transwell孔徑為8μm)，并在37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，形成基質(zhì)屏障膜。將染毒24 h后的細(xì)胞消化下來并用無血清培養(yǎng)基制成濃度為1×105個/mL濃度的細(xì)胞懸液，每小室滴加200 μL，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，結(jié)束后取出Transwell小室，并用PBS洗滌2次后，用多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色35 min，把沒有穿過膜的細(xì)胞用棉簽小心擦除，在正置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)目并取均值。遷移實驗也采用Transwell小室法，除不包被Matrigel基質(zhì)膠外，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗均獨立重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 6.0分析作圖，計量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5染毒增強A549細(xì)胞的遷移、侵襲能力

Transwell小室法遷移實驗結(jié)果如圖1所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5染毒組中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(356.33±30.92)、(476.33±28.50)和(563.33±74.00)個。侵襲實驗結(jié)果如圖2所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5染毒組中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(188.33±9.45)、(313.00±7.94)和(404.00±57.66)個。上述結(jié)果表明10和50μg/mL的PM2.5可使A549細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(P＜0.05或0.01)。

圖1 Transwell法檢測PM2.5對A549細(xì)胞遷移能力的影響

圖2 Transwell法檢測PM 2.5對A549細(xì)胞侵襲能力的影響

2.2 PM2.5染毒增強HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲能力

Transwell小室法遷移實驗結(jié)果如圖3所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5染毒組中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(86.42±4.75)、(140.00±16.15)和(234.17±9.06)個。侵襲實驗結(jié)果如圖4所示，陰性對照組、10和50 μg/mL PM2.5組中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(48.33±3.26)、(97.75±6.63)和(123.92±8.57)個。上述結(jié)果表明：與陰性對照組比較，10和50μg/mL的PM2.5可使HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。

圖3 Transwell法檢測PM2.5對Hep G2細(xì)胞遷移能力的影響

圖4 Transwell法檢測PM 2.5對Hep G2細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 PM2.5染毒增強A498細(xì)胞的遷移、侵襲能力

Transwell小室法遷移實驗結(jié)果如圖5所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5組中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(42.33±6.43)、(80.00±6.08)和(174.67±25.01)個。侵襲實驗結(jié)果如圖6所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5組中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(5.67±5.03)、(21.33±5.13)和(40.67±6.81)個。上述結(jié)果表明：與陰性對照組比較，10和50μg/mL的PM2.5可使A498細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。

圖5 Transwell法檢測PM2.5對A498細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是癌癥復(fù)發(fā)以及治療失敗的重要原因，且腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，涉及多條信號通路、轉(zhuǎn)錄因子及酶的活化。但是過去關(guān)于PM2.5與癌癥的研究多集中在PM2.5致正常細(xì)胞和癌細(xì)胞損傷等作用方面[14-15]，卻未見關(guān)于PM2.5對癌癥早期轉(zhuǎn)移的研究報道。因此本研究就PM2.5對肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5可以明顯增強3種癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

肺癌是目前人類所有癌癥中發(fā)病率最高的癌癥，在2018年全球新增癌癥中肺癌占11.6%[16]，同時肺癌也是死亡率最高的癌癥，在2018年全球全部死亡病例中肺癌占18.4%[17]。隨著工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境與健康的關(guān)系逐漸得到了人們的重視，有流行病學(xué)調(diào)查顯示PM2.5與包括肺癌在內(nèi)的多種呼吸系統(tǒng)疾病的進(jìn)展有著密切關(guān)聯(lián)[18]。本研究得到10和50μg/mL PM2.5可以增強A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力，提示PM2.5可能在肺癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著一定的作用。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，PM2.5可通過提高Wnt/β-catenin通路活性及其下游cyclin D1、snail、slug、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)或者是轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白-細(xì)胞鈣黏蛋白-N的表達(dá)量，降低鈣黏蛋白-E的表達(dá)量從而增強A549細(xì)胞的遷移、侵襲能力，進(jìn)一步導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率增加[19-20]。肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，病死率排在所有腫瘤中第2位，不但惡性程度高，而且進(jìn)展迅速、病死率高[21]。隨著醫(yī)療條件的改善進(jìn)步，肝癌患者生存率雖大幅度提高，但高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率依舊是肝癌治療的最大障礙[22]。目前很少有關(guān)于PM2.5與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制研究報道，但是有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PM2.5可以縮短肝細(xì)胞癌患者的生存期[5]，說明PM2.5可能在肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮著一定的作用。本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5可以增強HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力，這與上述的PM2.5縮短肝細(xì)胞癌患者生存期相一致，說明PM2.5可能也在肝癌的轉(zhuǎn)移過程中起著一定的促進(jìn)作用，國內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)PM2.5可以激活RACα-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶導(dǎo)致人基質(zhì)金屬蛋白酶-13的過度表達(dá)，刺激HCC細(xì)胞的遷移和侵襲[23]。腎癌是起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，盡管在所有腫瘤中腎癌的發(fā)病率偏低，但是近年來中國腎癌的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢[24]。目前腎癌常用的療法包括手術(shù)、放化療和中醫(yī)輔助治療等，但同大多數(shù)腫瘤類似，腎癌細(xì)胞也易于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對于這些晚期腎癌患者，臨床上仍然缺乏有效的治療方式導(dǎo)致遠(yuǎn)期預(yù)后仍較差[25-26]。雖然已有流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PM2.5與腎癌的發(fā)生有關(guān)，但仍未有PM2.5增強腎癌轉(zhuǎn)移的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5可以使得A498細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強，與肺癌和肝癌的相關(guān)研究結(jié)果類似。腎癌轉(zhuǎn)移主要是通過腫瘤分泌促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子以大量生成腫瘤內(nèi)血管[27]，配合淋巴管進(jìn)行全身性播散，與此同時腫瘤細(xì)胞在進(jìn)展過程中發(fā)生EMT，腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性，細(xì)胞之間的連接變少，增加細(xì)胞遷移和侵襲的能力[28]。鄒寒冰等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制RAP1-JNK信號途徑時，會促進(jìn)ACHN細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，為后續(xù)進(jìn)行PM2.5促進(jìn)腎癌細(xì)胞侵襲遷移能力的機(jī)制研究提供了新思路。

本研究初步發(fā)現(xiàn)太原市PM2.5可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移，具有一定創(chuàng)新性，但仍存在一些不足，如未對侵襲遷移相關(guān)的特異性生化指標(biāo)、蛋白指標(biāo)進(jìn)行測定以證實PM2.5對癌細(xì)胞侵襲遷移的促進(jìn)作用。實驗中所用細(xì)胞均為傳代次數(shù)不超過10代、生長狀態(tài)良好且無微生物污染細(xì)胞，進(jìn)行侵襲遷移實驗時3種細(xì)胞均按照完全相同的處理方法進(jìn)行，染毒所用PM2.5樣品均為同一批次制作完成，以減少細(xì)胞狀態(tài)和PM2.5樣品批次對侵襲遷移結(jié)果的影響。本研究結(jié)果表明，PM2.5可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人腎癌細(xì)胞A498的侵襲和遷移，PM2.550μg/mL劑量組比10μg/mL劑量組的促進(jìn)作用更明顯，提示PM2.5對癌細(xì)胞侵襲和遷移有促進(jìn)作用，為今后進(jìn)一步深入開展PM2.5的致癌機(jī)制和對癌細(xì)胞侵襲、遷移的調(diào)控機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。