刁娟娟, 王婷婷, 李 莉*

(1. 新疆醫(yī)科大學 中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830011; 2. 新疆醫(yī)科大學 藥學院, 新疆 烏魯木齊830017)

石墨烯量子點(Graphene quantum dots, GQDs)是由二維材料石墨烯衍生出來的零維材料，具有優(yōu)異的光學性質(zhì)，在細胞成像[1]、分析檢測[2]、光電化學、生物傳感[3]、光催化等方法有良好的應(yīng)用前景。石墨量子點的合成方法主要分為自上而下法(Top-down synthetic route)和自下而上法(Bottom-up synthetic route)兩類[4]。自上而下法利用特殊的化學手段將石墨類材料剝離并剪切成石墨烯量子點，主要有電化學法、酸氧化法、溶劑熱法、微波分解法、電子束刻蝕等方法，但產(chǎn)物產(chǎn)率和熒光量子產(chǎn)率都較低，嚴重制約該方法的實際應(yīng)用[5]。自下而上法是通過分子前驅(qū)體來合成石墨烯量子點，主要有水熱法、熱解法、溶液化學法、熱解多環(huán)芳烴法、化學氣相法、富勒烯開籠法等[6]。這種方法易于調(diào)控石墨烯量子點的形貌和尺寸，從而克服了與自上而下的方法相應(yīng)的非選擇性問題。其中采用水熱法制備石墨烯量子點具有操作簡單、條件可控、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。石墨烯量子點的熒光特性容易受到其表面化學狀態(tài)的影響。表面摻雜化可調(diào)節(jié)石墨烯量子點電子結(jié)構(gòu)和表面化學特征，從而引起石墨烯量子點的光致發(fā)光強度和發(fā)射波長的變化，主要為氮元素、硫元素、硼元素、磷元素的摻雜，其中以氮元素最為常用[7-8]。在摻雜劑中，氮被認為是石墨烯量子點中雜原子摻雜的極好候選者，因為氮原子與碳原子大小相當，并且氮原子的五個價電子可與碳原子形成強價鍵，從而提高熒光量子產(chǎn)率[9-10]。

摻雜型石墨烯量子點因具有良好的光學性能和生物相容性，合適的細胞膜滲透性和高穩(wěn)定性等諸多優(yōu)點，已成為體外和體內(nèi)成像研究的有力工具[11-12]。目前氮摻雜石墨烯量子點已用于細胞成像[13-14]、體內(nèi)生物成像[7]、癌細胞診斷[15]、活體動物中深層腫瘤組織靶向成像[16]、細菌熒光標記等研究中。

近年來因合成過程簡單且熒光量子產(chǎn)率高，檸檬酸已成為采用自下而上的碳化路線合成石墨烯量子點最常用的分子前驅(qū)體[17]。檸檬酸和胺可通過熱解法、水熱法或微波輔助法可制備氮摻雜石墨烯量子點[18]。在本文中，以檸檬酸為碳源，乙二胺為氮源，通過一步水熱法合成出一種高熒光量子產(chǎn)率的氮摻雜石墨烯量子點，具有低毒性和良好的生物相容性，進行細胞成像研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

檸檬酸購自天津盛奧化學試劑有限公司，乙二胺購自天津富宇精細化工有限公司，硫酸奎寧購自上海藍季生物，均為分析純。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽購自美國MP Biomedicals公司。

熒光分光光度計(RF-5301，日本島津)；紫外-可見分光光度計(UV2700，日本島津)；傅立葉變換紅外光譜儀(IRPrestige-21，日本島津)；透射電子顯微鏡(JEM123型，日本電子株式會社)；電子分析天平(AB-135S，梅特勒-托利多)；激光共聚焦顯微鏡(C2，日本尼康)；反應(yīng)釜(KH-25，上海羌強儀器設(shè)備有限公司)；酶標儀(1510，美國賽默飛世爾)。

1.2 氮摻雜石墨烯量子點(N-GQDs)的制備

稱取0.21 g檸檬酸，向其中加入0.18 g乙二胺，劇烈攪拌混合后，定容到5 mL。將混合溶液轉(zhuǎn)移到25 mL的反應(yīng)釜中160 ℃下加熱4 h，然后冷卻至室溫后得到氮摻雜石墨烯量子點(N-GQDs)。氮摻雜石墨烯量子點合成的反應(yīng)原理見圖1。在檸檬酸的縮合反應(yīng)中有效地產(chǎn)生五元環(huán)稠和2-吡啶酮化合物，該化合物作為主要中間體在氫鍵的作用下自組裝成超分子聚集體，表現(xiàn)出光致發(fā)光的高熒光量子產(chǎn)率[20-21]。

圖1 N-GQDs合成的示意圖Fig.1 Schematic illustration of the synthesis of N-GQDs

1.3 細胞毒性檢測

通過細胞活性比色法(MTT法)檢測氮摻雜石墨烯量子點的細胞毒性。將長至對數(shù)期的Hela細胞用胰蛋白酶消化完成后得到混懸細胞，將細胞加至血球計數(shù)板上，用倒置顯微鏡計數(shù)。通過反復(fù)調(diào)整細胞濃度，使細胞濃度在5×104/ mL，按1×104/ 孔接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL，置于細胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后用終濃度分別為0、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 mg/L N-GQDs溶液替代原來的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h以后，加入MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL，用酶標儀測量570 nm處各孔的吸光度值。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。計算細胞存活率，按以下公式(1)計算：

cellviability(%)=(ODtreated/ODcontrol)×100%

(1)

其中ODtreated表示加入N-GQDs的OD值，ODcontrol為沒有加入N-GQDs的空白培養(yǎng)液的OD值。

1.4 細胞成像

將長至對數(shù)期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化完成后，得到細胞混懸液，用完全培養(yǎng)液稀釋，使細胞濃度在5×104/mL，在玻底皿中分別加入600 μL細胞，待細胞粘附后，再加入900 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，再加入500 mg/L N-GQDs 1 mL，培養(yǎng)24 h，PBS清洗2次，洗去沒有進入細胞的N-GQDs，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及熒光成像情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-GQDs制備影響因素考察

2.1.1 加熱時間的考察

對于脫水聚合反應(yīng)，加熱時間的長短對聚合程度有一定影響，為了探究制備過程中加熱時間對N-GQDs光致發(fā)光的影響，考察加熱時間為2、3、4、5、6 h時，N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率的變化，見圖2(a)。隨著加熱時間的增加，熒光量子產(chǎn)率不斷增加，當加熱時間為4 h時，石墨烯量子點的熒光量子產(chǎn)率最高，加熱時間較短時，檸檬酸與乙二胺的聚合反應(yīng)才開始，N-GQDs還沒有完全合成；而時間較長時，可能會發(fā)生完全的碳化聚合，量子點尺寸增大，生成的石墨烯較多而導致熒光量子產(chǎn)率降低。所以加熱4 h反應(yīng)得出的N-GQDs熒光量子產(chǎn)率最高，其把吸收的光轉(zhuǎn)化為熒光的能力最強。

2.1.2 加熱溫度的考察

加熱的溫度對于檸檬酸和乙二胺聚合的程度是有很大影響的，考察加熱溫度為140、150、160、180 ℃時，N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率變化，見圖2(b)。溫度升高，增加了原材料檸檬酸和乙二胺脫水縮合的反應(yīng)速率，生成大量小尺寸的N-GQDs，但高溫下，小尺寸的N-GQDs又會聚合生成大尺寸的N-GQDs，熒光量子產(chǎn)率降低，因此選擇加熱的溫度為160 ℃。

2.1.3 反應(yīng)物加入量的考察

反應(yīng)物的加入量影響N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率。考察反應(yīng)中檸檬酸(CA)與乙二胺(EDA)的物質(zhì)的量之比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5時，N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率變化，見圖2(c)。隨著乙二胺的加入量增多，熒光量子產(chǎn)率先增加后減少，當反應(yīng)物的物質(zhì)的量之比為1∶3時，熒光量子產(chǎn)率最大。

圖2 加熱時間(a)、加熱溫度(b)、檸檬酸與乙二胺的物質(zhì)的量之比(c)對熒光量子產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time(a), temperature(b), molar ratio of CA/EDA (c) on quantum yield

通過單因素對N-GQDs熒光量子產(chǎn)率的考察，得到最佳合成條件：合成N-GQDs時，加熱時間為4 h，加熱溫度為160 ℃，檸檬酸與乙二胺的物質(zhì)的量之比為1∶3，以硫酸奎寧為參比，計算得到N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率為94%。

2.2 氮摻雜石墨烯量子點的結(jié)構(gòu)表征

分別采用紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜法、透射電子顯微鏡法對氮摻雜石墨烯量子點進行表征，研究石墨烯量子點的形貌及光學特性。

2.2.1 N-GQDs的紫外及熒光光譜圖分析

如圖3(a)所示，N-GQDs的紫外可見吸收光譜在350 nm處有一個特征吸收峰，歸因于C=O的n→π*躍遷，通過表面激發(fā)態(tài)的能量陷阱而產(chǎn)生強烈的發(fā)射，從熒光光譜圖中可以看出，N-GQDs最大激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為450 nm，在365 nm紫外燈下，橘黃色的N-GQDs呈現(xiàn)亮藍色熒光，說明該氮摻雜石墨烯量子點具有很好的發(fā)光性質(zhì)，是一種高熒光量子產(chǎn)率的量子點。測定N-GQDs在不同激發(fā)波長(360、370、380、390、400、410、420 nm)下熒光譜圖，如圖3(b)所示。發(fā)現(xiàn)當N-GQDs的激發(fā)波長變化時，發(fā)射波長不發(fā)生改變，N-GQDs表現(xiàn)出激發(fā)波長非依賴性的熒光行為。

圖3 (a) N-GQDs的紫外光譜、熒光光譜圖(內(nèi)側(cè)為在白光和紫外光365 nm下的對比)，(b)在不同波長下的熒光譜圖Fig.3 (a) The UV-Vis and fluorescence spectra of N-GQDs (the inside contrast between the whitelight and UV light 365 nm), (b) Emission spectra of the N-GQDs with excitation of different wavelengthes

2.2.2 N-GQDs的傅立葉紅外吸收光譜及透射電鏡圖

將N-GQDs溶液倒入蒸發(fā)皿中，水浴鍋上40 ℃揮發(fā)蒸干，得到N-GQDs固體，加入KBr進行壓片后測定紅外光譜，N-GQDs的紅外光譜圖見圖4。檸檬酸經(jīng)過水熱反應(yīng)后，生成的N-GQDs結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，但還是保留了一些反應(yīng)物的官能團，在2 930 cm-1及1 520 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰分別表示-CH2伸縮振動和-C=C的伸縮振動。在3 000-3 300 cm-1處有-NH的伸縮振動，在1 120 cm-1處有-CN的伸縮振動，說明N-GQDs中乙二胺和檸檬酸發(fā)生了脫水聚合。透射電鏡圖譜顯示N-GQDs的形狀呈規(guī)則的圓形，粒徑大小不一，粒徑范圍主要在20～40 nm之間，見圖5。

圖4 N-GQDs的紅外圖譜Fig.4 FTIR spectra of N-GQDs

圖5 N-GQDs的透射電鏡圖Fig.5 TEM of N-GQDs

2.3 TT法檢測氮摻雜石墨烯量子點的細胞毒性

隨著N-GQDs濃度的降低，細胞存活率增加，當N-GQDs濃度降到500 mg/L以下時，細胞存活率依然保持在90%以上，說明當N-GQDs的濃度達到500 mg/L時，依然具有良好的生物相容性，可以作為熒光探針應(yīng)用于生物體系中(見圖6)。

2.4 細胞成像

N-GQDs可成功實現(xiàn)HeLa細胞的熒光成像，且熒光標記效果明顯。結(jié)果如圖所示，圖7(a)是明場條件下的細胞，圖7(b)為405 nm激發(fā)光后的熒光圖像，從圖中可以看出，攝取N-GQDs的HeLa細胞在405 nm激發(fā)波長下，發(fā)出藍光，N-GQDs成功地進入細胞膜，沒有進入細胞核。圖7(c)為明場和405 nm激發(fā)光下圖的疊加，可以清楚的看到，活細胞的膜內(nèi)有熒光，死細胞卻沒有，說明制備得到的N-GQDs可以標記活細胞，但不能標記死細胞。

圖6 MTT法檢測N-GQDs的細胞毒性Fig.6 Detection of cytotoxicity of N-GQDs by MTT method

圖7 HeLa細胞激光共聚焦圖片(a)明場, (b)激發(fā)波長為405 nm, (c)疊加場Fig.7 Confocal fluorescence microscopy images of HeLa cell (a) bright field, (b) excitation wavelength of 405 nm, (c) applied field

3 結(jié)論

進行了氮摻雜石墨烯量子點及其在細胞成像中應(yīng)用的研究。通過檸檬酸和乙二胺的水熱合成，制備氮摻雜石墨烯量子點。合成方法具有簡單易行，綠色環(huán)保及產(chǎn)率高等優(yōu)點。因氮摻雜石墨烯量子點具有良好的熒光特性和低細胞毒性，應(yīng)用于HeLa細胞熒光標記，進行細胞熒光成像。高熒光量子產(chǎn)率的氮摻雜石墨烯量子點可以作為一種很有前途的低毒性熒光標記物，在生物成像方面有著巨大的潛力。氮摻雜型石墨烯量子點若進一步功能化，結(jié)合激光共聚焦成像技術(shù)可成為檢測細胞內(nèi)物質(zhì)的有效手段，有望應(yīng)用于細胞內(nèi)多種活性分子的檢測。