王 悅, 耿雙雙, 陳海蛟, 智 英, 牟艷玲，姚慶強(qiáng),劉 波

(山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250117)

鞘磷脂是細(xì)胞膜的重要成分，它可被多種生物酶催化產(chǎn)生神經(jīng)酰胺(Ceramide, Cer)、鞘氨醇(Sphingosine, Sph)和鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine 1-phosphate, S1P)[1]。其中Cer 和 Sph 作為負(fù)調(diào)節(jié)因子能夠抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而S1P則可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[2]。鞘氨醇激酶(Sphingosine kinases, SphKs) 作為一種催化酶，它可以通過磷酸化 Sph 產(chǎn)生 S1P 來促進(jìn)細(xì)胞增殖[3]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)有兩種SphKs，即SphK1和SphK2，它們在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異[4]。抑制SphK1活性將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中Sph和Cer水平升高，而S1P水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制或凋亡。因此，SphK1的表達(dá)和活性與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。 一般認(rèn)為SphK1的主要生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，而SphK2主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]。盡管這一觀點(diǎn)一直存在爭議，但毫無疑問，抑制SphK1活性在癌癥、炎癥等疾病的治療中具有重要地位[6]。

目前，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并合成了多種SphK1抑制劑，如PF-543、jaspine B、 2-epi-jaspine B等(圖1A)[7]。天然產(chǎn)物一直是藥物和先導(dǎo)化合物的重要來源，而 Jaspine B 是一種從沖繩海綿 Pachastrissa sp和Jaspis sp中分離出來的天然存在的脫水植物鞘氨醇衍生物[8]。我們團(tuán)隊(duì)利用生物等排原理將四氫呋喃環(huán)替換為四氫吡咯環(huán)，對(duì)2-epi-jaspine B進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾和活性研究，發(fā)現(xiàn)YHR5、YHR7和YHR17(圖1A)對(duì) SphK1具有較強(qiáng)的抑制活性并對(duì)腫瘤細(xì)胞有理想的抗增殖作用[9]?；赮HR5和YHR7的結(jié)構(gòu)，本文通過改變疏水末端環(huán)烷烴的大小來設(shè)計(jì)、合成CHJ1(圖1B)。通過分析CHJ1、YHR5、YHR7的活性結(jié)果來評(píng)估 2-epi-jaspine B 衍生物的疏水端對(duì) SphK1 的影響。

圖1 SphK1 抑制劑及 CHJ1的合成路線。 (A) SphK1 抑制劑的結(jié)構(gòu)。 (B) CHJ1的合成路線Fig.1 SphK1 inhibitors and the synthesis route of CHJ1. (A) Structures of SphK1 inhibitors. (B) The synthesis route of CHJ1

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器及試劑

所有合成試劑無需進(jìn)一步純化可直接使用。9-溴-1-壬烯 (CasNo: 89359-54-6) 和環(huán)戊烷甲醇 (CasNo: 3637-61-4) 購自 Innochem-Adamas，所有溶劑均為分析純。YHR5、YHR7和化合物3由本課題組提供，數(shù)據(jù)見已報(bào)道的文獻(xiàn)[9]。使用 Bruker Avance DRX600 儀器以四甲基硅烷 (TMS) 作為內(nèi)標(biāo)記錄核磁共振氫譜和核磁共振碳譜。

1.2 CHJ1的合成

起始原料化合物3由本課題組參考Fujiwara等報(bào)道的路線合成[10]。在化合物3的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了化合物CHJ1的合成，長鏈末端烯烴(J1)的合成基于Ohno等報(bào)道的方法[11]。在0 ℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向環(huán)戊基甲醇(4.0 moL)的DMF(7 mL)溶液中加入NaH(4.0 moL)。攪拌反應(yīng)30 min后，滴加9-溴-1-壬烯(2.0 moL)， 將反應(yīng)混合物加熱至室溫并攪拌1小時(shí)。 反應(yīng)完成后，用飽和氯化銨淬滅，乙醚萃取。萃取液依次用 H2O 和飽和 NaCl 溶液洗滌，然后用無水 Na2SO4干燥。有機(jī)相濃縮后，所得粗品經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯= 40 ∶ 1)純化得到J1?；衔顲HJ1的合成方法與前期報(bào)道的YHR系列化合物的合成方法相同。在Grubbs2nd催化劑條件下，化合物3與J1發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，在2-位連接疏水長鏈，然后通過去除四氫吡咯烷上的保護(hù)基團(tuán)得到目標(biāo)化合物CHJ1[9]。

1.3 SphKs 的抑制活性

參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行化合物對(duì) SphKs 的抑制活性測定[12]。使用PF-543(從 Selleck 購買)作為陽性對(duì)照。 反應(yīng)體系為50 μL，包括激酶緩沖液(pH = 7.4，組成：40 mmol·L-1Tris、10 μmol·L-1ATP、0.1 g/L BSA、10 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1DTT)、10 μmol·L-1ATP、SphKs、Sph 底物和不同濃度的YHR5、YHR7、CHJ1(0.01、0.1、1、10 和 100 μmol·L-1)。 所有酶促反應(yīng)均在 30 ℃ 下進(jìn)行 40 min。 然后加入 ATP 測試試劑，并將混合物在室溫下孵育5 min。使用微孔板分光光度計(jì)(AD 340，Beckman，USA)立即測量。最后使用Graphpad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 MTT細(xì)胞活性測定

以順鉑為陽性對(duì)照，采用MTT法測試化合物CHJ1、YHR5、YHR7對(duì)5個(gè)細(xì)胞系22RV1、LOVO、A375、HepG2、HCFB(購自中國上海中科院細(xì)胞庫)的抗增殖活性。 將CHJ1、YHR5、YHR7溶解于純DMSO中，并用培養(yǎng)基稀釋至10 mmol·L-1儲(chǔ)備溶液中。在96孔板中以6×103/孔的密度接種5個(gè)細(xì)胞系。分別加入CHJ1、YHR5、YHR7(0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1)并在 37 ℃ 下孵育48 h。然后，在96孔板的每個(gè)孔中加入 10 μL MTT 溶液(PBS 中 5 g/L)。 4 h后，在酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories)中在 570 nm 處讀取每個(gè)孔的OD值，使用抑制率(%)= [1-供試品OD值/陰性對(duì)照組OD值]×100%公式，計(jì)算IC50值。

1.5 細(xì)胞周期

將 A375 細(xì)胞以每孔 1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種在六孔板中，并用CHJ1(0、1、0.3、1、3 μmol·L-1)和對(duì)照組在 37 ℃下孵育 36 h。收集細(xì)胞并在 2 mL離心管中離心。然后去除上清液，用冷PBS洗滌細(xì)胞3次。然后在 -20 ℃下用 70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞。然后用 RNase A 處理 A375 細(xì)胞并用碘化丙啶 (PI) 染色。最后，使用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，BD Biosciences)分析懸浮細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞凋亡

人黑色素瘤細(xì)胞(A375)在 37 ℃, 5%的 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h，取指數(shù)生長期的細(xì)胞，用 0.25%胰酶消化，將密度為 1×106個(gè)細(xì)胞/孔的 A375細(xì)胞接種到六孔板的每個(gè)孔中，每孔 2 mL，放在 5%的 CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h后給藥。然后用CHJ1(0.1、0.3、1、3、10、33 μmol·L-1)和順鉑(10 μmol·L-1)處理細(xì)胞 48 h。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。收集細(xì)胞于2 mL離心管中并在 4 ℃下離心 5 min。然后去除上清液，并用 1 mL的冷 PBS洗滌細(xì)胞3次，再加入200 uL PBS將細(xì)胞打散。隨后，緩慢加入 5 uL Annexin-V-異硫氰酸熒光素(FITC)染料將細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中避光染色 15 min。然后再次在 4 ℃下離心 5 min以去除上清液，加入10 uL PI在 37 ℃ 避光染色 30 min，用 200目尼龍膜過濾到流式管中，使用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur BD，美國)評(píng)估凋亡細(xì)胞。使用ModFit Lt Mac V3.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成化合物的結(jié)構(gòu)表征

(壬-8-烯-1-丙氧基)甲基)環(huán)戊烷(J1)：無色油狀物，產(chǎn)率72%。HRMS (ESI) calcd. for C15H28O (M+H)+: 225.221 8, found: 225.215 3。1H NMR (CDCl3, 600 MHz)δ: 5.81 (ddt,J= 16.9, 10.2, 6.7 Hz, 1H), 4.99 (dq,J= 17.1, 1.6 Hz, 1H), 4.93 (ddd,J= 10.2, 2.1, 1.1 Hz, 1H), 3.40 (t,J= 6.7 Hz, 2H), 3.26 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.98～2.09 (m, 2H), 1.67～1.80 (m, 2H), 1.47～1.64 (m, 6H), 1.17～1.43 (m, 10H)。13C NMR (CDCl3, 150 MHz)δ: 139.18, 114.13, 75.57, 71.08, 39.48, 33.80, 29.73, 29.63 (2C), 29.34, 29.10, 28.89, 26.15, 25.41 (2C)。

2.2 激酶抑制活性

為了探索疏水側(cè)鏈的大小對(duì)激酶活性的影響，我們測試了YHR5、YHR7和新合成的化合物CHJ1對(duì) SphK1/2 的活性。表1所示為PF-543(陽性對(duì)照)和2-epi-jaspine B衍生物CHJ1、YHR5、YHR7對(duì)SphK1/2活性的影響。從整體數(shù)據(jù)來看，烷基取代大小不同的三種化合物CHJ1、YHR5、YHR7的激酶活性沒有顯著差異。新合成的化合物CHJ1的激酶活性相比之前化合物活性略有提高。(IC50值在6.59 μmol·L-1左右)。

表1 CHJ1、YHR5 和 YHR7 對(duì)SphKs活性的影響(數(shù)值以Means ± SD表示)

2.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

測定了 2-epi-jaspine B 衍生物CHJ1、YHR5、YHR7對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性。 此外，還測試了化合物對(duì)正常人心臟成纖維細(xì)胞 (HCFB) 的影響，以評(píng)估它們對(duì)正常細(xì)胞的毒性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，CHJ1、YHR5和YHR7對(duì)正常細(xì)胞系HCFB沒有明顯的細(xì)胞毒性(IC50> 100 μmol·L-1)。 除了YHR7對(duì) HepG2 的抗增殖作用相對(duì)較小外，所有化合物對(duì) 22RV1、LOVO、A375 均顯示良好的抗增殖作用。值得注意的是，這三種化合物在 22RV1 細(xì)胞中均表現(xiàn)出比順鉑更好的抑制活性。此外，CHJ1對(duì)A375的抗增殖作用(IC50= 0.87 μmol·L-1)也優(yōu)于陽性藥物順鉑(IC50= 2.1 μmol·L-1)，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

表2 CHJ1、YHR5 和 YHR7 在體外的抗增殖作用(數(shù)值報(bào)告為平均值±SD)

2.4 CHJ1在G1期阻斷細(xì)胞周期

表2中的數(shù)據(jù)顯示CHJ1對(duì)A375細(xì)胞系具有顯著的抗增殖活性。因此，我們測定了它對(duì) A375 細(xì)胞周期的影響。用CHJ1(0.1、0.3、1、3 μmol·L-1)或?qū)φ仗幚?48 h后，A375 細(xì)胞用 PI 染色并使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。如圖2所示，隨著CHJ1濃度的增加，G1期細(xì)胞與對(duì)照組相比(59.27%)大量積累，從61.03%(0.1 μmol·L-1)到75.36%(3 μmol·L-1)。同時(shí)，S期細(xì)胞從27.13%下降到11.15%，G2期細(xì)胞從11.81%上升到13.48%?；?/p>

以上結(jié)果，CHJ1對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生阻滯作用，將A375細(xì)胞阻滯于G1期，并呈劑量依賴性。

2.5 CHJ1阻斷細(xì)胞凋亡

為了探索細(xì)胞死亡的機(jī)制，A375細(xì)胞用CHJ1(0.1、0.3、1、3、10、33 μmol·L-1)和順鉑(10 μmol·L-1)處理48 h，然后通過Annexin V-FITC/PI檢測 FACS測定。如圖3所示，隨著CHJ1濃度的增加，A375 細(xì)胞的凋亡率顯著增加，在 48 h 時(shí)內(nèi)凋亡率由 18.03% 升至 67.1%。同時(shí)A375細(xì)胞凋亡率與CHJ1濃度呈劑量依賴性正相關(guān)。

圖2 化合物 CHJ1對(duì)A375細(xì)胞的影響(條形圖顯示了 G1、S 和 G2 期細(xì)胞的百分比 (%))Fig.2 Effect of compound CHJ1 on A375 cells. (The bar chart showed the percentage (%) of the cells in the G1, S and G2 phases)

圖3 化合物 CHJ1對(duì) A375 細(xì)胞凋亡的影響(柱狀圖顯示了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的總凋亡細(xì)胞百分比的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)**P < 0.05，*P < 0.01，與對(duì)照組相比)Fig.3 Effect of compound CHJ1 on apoptosis of A375 cells (The bar chart shows the statistics of total apoptotic cellpercentages from duplicate experiments.**P<0.05, *P<0.01, versus the control group)

3 結(jié)論

在前期的研究中，我們對(duì)2-epi-jaspine B進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾和抗癌活性研究，結(jié)果表明，母核結(jié)構(gòu)中的四氫呋喃環(huán)被四氫吡咯烷取代后，2-epi-jaspine B衍生物的活性增強(qiáng)。在本研究中，我們設(shè)計(jì)、合成了側(cè)鏈端基為環(huán)戊烷的衍生物CHJ1，并進(jìn)行生物活性研究，測定了CHJ1、YHR5、YHR7對(duì)激酶的抑制活性，并通過與前期報(bào)道的化合物進(jìn)行比較來評(píng)估疏水側(cè)鏈的大小對(duì)其活性的影響。結(jié)果表明，環(huán)狀烷基疏水末端的微小改變對(duì)化合物的激酶活性有所提高，而且所合成的2-epi-jaspine B衍生物依舊保持著高抗癌活性。除此之外，22RV1、A375、HepG2細(xì)胞活性研究表明，化合物CHJ1比順鉑的細(xì)胞抑制效果更好，具有更理想的抗癌活性，表明CHJ1有望成為有效的SphK1 抑制劑，這對(duì)接下來的成藥性研究具有一定意義。