李煥良 侯曉彬 單柳如 魏雪銀 胡智

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種由于外界暴力所導致的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病率逐年上升[1]。TBI病人受到創(chuàng)傷后，應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)顱腦組織代謝率升高，糖脂質(zhì)代謝紊亂，導致嚴重的并發(fā)癥[2-3]。人體腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可通過各種機制影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]。氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)是腸道菌群糖代謝和氨基酸代謝的產(chǎn)物[5]。SCFAs可以參與調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇的合成，并在肌肉中被代謝[6-7]。TBI與腸道菌群關(guān)系密切，腸道菌群的改變可通過代謝、炎癥途徑對顱腦損傷及預后產(chǎn)生影響[8-9]。TBI病人腸道TMAO和SCFAs中丁酸水平與血清代謝標志物水平相關(guān)性研究較少。腸道細菌代謝的SCFAs主要有丁酸、丙酸和乙酸，它們的摩爾比例大約是20∶20∶60，其中丁酸在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及糖脂代謝中發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究探討TBI腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO和SCFAs中丁酸與血清代謝標志物水平的關(guān)系，為臨床防治TBI提供思路。

對象與方法

一、對象

2018年9月～2020年12月我院收治的99例TBI病人，根據(jù)格拉斯哥昏迷評分法(Glasgow Coma Scale,GCS)[11],將其分為輕型顱腦損傷31例、中型顱腦損傷35例和重型顱腦損傷33例，選取33例健康體檢者作為對照組進行研究。上述研究人群性別、平均年齡、平均病程及體質(zhì)指數(shù)見表1。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批，所有病人及家屬對本次研究內(nèi)容完全知情，且均簽署知情同意書。

表1 一般資料比較

納入標準：有明確的頭部外傷病史；年齡18～65歲；無出血性疾病。排除標準：非外傷導致顱內(nèi)出血；合并有嚴重肝腎功能不全；處于妊娠期或哺乳期女性；合并有嚴重心、肺、免疫與造血系統(tǒng)疾??；合并1型、2型糖尿病或脂代謝異常疾??；近期食用含益生菌、抗生素或類固醇類的食物或藥物；資料不完整或無法自主配合研究。

二、方法

1.腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO、SCFAs中丁酸的檢測:采用高效液相色譜法檢測腸道菌群代謝產(chǎn)物 TMAO的水平。樣品加入乙腈后，產(chǎn)生沉淀，并在4 ℃條件下離心(14 000×g，30 min)，每次取150 μl上清液用于分析。液相色譜的流動相包括水∶乙腈為95∶5和5∶95的混合溶液，兩者均含有0.05%的甲酸和5 mmol/L的甲酸銨，測定的腸道菌群代謝產(chǎn)物 TMAO的水平[12]。采用氣相色譜法檢測腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs中丁酸水平。配置正丁酸標準品，采用火焰離子化檢測器，以氮氣為載氣，手動進樣，每次進樣量為1 μl，運行18 分鐘，通過與標準品保留時間對比定性，以峰面積定量計算腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸水平[13]。

2.腸道細菌檢測：將儲存在-80 ℃冰箱中的糞便樣品取出，按照糞便DNA提取試劑盒(凱杰，德國) 說明書提取。用微量分光光度計鑒定提取的基因組DNA的濃度與純度。將提純的DNA送往華大基因生物科技有限公司進行16S rRNA V3-V4區(qū)域的測序，分析差異細菌。

3.血清代謝標志物：收集各組人群晨起空腹靜脈血，離心后，采用全自動生化分析儀進行檢測血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)和空腹血糖水平。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié)果

1.腸道菌群代謝產(chǎn)物水平比較：比較四組腸道菌群代謝產(chǎn)物水平，TBI病人腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO水平高于對照組，且TMAO水平隨病情嚴重程度增加而逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TBI病人腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs中丁酸水平低于對照組，且隨病情嚴重程度增加而逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 腸道菌群代謝產(chǎn)物水平比較

2.血清代謝標志物水平比較：比較四組血清標志物水平，TBI病人血清TC、TG、LDL-C、HbA1c與空腹血糖水平均高于對照組，且隨病情嚴重程度增加而逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TBI病人血清HDL-C水平低于對照組，且隨病情嚴重程度增加而逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 血清代謝標志指標比較

3.各組人群腸道菌群變化：在腸道菌群種水平上，與對照組相比，TBI病人腸道中E.rectale、F.prausnitzii、Lactobacillis和Bifidobacterium豐度明顯降低，且隨病情加重逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 血清代謝標志指標比較

4.腸道菌群代謝產(chǎn)物與血清代謝標志物水平間的相關(guān)性：采用Pearson相關(guān)分析和多因素Logistic回歸分析腸道菌群代謝產(chǎn)物與常用血清代謝標志物水平，結(jié)果顯示，TMAO與HbA1c(r=0.103，P<0.05)和TC(r=0.043，P<0.05)呈正相關(guān)，與TG(r=-0.215，P<0.05)和LDL-C(r=-0.304，P<0.05)以及E.rectale(r=-0.301，P<0.05)、F.prausnitzii(r=-0.283，P<0.05)、Lactobacillis(r=-0.242，P<0.05)、Bifidobacterium(r=-0.298，P<0.05)呈負相關(guān)，與HDL-C沒有相關(guān)性(r=-0.304，P>0.05)；丁酸與TG(r=0.213，P<0.05)和LDL-C(r=0.312，P<0.05)以及E.rectale(r= 0.414，P<0.05)、F.prausnitzii(r= 0.318，P<0.05)、Lactobacillis(r=0.274，P<0.05)、Bifidobacterium(r= 0.347，P<0.05)呈正相關(guān)，與TC(r=-0.089)和空腹血糖(r=-0.102，P<0.05)呈負相關(guān)，見表5。TC水平(1.651，1.356～2.823)、LDL-C(0.523，0.251～0.847)、HbA1c(1.712，1.292～2.158)和空腹血糖水平(3.796，1.243～4.654)是腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO水平影響病人預后的危險因素，見表6；而TC水平>(0.651，0.356～0.823)、TG水平(1.703，1.158～>3.538)、LDL-C(3.847，2.523～ 4.251)、HbA1c(0.412，0.292～0.658)和空腹血糖水平(0.596，0.243～0.854)是腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸水平影響病人預后的危險因素，見表7。

表5 腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與血清代謝標志物水平

表6 TMAO水平與血清代謝標志物相關(guān)影響因素的多因素Logistic回歸分析

表7 丁酸水平與血清代謝標志物相關(guān)影響因素的多因素Logistic回歸分析

討論

TBI是一種高死亡率和致殘率的疾病，盡管有大量的學者對其病理生理學機制以及檢測方法、治療和預后進行了相關(guān)研究，但仍有很多作用機制尚明確。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，“微生物-腸-腦軸”是腸道菌群與大腦之間的雙向通訊通道，大腦可以通過釋放神經(jīng)信號影響腸道功能，并改變腸道菌群結(jié)構(gòu)；另一方面，腸道微生物群可以通過免疫和迷走神經(jīng)的激活、產(chǎn)生微生物代謝物、多肽、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑等途徑向大腦發(fā)出信號[14-15]。TBI會引起腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，改變后的腸道菌群結(jié)構(gòu)會影響TBI的康復[16]。現(xiàn)代臨床和動物研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化可能是影響重傷預后的重要指標之一[17]，而TMAO與SCFAs為腸道菌群主要代謝產(chǎn)物。TMAO是腸道菌群利用三甲胺(trimethylamine，TMA)裂合酶，將含膽堿或TMA結(jié)構(gòu)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為TMA后在肝臟中氧化后得到的代謝性物質(zhì)[18-19]。

TMAO是由腸道菌群將來源于日常飲食的左旋肉堿、膽堿以及磷脂酰膽堿等物質(zhì)代謝產(chǎn)生TMA后，在肝臟中進一步氧化所得。TBI后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的重要原因之一。TBI急性期由于炎癥反應(yīng)會分泌大量促炎因子，引起血管通透性增加，進而導致腦水腫和顱內(nèi)壓升高，最終導致神經(jīng)細胞死亡[20]。Yamashiro等[21]通過研究缺血性腦卒中病人腸道菌群與代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，得出病人腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂與宿主代謝及炎癥有關(guān)。SCFAs尤其是丁酸，具有抑制中樞神經(jīng)炎癥的作用，發(fā)揮保護大腦的功能[22]。本研究通過比較TBI各型病人與健康體檢者腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO與SCFAs水平發(fā)現(xiàn)，TBI病人TMAO水平顯著升高，且隨病情嚴重程度逐漸升高；而丁酸水平顯著降低，且隨病情嚴重程度逐漸降低。本研究通過對比四組人群腸道細菌，發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物丁酸的E.rectale和F.prausnitzii豐度在TBI病人腸道中明顯降低，且隨著疾病的加重降低越顯著。此外，腸道中E.rectale和F.prausnitzii豐度與丁酸水平呈正相關(guān)。結(jié)合上述文獻報道及本研究提示，TBI病人腸道中重要的產(chǎn)丁酸E.rectale和F.prausnitzii豐度的降低，會影響腸道代謝產(chǎn)物SCFAs水平，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，不利于TBI的預后[20-22]。

SCFAs由腸道菌群將不易被消化的膳食纖維或者碳水化合物通過生物轉(zhuǎn)化生成，作為腸-腦軸的重要介質(zhì)，其進入循環(huán)后可以用于脂質(zhì)或葡萄糖合成。本研究通過比較TBI病人與健康體檢者常用血清代謝標志物水平發(fā)現(xiàn)，TBI病人的TC、TG、LDL-C、HbA1c指標和空腹血糖明顯升高，且隨病情嚴重程度逐漸升高；而HDL-C指標顯著下降，且隨病情嚴重程度逐漸下降，表明TBI病人普遍存在糖代謝以及脂代謝紊亂。當脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂時，由于顱腦組織中富含磷脂，中樞神經(jīng)系統(tǒng)易繼發(fā)產(chǎn)生病理改變，可影響多種代謝反應(yīng)。TBI病人顱腦受到創(chuàng)傷，應(yīng)激反應(yīng)下，顱腦組織代謝旺盛糖原分解代謝和糖異生增強，血糖升高[23]。

通過Pearson相關(guān)分析和多因素Logistic回歸分析腸道菌群代謝產(chǎn)物與常用血清代謝標志物水平發(fā)現(xiàn)，TBI病人血清TMAO與HbA1c和TC及空腹血糖呈正相關(guān)，與TG和LDL-C呈負相關(guān)；SCFAs與TG和LDL-C呈正相關(guān)，與TC、HbA1c呈負相關(guān)。TMAO 升高血糖可能是通過抑制胰島素分泌相關(guān)信號通路，激活炎癥反應(yīng)，促使葡萄糖耐量降低及高血糖癥發(fā)生。陳靜非等[24]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病病人血清TMAO水平與HbA1c呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。TMAO調(diào)節(jié)血脂可能是可以通過降低膽汁酸相關(guān)合成酶的表達直接影響膽固醇代謝，也可通過抑制膽固醇轉(zhuǎn)運，從而在體內(nèi)積聚。Qiu等[25]研究人員在研究小鼠腸道微生物與TMAO時發(fā)現(xiàn)，TMAO對脂質(zhì)代謝具有調(diào)節(jié)作用，血清TMAO的升高會阻礙膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，使血清TC水平升高，與本研究結(jié)果一致。SCFAs被吸收進入血液后在肝臟中代謝，主要用于脂質(zhì)和膽固醇的合成并為其他組織提供能源，也可經(jīng)結(jié)腸吸收后作為糖異生的底物，抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶活性。SCFAs調(diào)節(jié)血糖與血脂可能是由于腸道菌群產(chǎn)物SCFAs經(jīng)腸上皮吸收或進入血液后，與胞內(nèi)酶或胞外特異性G蛋白偶聯(lián)受體GPR41、GPR43和GPR109結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達靶器官或組織，從而為機體提供能量或參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)[26-28]。SCFAs調(diào)節(jié)糖脂代謝也可能是通過刺激過氧化物酶體增殖物活化受體共激活因子-1α，調(diào)節(jié)胰島β細胞功能，改善胰島素抵抗，或由于SCFAs抑制了肝中膽固醇的合成，肝對脂肪酸需求增高，使血液中膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)移從而降低了血清膽固醇水平[29]。胡萬民等[30]研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs的濃度變化與缺血性腦卒中密切相關(guān),SCFAs在結(jié)腸上皮被吸收并進入血液循環(huán)后，可以調(diào)節(jié)葡萄糖和膽固醇代謝,且SCFAs的變化與HbA1c和LDL-C的水平呈負相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

綜上，TBI病人腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO、SCFAs與血清代謝標志物水平密切相關(guān)。TBI病人腸道中主要產(chǎn)丁酸E.rectale和F.prausnitzii豐度的降低，導致腸道代謝產(chǎn)物TMAO、SCFAs減少，誘發(fā)TBI病人中樞炎癥反應(yīng)及糖脂代謝紊亂，不利于TBI的預后。此外，本文通過對TBI病人腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的研究，為防治TBI疾病的進展及預后提供新的作用靶點。