牟愛生 葉丹 彭維祺 孫衛(wèi)平 榮光

摘要為了解儋州市鴨高致病性禽流感 H5和 H7亞型二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，于 2020年 6月在全市12個鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)鴨場（戶）采集289份血清，采用血凝和血凝抑制試驗（ HA-HI ）對禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進行檢測。結果顯示，2020年 6月采集的289份鴨血清樣品中，鴨禽流感 H5以及 H7陽性個體數(shù)分別為249、203份，免疫抗體合格率分別為 86%、70%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的免疫抗體水平達到70%的標準。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果較好，有較強的保護力。

關鍵詞高致病性禽流感;免疫效果;評估

中圖分類號 S852.4??????? 文獻標識碼 A?????? ??DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.013

Evaluation of Immune Effect of Highly Pathogenic Avian Influenza in Ducks in Danzhou， Hainan

MOU Aisheng1??? YE Dan2??? PENG Weiqi2??? SUN Weiping2??? RONG Guang2

（1. Danzhou Service Center for Animal Husbandry and Fisheries， Danzhou， Hainan 571700， China;2. Tropical Crops Genetic Re-

sources Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract?? In order to understand the immune effect of the subtypes H5 and H7 of highly pathogenic avian influenza in ducks in Danzhou， Hainan， 289 serum samples were collected from duck farms （households） in 12 towns of Danzhou in the spring of 2020. The hemagglutination and hemagglutination inhibition tests （HA-HI） were used to detect the immune antibodies of avian influenza subtypes H5 and H7. The results showed that in the 289 duck serum samples collected in the spring of 2020， there are 249 and 203 duck individuals having positive antibody of avian influenza subtypes H5 and H7， respectively， with 86% and 70% of the duck individuals with qualified immune antibodies against the subtypes H5 and H7， respectively， which are in line with the immune antibody level of upto 70% provided for by the Ministry of Agriculture and Rural Areas. The results showed that the bivalent H5+ H7 avian influenza inactivated vaccine has good immune effect and strong protection.

Keywords?? highly pathogenic avian influenza; immune effect; assessment

禽流感（ Avian Influenza， AI ），又稱為禽流行性感冒，是由 A 型流感病毒（ Avian? Influenza? Virus， AIV ）引發(fā)多種禽類感染的疾病綜合征[1]，被世界動物衛(wèi)生組織（ OIE ）列為 A 類傳染病，在我國被列為一類傳染病[2-5]。根據(jù)對禽類致病性不同，可分為高、低和非致病性3 種類型[6]。其中，高致病性禽流感（Highly? Pathogenic? Avian? Influenza，? HPAI ）H5亞型和 H7亞型，傳染性最強，發(fā)病率和死亡率最高，造成的疫情程度最重，對家禽和人類危害最嚴重[7]。因此，接種疫苗以及對家禽進行禽流感的檢測是預防和控制禽流感發(fā)生的有效措施[8-9]。在高致病禽流感 H5 和 H7免疫過程中，由于場地、母源抗體干擾、操作方法等，往往造成免疫保護不夠[9-11]。本研究對儋州市12個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鴨場隨機采樣，分離血清，采用血凝（ HA ）和血凝抑制（ HI ）試驗方法對鴨禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進行檢測，并對抗體水平進行分析?？陀^評價儋州市鴨 H5、H7亞型免疫效果，以期對儋州市鴨禽流感抗體水平有一個正確的認識，對海南省無規(guī)定動物疫病示范區(qū)和自由貿(mào)易港建設具有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 主要試劑阿氏（Alsevers）液（自配）; 1%雞紅細胞懸液（自配）;pH 7.2、0.01 mol/L PBS;禽流感病毒 H5亞型（ Re-11株）血凝血抑實驗抗原（國生生物，試劑批號：20191106）;禽流感病毒 H7亞型（ Re-2株）血凝血抑實驗抗原（國生生物，試劑批號：20191014）。

1.1.2? 儀器設備微量移液器;槍頭;96孔 V 型微量反應板;微型振蕩器;高速離心機;恒溫箱。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品采集于2020年 6月在儋州市12個鎮(zhèn)的養(yǎng)鴨場（戶）采集血樣289份。采血時，使家禽側臥保定，展開內(nèi)側翅膀，拔除采血部位的部分羽毛，取酒精棉球對采血部位進行消毒，然后將采血器針尖斜口向上，以 30°傾斜插入翅靜脈，緩緩抽取血液，達到所需血量后，用酒精棉球按壓止血[12-13]。取血樣2 000 r/min 離心5～8 min，取上清液于1.5 mL 滅菌離心管中，?20℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2? 血凝血抑實驗（ HA ）

1.2.2.1? 血凝實驗（ HA ）（1 ）分別吸取0.025 mL PBS 液加到酶標板微孔的1～12孔中，換滴頭。

（2 ）吸取病毒懸液0.025 mL 加入至第1 孔混勻，再從第1 孔吸取0.025 mL 加入至第2 孔混勻，如此反復，依次稀釋至第11孔，再從第11孔吸取 0.025 mL，棄之，換滴頭。

（3 ）每孔分別加入 PBS 0.025 mL、體積分數(shù)為 1%的雞紅細胞懸液0.025 mL ，振蕩混勻，室溫（20～25℃）靜置40 min，觀察結果。

結果判定∶傾斜反應板，以紅細胞無呈淚滴狀流淌（完全血凝）的抗原的最高稀釋倍數(shù)表示一個血凝單位（ HAU ）。本實驗的一個血凝單位為256。

1.2.2.2? 血凝抑制實驗（ HI ）（1 ）根據(jù)血凝（HA ）試驗結果配制4HAU 的病毒抗原。

（2 ）在微量反應板的1～11孔加入0.025 mL PBS，第12孔加入0.05 mL PBS。

（3 ）吸取0.025 mL 血清加入第1 孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025 mL 于第2 孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.25 mL 棄去。

（4 ）1～11孔為加入含4HAU 混勻的病毒抗原液 0.025 mL，室溫（20℃）靜置至少30 min。

（5 ）每孔加入0.025 mL 體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液輕輕混勻，靜置約40 min （室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)紐扣狀沉于孔底。

結果判定：以完全抑制4 個 HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為 HI 滴度。 HI 價小于或等于3log2判定 HI 試驗陰性; HI 價大于4log2為陽性。

2? 結果與分析

于2020年 6月檢測儋州市12個鎮(zhèn)的養(yǎng)鴨場（戶）鴨血清289份，抗體檢測結果見表1。從表1 可以得出，2020年春季儋州市12個鎮(zhèn)的鴨禽流感 H5免疫合格率分別為100%、100%、0、 100%、100%、100%、67%、100%、67%、95%、100%、100%，12個鎮(zhèn)中有9 個鎮(zhèn)的抗體合格率均達到國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標準（群體抗體水平≥ 70%）。其中，鴨禽流感 H5亞型抗體合格率達到 100%的鎮(zhèn)有 A 鎮(zhèn)、 B 鎮(zhèn)、 D 鎮(zhèn)、 E 鎮(zhèn)、 F 鎮(zhèn)、 H 鎮(zhèn)、 K 和 L 鎮(zhèn)，達到90%≤抗體合格率<100%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 J 鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明大多數(shù)地區(qū)鴨禽流感 H5 亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實到位，筑牢了免疫屏障。除此之外， C 鎮(zhèn)、 G 鎮(zhèn)和 I 鎮(zhèn)的抗體水平不達標（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，鴨禽流感 H5 亞型的防疫工作還應進一步扎實。

從表2 可以得出，2020年春季儋州市12個鎮(zhèn)的鴨禽流感 H7 免疫合格率分別為100%、 100%、0、100%、100%、70%、67%、3%、100%、100%、95%、0，12個鎮(zhèn)中有8 個鎮(zhèn)的抗體合格率均達到國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標準（群體抗體水平 ≥70%）。其中，鴨禽流感 H7亞型抗體合格率達到100%的有 A 鎮(zhèn)、 B 鎮(zhèn)、 D 鎮(zhèn)、 E 鎮(zhèn)、 I 鎮(zhèn)和 J? 鎮(zhèn)，達到90%≤抗體合格率<100%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 K 鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明這些地區(qū)鴨禽流感 H7 亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實到位，筑牢了免疫屏障。在70% ≤抗體合格率<80%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 F 鎮(zhèn)，表明 F 鎮(zhèn)的抗體水平良好，免疫效果一般，防疫工作要進一步加強，努力做得更好。除此之外， C 鎮(zhèn)、 G 鎮(zhèn)、 H 鎮(zhèn)和 L 鎮(zhèn)的抗體水平不達標（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，鴨禽流感 H5亞型的防疫工作還應進一步扎實。

結合表1 、2可知，檢測的289份鴨血清中，鴨禽流感 H5、H7 亞型免疫抗體陽性數(shù)分別是249、203份，合格率分別是86%、70%，H5、H7亞型免疫抗體合格率均達到國家標準。

3? 討論與結論

從檢測結果上看，儋州市鴨禽流感 H5和 H7亞型整體免疫效果良好，免疫抗體合格率均達到了國家標準，表明2020年春季儋州市的鴨總體上已建立起較好的免疫機能屏障，禽流感流行風險較低;但同時地存在少數(shù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)禽流感抗體水平較低的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能與鴨群產(chǎn)生抗體時間、疫苗的質量、免疫操作的規(guī)范程度、鴨群的飼養(yǎng)環(huán)境、鴨機體的健康情況等因素有關[15-18]。

從不同類型鴨禽流感免疫抗體水平上看， H5亞型抗體合格率整體高于 H7 亞型，這與冬春季節(jié)的防疫工作落實情況、水禽機體有關，也可能與不同疫苗毒株有不同的免疫原性有關[14，19]。

從檢測結果可知，2020年春季儋州市鴨禽流感 H5以及 H7合格率分別是86%、70%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的標準。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)苗的免疫效果較好，有較強的保護力。同時，針對抗體水平合格率不達標的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，建議全面排查原因，及時補免，進一步提高免疫抗體合格率，強化免疫屏障。

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（責任編輯林海妹）