田洪達，李忠原，郝利國，高曉隆，劉強，李春香

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161041

國內(nèi)，甲狀腺癌處于內(nèi)分泌惡性腫瘤發(fā)病率前列[1]，女性甲狀腺癌的發(fā)病率逐年升高。其中，年齡60 歲以上的人群中，甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病率高達50%～70%[2]。未分化甲狀腺癌的惡性程度遠高于其他種類的甲狀腺癌，臨床癥狀主要為瘤組織腫大壓迫氣管造成的呼吸困難，同時伴有遠處轉(zhuǎn)移等。目前影像學(xué)對甲狀腺癌的早期定性診斷仍具有一定的局限性，隨著技術(shù)的進步，分子影像學(xué)發(fā)展迅速，使多模態(tài)納米探針對于明確未分化甲狀腺癌的診斷和進展成為可能。分子探針是實現(xiàn)分子影像顯像的核心技術(shù)，是一種功能性物質(zhì)，能精確地體現(xiàn)特定對象的生物學(xué)問題[3]。目前磁共振成像中，常用釓劑做增強對比劑，其毒性低且改變了病變的信號，提高了與周圍正常組織的對比度，但缺乏靶向性。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor，Her2），可 特 異 性 與 細 胞 結(jié) 構(gòu) 域II 結(jié)合[4]。不僅可以在乳腺癌中表達，還在多種甲狀腺癌中表達擴增[5-6]。結(jié)合目前的分子影像學(xué)發(fā)展，可以通過以Her2 為靶點，合成一種以磁共振造影劑Gd3+、熒光染料Cy5.5、靶向物質(zhì)pertuzumab 偶聯(lián)的雙模態(tài)探針，并檢測其表征。

1 材料與方法

1.1 材料來源

粒度分析儀（NICOMP-380ZLS，美國PSS）；熒光分光分度計（RF-5301PC，日本島津）；準(zhǔn)雙光束紫外可見分光光度計（UV-3802，尤尼柯（上海）儀器有限公司）；核磁共振造影劑馳豫率分析與成像系統(tǒng)（NM120，蘇州紐邁公司）；超聲波清洗器（XM-3200UVF，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；集熱式磁力攪拌器（DF-101S，上海力辰儀器科技有限公司）；萬分之一天平[QUINTIX65-1CN，賽多利斯（德國）集團]；熒光染料Cy5.5、pertuzumab 購自上海前衍生物科技有限公司；EDC-HCl、NHS 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

雙模態(tài)探針Gd-Cy5.5-pertuzumab 的制備包括DOTA-pertuzumab 的合成和Gd-Cy5.5-Pertuzumab的合成。

1.2.1 DOTA-pertuzumab 的合成 將2 mg pertuzumab稀釋在400 μl 無菌的PBS 中，加入0.1 M 碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液pH 為8.4，加入40 mg p-SCN-Bn-DOTA，使pertuzumab 與p-SCN-Bn-DOTA 的摩爾比為1∶10[7-8]。溶液混合后在室溫下振蕩反應(yīng)12 h。反應(yīng)物用30kD 超濾管分離純化，除去未反應(yīng)的p-SCNBn-DOTA，得到產(chǎn)物DOTA-pertuzumab，備用復(fù)合物-20℃保存。

1.2.2 Gd-Cy5.5-Pertuzumab 的合成 ①稱取GdCl3-6H2O 20 mg，溶于20 mL PBS 中，加入碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH 為8.4。將此溶液與上述溶液混合反應(yīng)6 h。最后用10 kD 超濾管超濾，除去未反應(yīng)的GdCl3-6H2O，得到產(chǎn)物Gd-DOTA-pertuzumab，然后備用的復(fù)合物4℃保存。②稱取0.5 mgEDC 和0.5 mgNHS，加入上述產(chǎn)物中，在室溫下放于恒溫振蕩器上活化1 h，將活化的溶液與200 μg Cy5.5 熒光染料混合，測得pH 為8.4。然后在室溫下，搖床孵育2 h。反應(yīng)結(jié)束后，用10kD 超濾管除去未反應(yīng)的Cy5.5。得到產(chǎn)物Gd-Cy5.5-pertuzumab。用上述方法制作Gd-DOTA-Cy5.5 作為熒光成像對照組。

1.3 觀察指標(biāo)

Gd-Cy5.5-Pertuzumab 的表征檢測包括透射電鏡尺寸的檢測、水動力尺寸及zeta 電位的測定、光學(xué)性質(zhì)表征和弛豫率的測定。 ①透射電鏡尺寸的檢測：取適量Gd-Cy5.5-pertuzumab 溶液，用水作分散劑超聲探頭分散后，用滴管取一滴懸浮液滴于銅網(wǎng)上，干燥后，通過生物透射電鏡下觀察合成物的形態(tài)及粒徑大小。 ②水動力尺寸及zeta 電位的測定：取100 μl Gd-Cy5.5-pertuzumab 溶液，加入去離子水稀釋后，移入Eppendorf 管中，在超聲波清洗機中振蕩15 min，使得納米顆粒均勻分散，然后移入到比色皿中，通過動態(tài)光散射測量納米粒子的水動力尺寸和zeta 電位。 ③光學(xué)性質(zhì)表征：各取Gd-Cy5.5-pertuzumab、Gd-DOTA-pertuzumab 溶液3 mL，移入石英比色皿中，用熒光檢測儀分別兩種樣品進行熒光成像。 ④弛豫率的測定：取適量納米探針溶液，用去離子水稀釋探針，得到不同濃度梯度的Gd:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM。將稀釋后的不同濃度的Gd 各取1 mL 放于Eppendorf 管，濃度由低到高標(biāo)記為1、2、3、4、5 號。每次取一個置于紐邁小核磁分析儀中，磁體探頭選擇Meso60～60 mm，序列為IR。將1～5 號Eppendorf 置于試管架上，放于3.0MRI頭部線圈中，進行磁共振T1序列掃描。

2 結(jié)果

2.1 納米探針的表征

透射電鏡結(jié)果顯示，納米探針Gd-Cy5.5-pertuzumab 的形態(tài)為圓形，內(nèi)部黑色顆粒為多個釓原子，周圍由pertuzumab 和Cy5.5 包裹呈現(xiàn)出球狀，大小較均勻，見圖1。Gd-Cy5.5-pertuzumab 水合粒徑尺寸為（133.17±11.14）nm，探針分布尺寸窄，分散性較好，見圖2。zeta 電位為（-34.58±7.91）mV，zeta 電位表明了合成物的穩(wěn)定性，正值越大或負值越小說明越穩(wěn)定。

圖1 Gd-Cy5.5-pertuzumab TEM

圖2 Gd-Cy5.5-pertuzumab 納米探針?biāo)狭匠叽?/p>

2.2 Gd-DOTA-pertuzumab 和 Gd-Cy5.5-pertuzumab 熒光強度

探針在600 nm 處激發(fā)，685 nm 處有明顯吸收峰，與熒光染料Cy5.5 的發(fā)射波長一致，表明Cy5.5偶聯(lián)成功。而未偶聯(lián)熒光染料的Gd-DOTApertuzumab，沒有熒光信號，見圖3。

圖3 Gd-DOTA-pertuzumab 和Gd-Cy5.5-pertuzumab 熒光強度

2.3 Gd-Cy5.5-Pertuzumab 弛豫率

經(jīng)3.0T 磁共振T1掃描顯示隨著Gd 濃度增加信號強度明顯增強，見圖4。運用紐邁小核磁檢測不同濃度的Gd-Cy5.5-Pertuzumab：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM 的T1時間。經(jīng)OriginPro 2017 線性擬合得出，r1 的弛豫率為27.848 3 mM-1S-1，見圖5。

圖4 Gd-Cy5.5-pertuzumab 磁共振成像

圖5 Gd-Cy5.5-pertuzumab 弛豫率

3 討論

甲狀腺癌在我國發(fā)病率逐年升高、在內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤中越來越常見[9-10]。傳統(tǒng)的檢查方式（如X線、CT、超聲）具有一定的輻射損傷和滯后性[11]。而運用分子影像學(xué)的手段，能更有效反映活體狀態(tài)下組織、細胞水平的變化，并且可以對其生物學(xué)行為在影像方面進行定性、定量研究[12]。

目前，雙模態(tài)探針的制備在分子影像中逐步成為主流[13-14]。磁共振成像是診斷腫瘤最有效的分子影像學(xué)工具之一，具有高分辨率，無電離輻射等優(yōu)點，釓劑是目前臨床上常用的、成熟的磁共振造影劑[15]，通常通過注入釓劑來改變病變組織信號，以達到檢測和診斷的目的。因此，實驗中以釓劑為磁共振成像材料，通過T1成像，增加腫瘤組織與正常組織之間的對比度[16-17]。熒光染料Cy5.5 具有較高的生物安全性、穩(wěn)定性、熒光強度高，毒性低等特點。在小動物活體實驗時，利用小動物熒光成像有望代替有輻射性的核素成像。納米級分子探針在腫瘤中具有較好的滲透性和弛豫時間，可與腫瘤表面的受體特異性結(jié)合。研究表明，Her2 在甲狀腺未分化癌細胞8505C 中具有較高的表達，對甲狀腺腫瘤的良惡性診斷有一定意義[18-19]。實驗利用p-SCN-Bn-DOTA 雙功能螯合物，連接Gd、Cy5.5、pertuzumab，合成一種以Her2 為潛在靶點、具有磁共振和熒光雙模態(tài)特點的納米探針。據(jù)報道，有40%的未分化甲狀腺癌患者會發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此研究一種新的雙模態(tài)探針檢測甲狀腺癌的早期病灶具有重要意義，利用帶有pertuzumab 的探針與病灶中的Her2 特異性結(jié)合，實現(xiàn)腫瘤靶向成像，從而能在疾病早期診斷出病變。本實驗中制備的Gd-Cy5.5-pertuzumab 雙模態(tài)探針具有良好的穩(wěn)定性，其形態(tài)均勻、分散性良好。測得探針的粒徑大小為（133.17±11.14）nm，zeta 電位為（-34.58±7.91）mV，當(dāng)zeta 電位小于-30 mV 時表明該納米探針就有較好的穩(wěn)定性。通過紐邁小核磁和MRI 檢測出弛豫率為27.848 3 mM-1S-1，弛豫率高于傳統(tǒng)的Gd-DTPA（5.83 mM-1S-1）[20]，且探針隨濃度的增大T1信號強度也逐漸增高。

綜上所述，本實驗合成的磁共振/熒光雙模態(tài)探針Gd-Cy5.5-Pertuzumab，具有大小均勻、性質(zhì)穩(wěn)定的特點。該探針有望為甲狀腺癌早期診斷提供預(yù)警，并且可以為患者的治療方案提供指導(dǎo)。