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        芬太尼通過ILF3-AS1/miR-132對卵巢癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響

        2022-04-04 07:09:16何含劉群鐘慶翁艷汪艷黃凡鄔瑞剛楊國仁
        安徽醫(yī)藥 2022年4期
        關(guān)鍵詞:水平

        何含,劉群,鐘慶,翁艷,汪艷,黃凡,鄔瑞剛,楊國仁

        卵巢癌是女性常見惡性腫瘤之一,手術(shù)是其主要治療方式[1]。芬太尼是臨床常用麻醉藥,麻醉效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)芬太尼可能通過抑制Src 通路活化抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[2],芬太尼還可抑制胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖[3]。然而芬太尼對卵巢癌細(xì)胞作用的研究仍然缺乏。研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1(interleukin enhancer binding factor 3 antisense RNA1,ILF3-AS1)在黑色素瘤組織中高表達(dá),可促進(jìn)黑色素瘤的增殖,遷移和侵襲[4]。微小RNA(miRNA/miR)的異常表達(dá)也與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如卵巢癌組織中miR-132 低表達(dá),過表達(dá)miR-132能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,侵襲和遷移[5]。本研究于2018 年8 月至2019 年10 月,體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞A2780,重點(diǎn)考察芬太尼是否通過ILF3-AS1和miR-132 影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲行為。為芬太尼能更好地應(yīng)用于卵巢癌手術(shù)治療,提高卵巢癌病人的治療療效提供理論及參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料卵巢癌細(xì)胞A2780購自武漢Procell Life公司;四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司;二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)試劑盒、結(jié)晶紫購自碧云天生物技術(shù)研究所;Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)試劑盒購自日本 Takara 公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌A2780 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中,保持在37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境中生長。

        1.2.2 細(xì)胞處理與分組 A2780 細(xì)胞用0、0.5、5、50、500 ng/mL濃度芬太尼處理A2780細(xì)胞,作為不同濃度芬太尼處理組。A2780細(xì)胞分別按照美國Invitrogen 制造的LipofectamineTM2000 試劑操作規(guī)程,進(jìn)行過表達(dá)ILF3-AS1(pcDNA3.1-ILF3-AS1、對照pcDNA3.1)、抑制miR-132 表達(dá)(抗-miR-132、對照antimiR-NC)轉(zhuǎn)染,8 h 后給予500 ng/mL 芬太尼,作為芬太 尼500+(pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、antimiR-NC、anti-miR-132)組。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、si-NC、si-ILF3-AS1 轉(zhuǎn)染至A2780 細(xì)胞中,記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-ILF3-AS1組、si-NC組、si-ILF3-AS1組,轉(zhuǎn)染48 h測量miR-132表達(dá)。

        1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測P21、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表達(dá) 每組A2780 細(xì)胞總蛋白應(yīng)用RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行抽提,經(jīng)過BCA 法定量。取60 μg 蛋白上樣、SDS-PAGE 后,轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)上。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1.5 h,分別加入相應(yīng)的一抗(4 ℃)過夜:周期蛋白依賴性激酶抑制因子(P21)抗體、E-cadherin 抗體、MMP-2 抗體,隨后加入二抗(室溫)孵育2 h,并通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行觀察,凝膠分析軟件Quantity One 測定各組蛋白條帶相對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的灰度值。

        1.2.4 MTT 檢測細(xì)胞存活率 每組A2780 細(xì)胞在96 孔板中培養(yǎng)48 h 時(shí),與20 μL 的MTT 溶液反應(yīng)4 h,結(jié)晶以二甲基亞砜150 μL 溶解,在490 nm 處,用Thermo FC酶標(biāo)儀測量吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%。

        1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù) 每組A2780細(xì)胞接種于六孔板(500個(gè)/孔),用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d,用甲醇固定細(xì)胞集落并用結(jié)晶紫染色30 min,在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)集落(>50個(gè)細(xì)胞)。

        1.2.6 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 將600 μL RPMI-1640 完全培養(yǎng)液加至Transwell 下室,將無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液配制的200 μL A2780 細(xì)胞懸液加入Transwell 上室。其中,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中,Transwell 的上室事先鋪有100 μL 無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋的Matrigel,而細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)未鋪Matrigel。培養(yǎng)24 h后,下層細(xì)胞用多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡觀察、計(jì)算侵襲或遷移細(xì)胞數(shù)。

        1.2.7 RT-qPCR 檢 測ILF3-AS1 和miR-132 的表達(dá)水平各組A2780 細(xì)胞培養(yǎng)48 h,Trizol 試劑進(jìn)行總RNA 提取,互補(bǔ)DNA(cDNA)由1 μg 總RNA 通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成,在ABI7500 PCR 儀上通過熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR。ILF3-AS1 和miR-132 相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列(5'-3'):ILF3-AS1 正向引物:TAAACCCCACTGTCTTCC,反向引物:TTCCTTGCTCTTCTTGCTC;lncRNA 內(nèi)參GAPDH 正向引物:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT,反向引物:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG;miR-132正向引物:ACCGTGGCTTTCGATTGTTA,反向引物:GGCGACCATGGCTGTAGACT;miRNA內(nèi)參U6正向引物:CGCTTCGGCAGCACATATACTA,反向引物:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA。

        1.2.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測ILF3-AS1 與miR-132 的靶向結(jié)合 分別合成miR-132 結(jié)合位點(diǎn)的ILF3-AS1 的野生型(WT)和突變型(MUT)序列,并插入熒光素酶表達(dá)載體,構(gòu)建WT-ILF3-AS1 和MUT-ILF3-AS1 熒光素酶表達(dá)載體,將上述載體分別與miR-NC 或miR-132 共轉(zhuǎn)染A2780 細(xì)胞。按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0 分析,計(jì)量資料用表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 增殖、遷移、侵襲的影響5 ng/mL 以上濃度芬太尼處理的卵巢癌細(xì)胞A2780 中P21、E-cadherin 表達(dá)水平比未經(jīng)芬太尼處理以及0.5 ng/mL 濃度芬太尼處理的A2780 細(xì)胞逐漸升高,MMP-2 表達(dá)水平、存活率、克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均比未經(jīng)芬太尼處理以及0.5 ng/mL 濃度芬太尼處理的A2780 細(xì)胞逐漸降低(P<0.05),見圖1、圖2、表1。

        圖2 芬太尼對P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

        表1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的影響/

        表1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的影響/

        注:P21為周期蛋白依賴性激酶抑制因子,E-cadherin為E鈣黏蛋白,MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與0 ng/mL組比較,P<0.05。②與0.5 ng/mL組比較,P<0.05。

        2.2 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1、miR-132 表達(dá)的影響與未經(jīng)芬太尼處理以及0.5 ng/mL 濃度芬太尼處理的細(xì)胞相比,5 ng/mL 以上濃度芬太尼處理的卵巢癌細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1 表達(dá)水平顯著降低,miR-132 表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見表2。

        表2 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780中ILF3-AS1、miR-132表達(dá)的影響/

        表2 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780中ILF3-AS1、miR-132表達(dá)的影響/

        注:ILF3-AS1 為白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1,miR-132為微小RNA-132。①與0 ng/mL組比較,P<0.05;②與0.5 ng/mL組比較,P<0.05。

        2.3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 增殖、遷移、侵襲的抑制作用芬太尼500+pcDNA3.1-ILF3-AS1 組卵巢癌細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1表達(dá)水平比芬太尼500+pcDNA3.1組顯著升高,P21、E-cadherin 表達(dá)水平比芬太尼500+pcDNA3.1組顯著降低,MMP-2 表達(dá)水平、存活率和細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)也比芬太尼500+pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)(圖3、圖4、表3)。

        表3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

        表3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

        注:ILF3-AS1 為白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1,P21 為周期蛋白依賴性激酶抑制因子,E-cadherin 為E 鈣黏蛋白,MMP-2 為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。

        圖4 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

        2.4 抑制miR-132 能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 增殖、遷移、侵襲的抑制作用芬太尼500+anti-miR-132 組卵巢癌細(xì)胞A2780 中miR-132 表達(dá)水平低于芬太尼500+anti-miR-NC 組,P21、E-cadherin 表達(dá)水平也低于芬太尼500+anti-miR-NC 組,MMP-2 表達(dá)水平、存活率高于芬太尼500+anti-miRNC組,細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)也高于芬太尼500+anti-miR-NC組(P<0.05)(圖5、圖6、表4)。

        表4 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

        表4 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

        注:miR-132為微小RNA-132,P21為周期蛋白依賴性激酶抑制因子,E-cadherin為E鈣黏蛋白,MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。

        圖6 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

        2.5 ILF3-AS1 靶 向、調(diào) 控miR-132ILF3-AS1 與miR-132 的結(jié)合位點(diǎn)見圖7。miR-132 組中WTILF3-AS1 熒光素酶活性比miR-NC 組顯著降低約0.67 倍(P<0.05)(表5)。pcDNA3.1-ILF3-AS1 組miR-132表達(dá)水平(0.22±0.02)比pcDNA3.1組(1.01±0.10)下降(P<0.05),si-ILF3-AS1 組miR-132 表達(dá)水平(2.55±0.25)比si-NC 組(0.98±0.10)升 高(P<0.05)。

        圖7 ILF3-AS1與miR-132的結(jié)合位點(diǎn)

        表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/

        表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/

        注:WT-ILF3-AS1 為野生型白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1,MUT-ILF3-AS1 為突變型白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1。

        3 討論

        芬太尼除麻醉作用外,研究顯示芬太尼濃度大于5 ng/mL 時(shí)能抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6],促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7];還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人乳腺癌干細(xì)胞腫瘤發(fā)生[8]。為研究芬太尼對卵巢癌的影響,本實(shí)驗(yàn)分別用不同濃度的芬太尼處理卵巢癌細(xì)胞A2780,結(jié)果顯示,當(dāng)芬太尼濃度大于5 ng/mL 時(shí),A2780 細(xì)胞中P21、E-cadherin 上調(diào),MMP-2 下調(diào),細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)及遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)同樣減少。P21 是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子,表達(dá)增加能阻止細(xì)胞周期發(fā)展,從而抑制細(xì)胞增殖[9]。間質(zhì)轉(zhuǎn)化的上皮標(biāo)志物E-cadherin,高表達(dá)可阻礙細(xì)胞轉(zhuǎn)移;MMP-2 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,用于評估細(xì)胞遷移、侵襲能力[10]。說明當(dāng)芬太尼濃度大于5 ng/mL時(shí)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

        研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中可能扮演著癌基因或抑癌基因的角色[11-13]。如敲低ILF3-AS1 可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14];可抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲[15]。且還有研究報(bào)道ILF3-AS1 與宮頸癌病人總體生存期限相關(guān),可作為宮頸癌預(yù)后生物標(biāo)志物[16]。ILF3-AS1 還可以有效區(qū)分結(jié)腸癌病人癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)高低[17]。然而ILF3-AS1 對卵巢癌細(xì)胞的影響還尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,濃度大于5 ng/mL 芬太尼處理的細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1 表達(dá)水平顯著降低。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示芬太尼處理卵巢癌細(xì)胞的同時(shí)過表達(dá)ILF3-AS1,提示,芬太尼抑制卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的作用被過表達(dá)ILF3-AS1 所逆轉(zhuǎn),可見芬太尼可能通過下調(diào)ILF3-AS影響卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

        本研究結(jié)果顯示證實(shí)ILF3-AS1 可靶向調(diào)控miR-132。已有研究表明miR-132 可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。miR-132 過表達(dá)還可增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性,并抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度大于5 ng/mL 芬太尼處理的卵巢癌細(xì)胞A2780 中miR-132 表達(dá)水平顯著升高,而抑制miR-132 能逆轉(zhuǎn)芬太尼減弱卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的結(jié)果,因此,芬太尼對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響還與miR-132有關(guān)。

        綜上所述,芬太尼濃度大于5 ng/mL 時(shí)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其機(jī)制可能與調(diào)控ILF3-AS1/miR-132表達(dá)有關(guān)。

        (本文圖1,3,5見插圖4-2)

        圖1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200) 圖3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200) 圖5 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200)

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