何含，劉群，鐘慶，翁艷，汪艷，黃凡，鄔瑞剛，楊國仁

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤之一，手術(shù)是其主要治療方式［1］。芬太尼是臨床常用麻醉藥，麻醉效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)芬太尼可能通過抑制Src 通路活化抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［2］，芬太尼還可抑制胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖［3］。然而芬太尼對卵巢癌細(xì)胞作用的研究仍然缺乏。研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1（interleukin enhancer binding factor 3 antisense RNA1，ILF3-AS1）在黑色素瘤組織中高表達(dá)，可促進(jìn)黑色素瘤的增殖，遷移和侵襲［4］。微小RNA（miRNA/miR）的異常表達(dá)也與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如卵巢癌組織中miR-132 低表達(dá)，過表達(dá)miR-132能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移［5］。本研究于2018 年8 月至2019 年10 月，體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞A2780，重點(diǎn)考察芬太尼是否通過ILF3-AS1和miR-132 影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲行為。為芬太尼能更好地應(yīng)用于卵巢癌手術(shù)治療，提高卵巢癌病人的治療療效提供理論及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌細(xì)胞A2780購自武漢Procell Life公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、結(jié)晶紫購自碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購自日本 Takara 公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌A2780 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，保持在37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境中生長。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組 A2780 細(xì)胞用0、0.5、5、50、500 ng/mL濃度芬太尼處理A2780細(xì)胞，作為不同濃度芬太尼處理組。A2780細(xì)胞分別按照美國Invitrogen 制造的LipofectamineTM2000 試劑操作規(guī)程，進(jìn)行過表達(dá)ILF3-AS1（pcDNA3.1-ILF3-AS1、對照pcDNA3.1）、抑制miR-132 表達(dá)（抗-miR-132、對照antimiR-NC）轉(zhuǎn)染，8 h 后給予500 ng/mL 芬太尼，作為芬太 尼500+（pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、antimiR-NC、anti-miR-132）組。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、si-NC、si-ILF3-AS1 轉(zhuǎn)染至A2780 細(xì)胞中，記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-ILF3-AS1組、si-NC組、si-ILF3-AS1組，轉(zhuǎn)染48 h測量miR-132表達(dá)。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測P21、E鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表達(dá) 每組A2780 細(xì)胞總蛋白應(yīng)用RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行抽提，經(jīng)過BCA 法定量。取60 μg 蛋白上樣、SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）上。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1.5 h，分別加入相應(yīng)的一抗（4 ℃）過夜：周期蛋白依賴性激酶抑制因子（P21）抗體、E-cadherin 抗體、MMP-2 抗體，隨后加入二抗（室溫）孵育2 h，并通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行觀察，凝膠分析軟件Quantity One 測定各組蛋白條帶相對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值。

1.2.4 MTT 檢測細(xì)胞存活率 每組A2780 細(xì)胞在96 孔板中培養(yǎng)48 h 時(shí)，與20 μL 的MTT 溶液反應(yīng)4 h，結(jié)晶以二甲基亞砜150 μL 溶解，在490 nm 處，用Thermo FC酶標(biāo)儀測量吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù) 每組A2780細(xì)胞接種于六孔板（500個(gè)/孔），用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，用甲醇固定細(xì)胞集落并用結(jié)晶紫染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)集落（＞50個(gè)細(xì)胞）。

1.2.6 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 將600 μL RPMI-1640 完全培養(yǎng)液加至Transwell 下室，將無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液配制的200 μL A2780 細(xì)胞懸液加入Transwell 上室。其中，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell 的上室事先鋪有100 μL 無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋的Matrigel，而細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)未鋪Matrigel。培養(yǎng)24 h后，下層細(xì)胞用多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察、計(jì)算侵襲或遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 RT-qPCR 檢 測ILF3-AS1 和miR-132 的表達(dá)水平各組A2780 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，Trizol 試劑進(jìn)行總RNA 提取，互補(bǔ)DNA（cDNA）由1 μg 總RNA 通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成，在ABI7500 PCR 儀上通過熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR。ILF3-AS1 和miR-132 相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列（5'-3'）：ILF3-AS1 正向引物：TAAACCCCACTGTCTTCC，反向引物：TTCCTTGCTCTTCTTGCTC；lncRNA 內(nèi)參GAPDH 正向引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，反向引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；miR-132正向引物：ACCGTGGCTTTCGATTGTTA，反向引物：GGCGACCATGGCTGTAGACT；miRNA內(nèi)參U6正向引物：CGCTTCGGCAGCACATATACTA，反向引物：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測ILF3-AS1 與miR-132 的靶向結(jié)合 分別合成miR-132 結(jié)合位點(diǎn)的ILF3-AS1 的野生型（WT）和突變型（MUT）序列，并插入熒光素酶表達(dá)載體，構(gòu)建WT-ILF3-AS1 和MUT-ILF3-AS1 熒光素酶表達(dá)載體，將上述載體分別與miR-NC 或miR-132 共轉(zhuǎn)染A2780 細(xì)胞。按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0 分析，計(jì)量資料用表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 增殖、遷移、侵襲的影響5 ng/mL 以上濃度芬太尼處理的卵巢癌細(xì)胞A2780 中P21、E-cadherin 表達(dá)水平比未經(jīng)芬太尼處理以及0.5 ng/mL 濃度芬太尼處理的A2780 細(xì)胞逐漸升高，MMP-2 表達(dá)水平、存活率、克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均比未經(jīng)芬太尼處理以及0.5 ng/mL 濃度芬太尼處理的A2780 細(xì)胞逐漸降低（P＜0.05），見圖1、圖2、表1。

圖2 芬太尼對P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

表1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的影響/

表1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的影響/

注：P21為周期蛋白依賴性激酶抑制因子，E-cadherin為E鈣黏蛋白，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與0 ng/mL組比較，P＜0.05。②與0.5 ng/mL組比較，P＜0.05。

2.2 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1、miR-132 表達(dá)的影響與未經(jīng)芬太尼處理以及0.5 ng/mL 濃度芬太尼處理的細(xì)胞相比，5 ng/mL 以上濃度芬太尼處理的卵巢癌細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1 表達(dá)水平顯著降低，miR-132 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780中ILF3-AS1、miR-132表達(dá)的影響/

表2 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780中ILF3-AS1、miR-132表達(dá)的影響/

注：ILF3-AS1 為白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1，miR-132為微小RNA-132。①與0 ng/mL組比較，P＜0.05；②與0.5 ng/mL組比較，P＜0.05。

2.3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 增殖、遷移、侵襲的抑制作用芬太尼500+pcDNA3.1-ILF3-AS1 組卵巢癌細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1表達(dá)水平比芬太尼500+pcDNA3.1組顯著升高，P21、E-cadherin 表達(dá)水平比芬太尼500+pcDNA3.1組顯著降低，MMP-2 表達(dá)水平、存活率和細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)也比芬太尼500+pcDNA3.1組顯著升高（P＜0.05）（圖3、圖4、表3）。

表3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

表3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

注：ILF3-AS1 為白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1，P21 為周期蛋白依賴性激酶抑制因子，E-cadherin 為E 鈣黏蛋白，MMP-2 為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。

圖4 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

2.4 抑制miR-132 能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780 增殖、遷移、侵襲的抑制作用芬太尼500+anti-miR-132 組卵巢癌細(xì)胞A2780 中miR-132 表達(dá)水平低于芬太尼500+anti-miR-NC 組，P21、E-cadherin 表達(dá)水平也低于芬太尼500+anti-miR-NC 組，MMP-2 表達(dá)水平、存活率高于芬太尼500+anti-miRNC組，細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)也高于芬太尼500+anti-miR-NC組（P＜0.05）（圖5、圖6、表4）。

表4 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

表4 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的抑制作用/

注：miR-132為微小RNA-132，P21為周期蛋白依賴性激酶抑制因子，E-cadherin為E鈣黏蛋白，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。

圖6 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

2.5 ILF3-AS1 靶 向、調(diào) 控miR-132ILF3-AS1 與miR-132 的結(jié)合位點(diǎn)見圖7。miR-132 組中WTILF3-AS1 熒光素酶活性比miR-NC 組顯著降低約0.67 倍（P＜0.05）（表5）。pcDNA3.1-ILF3-AS1 組miR-132表達(dá)水平（0.22±0.02）比pcDNA3.1組（1.01±0.10）下降（P＜0.05），si-ILF3-AS1 組miR-132 表達(dá)水平（2.55±0.25）比si-NC 組（0.98±0.10）升 高（P＜0.05）。

圖7 ILF3-AS1與miR-132的結(jié)合位點(diǎn)

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/

注：WT-ILF3-AS1 為野生型白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1，MUT-ILF3-AS1 為突變型白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 反義RNA1。

3 討論

芬太尼除麻醉作用外，研究顯示芬太尼濃度大于5 ng/mL 時(shí)能抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲［6］，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］；還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人乳腺癌干細(xì)胞腫瘤發(fā)生［8］。為研究芬太尼對卵巢癌的影響，本實(shí)驗(yàn)分別用不同濃度的芬太尼處理卵巢癌細(xì)胞A2780，結(jié)果顯示，當(dāng)芬太尼濃度大于5 ng/mL 時(shí)，A2780 細(xì)胞中P21、E-cadherin 上調(diào)，MMP-2 下調(diào)，細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)及遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)同樣減少。P21 是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，表達(dá)增加能阻止細(xì)胞周期發(fā)展，從而抑制細(xì)胞增殖［9］。間質(zhì)轉(zhuǎn)化的上皮標(biāo)志物E-cadherin，高表達(dá)可阻礙細(xì)胞轉(zhuǎn)移；MMP-2 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，用于評估細(xì)胞遷移、侵襲能力［10］。說明當(dāng)芬太尼濃度大于5 ng/mL時(shí)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中可能扮演著癌基因或抑癌基因的角色［11-13］。如敲低ILF3-AS1 可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］；可抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［15］。且還有研究報(bào)道ILF3-AS1 與宮頸癌病人總體生存期限相關(guān)，可作為宮頸癌預(yù)后生物標(biāo)志物［16］。ILF3-AS1 還可以有效區(qū)分結(jié)腸癌病人癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)高低［17］。然而ILF3-AS1 對卵巢癌細(xì)胞的影響還尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度大于5 ng/mL 芬太尼處理的細(xì)胞A2780 中ILF3-AS1 表達(dá)水平顯著降低。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示芬太尼處理卵巢癌細(xì)胞的同時(shí)過表達(dá)ILF3-AS1，提示，芬太尼抑制卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的作用被過表達(dá)ILF3-AS1 所逆轉(zhuǎn)，可見芬太尼可能通過下調(diào)ILF3-AS影響卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

本研究結(jié)果顯示證實(shí)ILF3-AS1 可靶向調(diào)控miR-132。已有研究表明miR-132 可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。miR-132 過表達(dá)還可增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，并抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［19］。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度大于5 ng/mL 芬太尼處理的卵巢癌細(xì)胞A2780 中miR-132 表達(dá)水平顯著升高，而抑制miR-132 能逆轉(zhuǎn)芬太尼減弱卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲的結(jié)果，因此，芬太尼對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響還與miR-132有關(guān)。

綜上所述，芬太尼濃度大于5 ng/mL 時(shí)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與調(diào)控ILF3-AS1/miR-132表達(dá)有關(guān)。

（本文圖1，3，5見插圖4-2）

圖1 芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200） 圖3 過表達(dá)ILF3-AS1能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200） 圖5 抑制miR-132能逆轉(zhuǎn)芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）