張龍，王瑞，趙佳

肺癌早期缺乏明顯臨床癥狀，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，五年生存率依然較低［1-3］。探究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可為其治療提供分子靶點(diǎn)［4-6］。腫瘤蛋白翻譯控制1（TPT1）的反義RNA 1（TPT1-AS1）是一種在胃癌［7］、上皮性卵巢癌［8］等腫瘤中表達(dá)升高的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），其促進(jìn)這些腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。然而，TPT1-AS1 能否影響肺癌的發(fā)生發(fā)展還未知。Starbase 生物信息軟件預(yù)測(cè)顯示，TPT1-AS1 可能與微小RNA-671-5p（miR-671-5p）結(jié)合。miR-671-5p在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物［9］。本研究以TPT1-AS1/miR-671-5p軸為切入點(diǎn)，探究了肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料46 例肺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織取自于2017 年1 月至2018 年12 月在信陽(yáng)市中心醫(yī)院確診并行手術(shù)治療的肺癌病人，其中男28 例，女18例，年齡（63.25±8.76）歲；肺腺癌21 例，肺鱗癌25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理確診為非小細(xì)胞肺癌病人；（2）術(shù)前未進(jìn)行放療、化療。病人知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑A549 細(xì)胞系，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、RPMI 1640 培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒、MTT 和LipofectamineTM2000 試劑盒，北京索萊寶；PCR 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒，大連寶生物工程有限公司；胎牛血清，浙江天杭；引物序列、TPT1-AS1小干擾RNA（si-TPT1-AS1）和過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-TPT1-AS1）、小干擾RNA陰性序列（si-NC）、空載體（pcDNA）、TPT1-AS1野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告載體、miR-671-5p 模擬物（mimcs）、抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）、miR-671-5p抑制劑（anti-miR-671-5p）、模擬對(duì)照序列（miR-NC），上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)所需抗體，美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)組織中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表達(dá)組織中總RNA 經(jīng)Trizol試劑提取后，逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA（cDNA），行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：先設(shè)置溫度為95 ℃，進(jìn)行預(yù)變性處理，時(shí)間為10 min。然后95 ℃條件下變性30 s，之后設(shè)置溫度為58 ℃進(jìn)行退火，時(shí)間為30 s；最后再設(shè)置溫度為72 ℃進(jìn)行延伸，時(shí)間為30 s，循環(huán)此過(guò)程，共35 個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。2-ΔΔCt法計(jì)算組織中TPT1-AS1 相對(duì)GAPDH、miR-671-5p 相對(duì)U6 的表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用完全培養(yǎng)基（含10 %FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基）培養(yǎng)A549細(xì)胞。將A549細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。培養(yǎng)12 h 后，將LipofectamineTM2000 試劑分別與si-NC（si-NC 組）、si-TPT1-AS1（si-TPT1-AS1 組）、pcDNA-TPT1-AS1（pcDNA-TPT1-AS1 組）、pcDNA（pcD-NA組）、共轉(zhuǎn)染si-TPT1-AS1與anti-miR-NC（si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組）、si-TPT1-AS1 與anti-miR-671-5p（si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 組）混合均勻，取100 μL 混合液緩慢加至6 孔板中，孵育細(xì)胞6 h。然后利用RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞中TPT1-AS1 或miR-671-5p表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將A549 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。培養(yǎng)12 h 后，將LipofectamineTM2000 試劑分別 與TPT1-AS1-WT 和miR-671-5p mimic（或miR-NC）、TPT1-AS1-MUT 和miR-671-5p mimic（miR-NC）混合均勻，取100 μL 混合液緩慢加至6 孔板中，孵育細(xì)胞6 h。然后收集細(xì)胞細(xì)胞并裂解，3 500 r/min 離心10 min。取20 μL 上清液，將其與100 μL 1×螢火蟲(chóng)或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液混合均勻，檢測(cè)螢火蟲(chóng)或海腎的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。

1.3.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為2.5×104個(gè)。同時(shí)設(shè)對(duì)照組：接種未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，取5 g/L 的MTT 加至各孔（20 μL/孔），將細(xì)胞孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加二甲基亞砜（150 μL/孔），反應(yīng)5 min，振蕩均勻。將96 孔板放入酶標(biāo)儀檢測(cè)卡槽中，設(shè)置λ 為490 nm，測(cè)各孔吸光度（A）值。存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.3.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移：取100 μL 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞加至Transwell 小室上室，每室細(xì)胞數(shù)為1.0×104個(gè)。另取500 μL 完全培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，將下室細(xì)胞依次固定、染色后，顯微鏡觀察，拍照并計(jì)數(shù)。侵襲：將Matrigel 基質(zhì)膠均勻地鋪在Transwell 上室，待其干燥后，按照遷移實(shí)驗(yàn)的步驟操作。

1.3.6 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞中總蛋白經(jīng)RIPA 試劑提取后，用BCA法定量，然后用SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)分離。將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。于4 ℃冰箱中分別用CyclinD1（1∶800）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 500）一抗孵育，過(guò)夜后洗膜。再置于山羊抗兔二抗（1∶5 000）中，37 ℃孵育1 h。加顯影液顯影，曝光拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以表示。癌旁組織和癌組織中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表達(dá)量的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；肺腺癌組和肺鱗癌組TPT1-AS1和miR-671-5p表達(dá)量的比較及熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)照組、si-NC 組、si-TPT1-AS1 組、si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組 和si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的比較均先用單因素方差分析，然后再用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。肺癌組織中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以P＜0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 TPT1-AS1 和miR-671-5p 肺癌組織中的表達(dá)46 例肺癌病人癌組織中TPT1-AS1 表達(dá)量為1.88±0.12，較癌旁組織TPT1-AS1 表達(dá)量1.01±0.08顯著升高（t=38.37，P＜0.05）；癌組織中miR-671-5p表達(dá)量為0.45±0.04，較癌旁組織中miR-671-5p 表達(dá)量1.01±0.06顯著降低（t=46.14，P＜0.05）。

2.2 不同病理分型肺癌組織中TPT1-AS1 和miR-671-5p 的表達(dá)將46例肺癌病人分為肺腺癌組（21例）和肺鱗癌組（25 例）。肺腺癌組、肺鱗癌組病人的癌組織中TPT1-AS1 表達(dá)量分別為1.87±0.14、1.89±0.11，miR-671-5p表達(dá)量分別為0.47±0.05、0.45±0.04。兩組間TPT1-AS1 和miR-671-5p 的表達(dá)比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tTPT1-AS1=0.54，P=0.590；tmiR-671-5p=1.51，P=0.139）。

2.3 肺癌組織中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表達(dá)的相關(guān)性Pearson 相關(guān)性分析顯示，肺癌組織中TPT1-AS1 和miR-671-5p呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 肺癌組織中腫瘤蛋白翻譯控制1（TPT1）的反義RNA 1（TPT1-AS1）和miR-671-5p表達(dá)的相關(guān)性（線性方程：y=-0.230 65x+0.888，P＜0.05）

2.4 肺癌細(xì)胞中TPT1-AS1 靶向調(diào)控miR-671-5pTPT1-AS1 與miR-671-5p 核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2。共轉(zhuǎn)染TPT1-AS1-WT 與miR-671-5p 的A549 細(xì)胞熒光素素酶活性為0.42±0.06，較共轉(zhuǎn)染TPT1-AS1-WT 與miR-NC 的A549 細(xì)胞熒光素素酶活性（1.04±0.07）顯著降低（t=20.18，P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染TPT1-AS1-MUT 與miR-671-5p 的A549 細(xì)胞熒光素素酶活性為0.99±0.06，與共轉(zhuǎn)染TPT1-AS1-MUT與miR-NC 的A549 細(xì)胞熒光素素酶活性1.00±0.05比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.38，P=0.706）。si-TPT1-AS1 組A549 細(xì)胞中miR-671-5p 表達(dá)水平顯著高于si-NC 組［（1.81±0.09）比（1.05±0.05），t=22.15，P＜0.05］，而pcDNA-TPT1-AS1 組A549 細(xì) 胞 中miR-671-5p 表達(dá)水平顯著低于pcDNA 組［（0.40±0.05）比（1.01±0.11），t=15.15，P＜0.05］。

圖2 TPT1-AS1與miR-671-5p的核苷酸序列結(jié)合位點(diǎn)

2.5 各組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力比較si-TPT1-AS1 組A549 細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)較si-NC 組均顯著降低（P＜0.05）。si-TPT1-AS1+antimiR-671-5p組A549細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)較si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組均顯著升高（P＜0.05）。對(duì)照組與si-NC 組、si-TPT1-AS1 組與si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

表2 各組細(xì)胞存活率及遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)/

表2 各組細(xì)胞存活率及遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)/

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。②與si-TPT1-AS1+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

2.6 各組細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白在si-TPT1-AS1組A549細(xì)胞中的表達(dá)量較si-NC組均顯著降低（P＜0.05）。CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白在si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 組細(xì)胞中的表達(dá)量較si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組均顯著升高（P＜0.05）。對(duì)照組與si-NC 組、si-TPT1-AS1 組與si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)量比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4、表3。

表3 各組細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平/

表3 各組細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平/

注：si-NC 為小干擾RNA 陰性序列組，si-TPT1-AS1 組為TPT1-AS1 小干擾RNA 組，si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 組為TPT1-AS1 小干擾RNA 與抑制劑陰性序列共轉(zhuǎn)染組，si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 組為TPT1-AS1 小干擾RNA 與miR-671-5p 抑制劑共轉(zhuǎn)染組，CyclinD1 細(xì)胞周期蛋白D1，MMP-2基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶-9。①與si-NC組比較，P＜0.05。②與si-TPT1-AS1+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

圖4 各組細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

3 討論

TPT1-AS1 位于13 號(hào)染色體，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。研究顯示，TPT1-AS1是結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)的lncRNA，與病人預(yù)后不良密切相關(guān)，其通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移［10］；TPT1-AS1 宮頸癌中TPT1-AS1 呈高表達(dá)，敲減TPT1-AS1 可通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-324-5p 抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性行為及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而阻礙宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程，TPT1-AS1 有可能成為宮頸癌治療的分子靶標(biāo)［11］。本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中TPT1-AS1的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［12］，這提示TPT1-AS1可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過(guò)下調(diào)肺癌細(xì)胞中TPT1-AS1 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TPT1-AS1 可引起肺癌細(xì)胞增殖活性、遷移及侵襲能力均顯著降低，這提示下調(diào)TPT1-AS1可能有利于延緩肺癌的發(fā)展進(jìn)程，對(duì)改善肺癌病人預(yù)后具有積極作用。CyclinD1 對(duì)細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用，這與其促進(jìn)細(xì)胞周期由G1 期向S 期轉(zhuǎn)變有關(guān)［13］。MMP-2 和MMP-9 是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲起促進(jìn)作用［14］。本研究數(shù)據(jù)顯示，下調(diào)TPT1-AS1降低了肺癌細(xì)胞中與增殖、遷移及侵襲相關(guān)的蛋白CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［15-16］，這進(jìn)一步從蛋白水平說(shuō)明下調(diào)TPT1-AS1 能夠抑制肺癌細(xì)胞的惡性行為，TPT1-AS1 有可能成為肺癌治療的分子靶點(diǎn)。

為了探究下調(diào)TPT1-AS1 抑制肺癌細(xì)胞惡性行為的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了TPT1-AS1能夠靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-671-5p，這與肺癌組織中TPT1-AS1與miR-671-5p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果一致。研究顯示，miR-671-5p 是乳腺癌［17］、食管鱗狀細(xì)胞癌［18］、胃癌［19］等腫瘤組織中表達(dá)降低的miRNA，其作為抑癌基因?qū)@些腫瘤的發(fā)展起抑制作用。但也有報(bào)道稱，miR-671-5p 在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因作用促進(jìn)該腫瘤細(xì)胞的惡性行為［20］。這表明miR-671-5p 在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用不同。本研究顯示，肺癌組織中miR-671-5p 表達(dá)下調(diào)，與Nymark 等［9］報(bào)道的結(jié)果一致，提示miR-671-5p 在肺癌中也起抑癌基因作用。此外，本研究利用恢復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-671-5p 表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致下調(diào)TPT1-AS1 對(duì)肺癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用顯著降低，與相關(guān)研究結(jié)果一致［21］，進(jìn)一步提示TPT1-AS1 通過(guò)靶向miR-671-5p 影響肺癌細(xì)胞惡性行為，但其具體作用的miR-671-5p的靶基因還有待探究。

綜上所述，肺癌組織中TPT1-AS1 表達(dá)升高，miR-671-5p 表達(dá)降低，且兩者呈負(fù)相關(guān)；下調(diào)TPT1-AS1導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲性受到抑制，這可能與下調(diào)TPT1-AS1 引起細(xì)胞中miR-671-5p 的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，TPT1-AS1/miR-671-5p軸可能為肺癌的治療提供了新靶點(diǎn)。但本研究?jī)H通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究了TPT1-AS1 靶向miR-671-5p 對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，接下來(lái)將通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)觀察TPT1-AS1/miR-671-5p 軸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，同時(shí)對(duì)miR-671-5p 靶基因及下游信號(hào)通路進(jìn)行探究。

（本文圖3見(jiàn)插圖4-2）

圖3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲（結(jié)晶紫染色×200）