佘正元，司曉明

急性胰腺炎發(fā)生過程中，凋亡和壞死是胰腺腺泡細胞死亡的主要形式［1-2］。然而，急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡的分子機制尚不清楚。微小RNA（microRNAs）是一類高度保守的長度為18 至22 個核苷酸非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控下游靶基因水平，參與組織生長、疾病發(fā)生和惡化過程［3］。已有研究表明，急性胰腺炎病人血清中微小RNA-141-3p（miR-141-3p）的表達水平顯著升高［4］，但miR-141-3p對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響尚不清楚。含CUE 結(jié)構(gòu)域蛋白2（CUE domain containing 2 protein，CUEDC2）是一種多功能蛋白，其通過調(diào)控細胞周期、炎癥反應(yīng)、信號傳導等途徑影響細胞的病理生理過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，CUEDC2在雨蛙素誘導的急性胰腺炎細胞模型中表達上調(diào)，過表達CUEDC2促進胰腺腺泡細胞凋亡，降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）水平等促炎因子分泌［5-6］。生物信息學分析顯示，miR-141-3p 可能與CUEDC2 存在相互作用，但miR-141-3p 能否調(diào)控CUEDC2表達參與胰腺腺泡細胞凋亡和炎癥反應(yīng)尚未可知。因此，2018 年7 月至2019 年12 月，從美國ATCC 購買大鼠胰腺腺泡細胞AR42J。本研究擬構(gòu)建急性胰腺炎細胞模型，探討miR-141-3p 對腺泡細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機制，以期為臨床診斷和治療胰腺炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠胰腺腺泡細胞AR42J 購于美國ATCC；胎牛血清和RPMI-1640 培養(yǎng)基購于美國Hyclone 公司；雨蛙素和TRIZOL 試劑購于美國Sigma 公司；miR 抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-141-3p 抑制物（anti-miR-141-3p）、空載體（pcDNA）、CUEDC2 過表達載體（pcDNA-CUEDC2）、小干擾RNA 對照（si-NC）、CUEDC2小干擾RNA（si-CUEDC2）、野生型（WT）熒光素酶報告基因載體（WT-CUEDC2）和突變型（MUT）熒光素酶報告基因載體（MUT-CUEDC2）購于上海吉瑪制藥有限公司；互補DNA（cDNA）第一鏈合成試劑盒、一步法miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；CUEDC2抗體、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，以及Ⅱ抗購于美國CST 公司。放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒以及聚偏二氟乙烯膜購于上海碧云天生物科技有限公司；TNF-α 和IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（Elisa）檢測試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和建模 采用RPMI-1640 培養(yǎng)基（含有體積分數(shù)為10%的胎牛血清）在37 ℃、二氧化碳體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)AR42J 細胞。當細胞匯合度達到80時進行傳代。參照文獻［7］構(gòu)建急性胰腺炎細胞模型：將AR42J 細胞按照每孔1×106個細胞的密度接種于6 孔板，當細胞匯合度達到60%時，用100 nm/L 的雨蛙素刺激AR42J 細胞6 h，收集細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。收集細胞上清液，Elisa 試劑盒檢測檢測上清液中TNF-α 和IL-6的表達水平。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組 細胞分組如下：對照組為正常培養(yǎng)的AR42J細胞；模型組按照1.2.1 建模方法處理AR42J 細胞；模型+anti-miR-NC 組、模型+anti-miR-141-3p 組、模型+pcDNA 組、模型+pcDNACUEDC2組為利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染antimiR-NC、anti-miR-141-3p、pcDNA、pcDNA-CUEDC2至AR42J 細胞后，按照1.2.1 建模方法處理AR42J 細胞。隨后分別收集細胞和細胞上清液，檢測細胞凋亡以及TNF-α和IL-6的分泌情況。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測 收集對照組、模型組以及轉(zhuǎn)染48 h 的AR42J 細胞，分別按照TRIZOL 試劑說明書提取細胞中的總RNA，使用cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為參照，采用qRT-PCR檢測CUEDC2 信使RNA（mRNA）的表達水平。使用一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以U6 為模板，采用qRTPCR 檢測miR-141-3p 的表達水平。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：包括SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物0.5 μL 和下游引物0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase Free 水（RNase Free H2O）7 μL。采用2-ΔΔCt法分析CUEDC2 mRNA 和miR-141-3p的表達水平。引物序列（5’-3’）如下：miR-141-3p 正向ACACTCCAGCTGGGCATCTTCCAG，反向 AATTCAGTTGAGTCCAAC；CUEDC2正向GATGCCAGGAACAAAGAGAA，反向CTCATCTTGGGTGTCTGC；GAPDH 正 向GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，反 向GAAGATGGTGATGGGATTTC；U6正向ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，反向GGAACGCTTCACGAATTTG。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?生物信息學軟件starbase 預(yù)測顯示miR-141-3p 和CUEDC2 的3’-UTR存在互補結(jié)合位點。將CUEDC2的互補結(jié)合位點進行突變，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-141-3p 和CUEDC2 的靶向關(guān)系。將WT-CUEDC2 和MUT-CUEDC2 分別與miR-141-3p 模擬物（miR-141-3p mimics）或miR 模擬物陰性對照（miR-NC）共轉(zhuǎn)染AR42J細胞，培養(yǎng)48 h，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定熒光素酶活性變化。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 采用膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）試劑盒檢測細胞凋亡。將AR42J細胞按照每孔1×106個細胞的密度接種于6 孔板，24 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔細胞采用加入100 nm/L 的雨蛙素處理6 h，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次，800 rpm離心5 min，隨后用預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，取100 μL 細胞懸液，加入5 μL 的Annexin V-FITC 混勻，在加入5 μL 的PI染色，室溫避光孵育15 min，補加1×結(jié)合緩沖液至500 μL后進行上機檢測。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測、CUEDC2、Bcl-2和Bax蛋白的表達 采用RIPA裂解液裂解各組細胞，提取細胞總蛋白。按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度，取適量細胞蛋白和等體積1×上樣緩沖液混勻，煮沸變性后冷卻至室溫備用。取30 μg 蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將細胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，洗膜后分別加入Ⅰ抗CUEDC2 抗體（1∶1 000）、Bcl-2 抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000）室溫孵育2 h，洗膜后加入相對應(yīng)Ⅱ抗室溫避光孵育1 h，洗膜后進行化學發(fā)光顯色，以GAPDH 為參照，分析各目的條帶的灰度值。

1.2.7 Elisa 法檢測TNF-α 和IL-6 的表達水平 將AR42J 細胞按照每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板，24 h 后，棄去培養(yǎng)基，用100 nm/L 的雨蛙素誘導AR42J 細胞6 h，收集細胞上清液，按照TNF-α 和IL-6 Elisa檢測試劑盒步驟測定細胞上清液中TNF-α和IL-6的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法本研究所有數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差，進一步組內(nèi)兩兩比較用采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p 和CUEDC2 在雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞中的表達與對照組比較，模型組AR42J 細胞中miR-141-3p 的表達水平顯著升高，CUEDC2 mRNA 和CUEDC2 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 CUEDC2蛋白在雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞中的表達

表1 miR-141-3p和CUEDC2在雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞中的表達/

表1 miR-141-3p和CUEDC2在雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞中的表達/

注：miR-141-3p 為微小RNA-141-3p，CUEDC2 為含CUE 結(jié)構(gòu)域蛋白2，mRNA為信使RNA。

2.2 miR-141-3p 靶向調(diào)控CUEDC2 的表達starbase 預(yù)測顯示，miR-141-3p 和CUEDC2 的3’-UTR存在部分特異性結(jié)合位點。miR-141-3p mimics和WT-CUEDC2 共轉(zhuǎn)染組AR42J 細胞的熒光素酶活性較miR-NC 和WT-CUEDC2 共轉(zhuǎn)染組顯著降低（P＜0.05），而miR-141-3p mimics 和MUT-CUEDC2共轉(zhuǎn)染組AR42J 細胞的熒光素酶活性較miR-NC 和MUT-CUEDC2 共轉(zhuǎn)染組變化無統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics 后AR42J 細胞CUEDC2 蛋白的表達水平顯著降低；轉(zhuǎn)染anti-miR-141-3p 后AR42J細胞CUEDC2 蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05）。miR-141-3p 靶向負性調(diào)控CUEDC2 表達。見表2、表3、圖2。

圖2 miR-141-3p靶向調(diào)控CUEDC2的表達：A為CUEDC2的3’UTR中含有與miR-141-3p互補的核苷酸序列；B為CUEDC2蛋白表達

表2 雙熒光素酶報告實驗/

表2 雙熒光素酶報告實驗/

注：miR-NC 為miR 模擬物陰性對照，miR-141-3p 為微小RNA-141-3p，WT-CUEDC2 為野生型含CUE 結(jié)構(gòu)域蛋白2，MUT-CUEDC2為突變型含CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2。

表3 miR-141-3p調(diào)控CUEDC2蛋白的表達/

表3 miR-141-3p調(diào)控CUEDC2蛋白的表達/

注：miR-NC 為miR 模擬物陰性對照，miR-141-3p 為微小RNA-141-3p，anti-miR-NC 為miR抑制物陰性對照，anti-miR-141-3p 為miR-141-3p抑制物，CUEDC2為含CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2。①與miR-NC組比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

2.3 抑制miR-141-3p 表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的影響與對照組比較，模型組AR42J 細胞miR-141-3p 的表達水平顯著增加，細胞凋亡率顯著升高，Bax 蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2 蛋白的表達顯著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6分泌顯著增加；與模型+anti-miR-NC 組比較，轉(zhuǎn)染模型+anti-miR-141-3p 組AR42J 細胞miR-141-3p 的表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著，Bax蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達顯著降低，炎性因子TNF-α和IL-6分泌顯著降低（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的影響/

表4 抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的影響/

注：anti-miR-NC 為miR 抑制物陰性對照，anti-miR-141-3p 為miR-141-3p 抑制物，miR-141-3p 為微小RNA-141-3p，Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素-6。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

圖3 抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的影響：A為凋亡相關(guān)蛋白表達；B為細胞凋亡流式細胞術(shù)圖

2.4 CUEDC2 過表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的影響與對照組比較，模型組AR42J細胞CUEDC2 的表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Bax蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達顯著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌顯著增加；與模型+pcDNA 組比較，模型+pcDNA-CUEDC2組AR42J 細胞CUEDC2 的表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，Bax 蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2 蛋白的表達顯著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6分泌顯著降低（P＜0.05）。見表5、圖4。

表5 CUEDC2過表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的影響/

表5 CUEDC2過表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的影響/

注：pcDNA 為空載體，pcDNA-CUEDC2 為CUEDC2 過表達載體，CUEDC2 為含CUE 結(jié)構(gòu)域蛋白2，Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax 為Bcl-2相關(guān)X蛋白，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素-6。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組+pcDNA組比較，P＜0.05。

圖4 CUEDC2過表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞中CUEDC2和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.5 抑制CUEDC2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的保護作用與模型+anti-miR-NC 組比較，轉(zhuǎn)染模型+antimiR-141-3p 組AR42J 細胞CUEDC2 和Bax 蛋白的 表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白的表達顯著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌顯著降低；與模型+anti-miR-141-3p+si-NC 組比較，模型組+anti-miR-141-3p+si-CUEDC2 組AR42J 細 胞CUEDC2和Bax蛋白的表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，炎性因子TNF-α和IL-6分泌顯著升高（P＜0.05）。見表6、圖5。

表6 抑制CUEDC2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的作用/

表6 抑制CUEDC2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的作用/

注：anti-miR-NC 為miR 抑制物陰性對照，anti-miR-141-3p為miR-141-3p抑制物，anti-miR-141-3p+si-NC 為miR-141-3p抑制物+小干擾RNA對照，anti-miR-141-3p+si-CUEDC2 為miR-141-3p 抑制物+CUEDC2 小干擾RNA，miR-141-3p 為微小RNA-141-3p，CUEDC2 為含CUE 結(jié)構(gòu)域蛋白2，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素-6。①與CAE+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。②與CAE+anti-miR-141-3p+si-NC組比較，P＜0.05。

圖5 抑制CUEDC2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-141-3p表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞中CUEDC2和凋亡相關(guān)蛋白表達的作用

3 討論

急性胰腺炎是一種常見的急腹癥，發(fā)病率逐漸增高，常伴有組織器官功能障礙，難以治愈。胰腺腺泡細胞凋亡作為一種自我保護機制［8］，在急性胰腺炎的臨床結(jié)局中發(fā)揮重要作用。因此，探索腺泡細胞凋亡的機制具有重要意義。

miRNAs 在調(diào)節(jié)機體發(fā)育、細胞增殖和凋亡、器官形成、多種疾病的發(fā)生發(fā)展等多種生物學活動中發(fā)揮著重要的作用［9-10］。miR-141-3p 是一種多功能miRNA，在缺氧誘導的H9c2 細胞中miR-141-3p 的表達顯著增加，抑制miR-141-3p 可通過激活RP105依賴性磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase，PI3K/AKT）信號通路來降低缺氧誘導的H9c2 心肌細胞凋亡［11］；同時，miR-141-3p 通過調(diào)控靶基因表達在骨肉瘤細胞［12］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞［13］的凋亡中發(fā)揮重要作用；此外，miR-141-3p 還與實驗性自身免疫性心肌炎［14］和糖尿病腎?。?5］的炎性損傷有關(guān)。然而，miR-141-3p 在急性胰腺炎中的分子機制尚不清楚。本研究采用雨蛙素刺激大鼠胰腺腺泡細胞AR42J 構(gòu)建急性胰腺炎細胞模型，結(jié)果顯示雨蛙素誘導后AR42J 細胞miR-141-3p 的表達水平顯著升高，與Lu 等［4］miR-141-3p在急性胰腺炎病人血清中表達上調(diào)結(jié)論相吻合。抑制miR-141-3p表達后AR42J細胞Bax的表達水平顯著升高，Bcl-2 的表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著增加。TNF-α可以增加趨化因子和粘附因子的表達和促進因子IL-6 的分泌，導致炎癥反應(yīng)加劇，胰腺損傷進一步惡化。IL-6 還能促進T 細胞和B 細胞的增殖，釋放多種炎性因子。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-141-3p表達后細胞上清液中TNF-α和IL-6的表達水平顯著降低，提示miR-141-3p 通過調(diào)節(jié)胰腺腺泡細胞的凋亡和抑制細胞的炎癥反應(yīng)來減輕急性胰腺損傷。

CUEDC2 是由約40 個氨基酸組成的小而保守的泛素結(jié)合域蛋白，在真核生物體內(nèi)廣泛存在，與多種腫瘤發(fā)生和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［16］。高水平的CUEDC2 可能導致促后期復(fù)合物或環(huán)體早期失活，最終導致染色體錯聚和非整倍性，進而促進腫瘤形成［17］。CUEDC2 還可抑制多種促炎因子表達，減少間質(zhì)膠原沉積，減輕腎臟纖維化［18］。此外，高表達CUEDC2 可減輕結(jié)腸炎癥反應(yīng)，顯著地抑制核因子κB（NF-κB）和Janus 蛋白酪氨酸激酶（janus protein tyrosine kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號傳導途徑的激活，預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)生［19］。本研究結(jié)果顯示，急性胰腺炎細胞模型中CUEDC2 的表達水平顯著降低，miR-141-3p 可靶向負性調(diào)控CUEDC2 表達。此外，過表達CUEDC2 后AR42J 細胞凋亡率顯著增加，TNF-α 和IL-6 的表達水平顯著降低，與前人的研究結(jié)論相一致［5-6］。抑制CUEDC2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-141-3p 表達對雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。以上結(jié)果提示，miR-141-3p 通過調(diào)控CUEDC2 表達參與急性胰腺炎腺泡細胞的凋亡可炎癥反應(yīng)。

綜上，抑制miR-141-3p 通過靶向CUEDC2 誘導胰腺腺泡細胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，進而在輕急性胰腺炎中發(fā)揮保護作用。然而，miR-141-3p 在急性胰腺炎中的作用需要在動物模型中進一步驗證。