梁志慶 倪凱 何鵬飛 王胤驍 趙應(yīng)紅

摘要：目的 研究傣醫(yī)常用的5種解藥對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞焦亡和活力的影響，初步篩選評(píng)價(jià)其抗炎活性。方法 采用Celigo Cytomter全視野細(xì)胞掃描分析儀，對(duì)健康生長條件下空白組及藥物干預(yù)的小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行分析，通過對(duì)細(xì)胞增值數(shù)的觀察分析，篩選出可抑制小鼠巨噬細(xì)胞增值的藥材。結(jié)果 與空白組比較，給藥組的小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）。結(jié)論 傣族常用解藥對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：傣醫(yī);解藥;巨噬細(xì)胞;抗炎;篩選

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2022）03-0078-03

炎癥反應(yīng)存在與機(jī)體的諸多生理病理過程中，是最基礎(chǔ)的保護(hù)性反應(yīng)之一。體內(nèi)多種細(xì)胞參與其中，巨噬細(xì)胞在調(diào)控人體炎癥反應(yīng)變化的過程中扮演著不可替代角色。人體內(nèi)的巨噬細(xì)胞處于應(yīng)答狀態(tài)，當(dāng)其受到微觀世界中各種效應(yīng)子的激活信號(hào)，諸如外界的病原體、突發(fā)損傷刺激干擾或者免疫適應(yīng)，都會(huì)引起巨噬細(xì)胞的分化，從而開啟不同的遺傳程序，誘導(dǎo)其成為極化狀態(tài)[1]。當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)的平衡被打破，就會(huì)造成巨噬細(xì)胞極化失調(diào)。從而可能導(dǎo)致多種慢性炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，例如膿毒癥、動(dòng)脈粥狀硬化、哮喘及炎癥性腸病等[2]。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，糾正其極化失調(diào)表達(dá)，可能會(huì)延緩這些相關(guān)疾病的炎癥進(jìn)程，這也使得對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控有望成為控制和治療這些炎癥性疾病新的靶點(diǎn)。傣族醫(yī)藥歷史悠久，據(jù)《貝葉經(jīng)》記載，早在2500多年前，傣族就有了自己的醫(yī)藥，是傣族人民長期與自然和疾病斗爭中總結(jié)、積累出來的，并受到中醫(yī)學(xué)、印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的影響，且傣醫(yī)理論“四塔”（風(fēng)、火、水、土）和“五蘊(yùn)（色、識(shí)、受、想、行）與中醫(yī)陰陽五行學(xué)說有相似之處，具有鮮明的民族特色，是祖國醫(yī)學(xué)的重要組成部分。傣醫(yī)藥學(xué)具有獨(dú)到的防病治病的特征。傣醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為，凡功能以解毒為主，針對(duì)各種食物、藥物、動(dòng)物叮咬及各種原因過敏等所導(dǎo)致的體內(nèi)殘留毒素而設(shè)，具有解除毒素、調(diào)補(bǔ)四塔功能的藥物稱為雅解（解藥），而其使用方法則稱為“解法”[3]。在前期調(diào)研過程中，搜集到了數(shù)十種傣族解藥，其中嘿宋些、文尚海、牙給哈蒿、呀楠嫩、芽哈擺、埋答巴等十余種為當(dāng)?shù)亓?xí)用常用的解藥。

傣醫(yī)臨床常用的解法，其解除毒素、調(diào)補(bǔ)四塔功效，可能與調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、糾正其極化失調(diào)以致延緩炎癥有關(guān)，選擇了5種常用傣醫(yī)解藥進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)巨噬細(xì)胞生長的影響，初步評(píng)價(jià)其抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞，編號(hào)：KCB200603YJ，來源于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫（中科院動(dòng)物所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 5種傣藥（編號(hào)：1、2、3、4、5），批號(hào)：20211230，均購自西雙版納州州民族醫(yī)藥研究所。中美特級(jí)胎牛血清（04-001-1ACS，BI）、DMEM/高糖培養(yǎng)液（06-1055-57-1ACS，BI）、青霉素-鏈霉素溶液（03-031-1B，BI）、胰蛋白酶溶液（03-050-1A，BI）上述試劑均從云南澤浩商貿(mào)有限公司采購。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DLAB多速度離心機(jī)，型號(hào)：DM0412，大興龍創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（廣州）有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國WIGGENS;BIO成像系統(tǒng)，65666，BIO;全視野細(xì)胞掃描分析儀（Celigo Cytomter），美國Nexcelom，耐細(xì)隆生物儀器（上海）有限公司;超純水系統(tǒng)，英國ELGA Classic UF;-80℃超低溫冰箱，Ermo Fisher;顯微鏡 BX600，奧林巴斯（上海）銷售服務(wù)有限公司;電轉(zhuǎn)儀（半程），314456，北京生物;真空操作臺(tái)，AIRTECH，0135。

1.4 藥材受試液制備 每種傣藥均取100 g，加8倍量純水煎煮3次，每次25 min，濾過，合并濾液濃縮至100mg生藥/ml，2500 rpm離心15 min，取上清液高壓滅菌后凍存（-15℃）備用。凍存原液稀釋為3個(gè)濃度（200、400、800μg/mL）供實(shí)驗(yàn)用。

1.6 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境（37℃、5%CO2），完全培養(yǎng)基稀釋，持續(xù)抽風(fēng)狀態(tài)生物安全柜等，遵循無菌操作。

1.7 受試藥材對(duì)RAW264.7細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 通過觀察其對(duì)于細(xì)胞技術(shù)的影響，從而分析受試藥材對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖以及活力情況的影響。

將RAW264.7細(xì)胞消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期（聚合度在75%以上）的RAW264.7細(xì)胞，將每組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔（約8500個(gè)細(xì)胞）接種于無菌的96孔板中，稍微振蕩，使細(xì)胞貼壁。然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后分別加入等量受試藥材（培養(yǎng)基稀釋后），根據(jù)預(yù)設(shè)的3個(gè)濃度，用完全培養(yǎng)基稀釋，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，空白組加入等量培養(yǎng)基，分別在藥材刺激后24 h，48 h，72 h取出96孔板，用分析儀檢測細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，分析其細(xì)胞增值和細(xì)胞活力情況，從而評(píng)價(jià)藥物對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一進(jìn)行方差齊性校驗(yàn)，使用SPSS28.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，各組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P>0.05為差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義，P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義。

2 結(jié)果

2.1 1號(hào)傣藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 表1結(jié)果表明，1號(hào)傣藥高濃度在0～24、24～48、48～72 h時(shí)均顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù);中濃度僅在24～48 h時(shí)顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù);低濃度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)無顯著影響。

2.2 2號(hào)傣藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 表2結(jié)果表明，2號(hào)傣藥高濃度僅在48～72 h時(shí)顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)，中、低濃度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)均無顯著影響。

2.3 3號(hào)傣藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 表3結(jié)果表明，3號(hào)傣藥對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)無顯著影響。

2.4 4號(hào)傣藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 表4結(jié)果表明，4號(hào)傣藥高濃度在0～24、24～48、48～72 h時(shí)均顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù);中濃度僅在48～72 h時(shí)顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù);低濃度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)無顯著影響。

2.5 5號(hào)傣藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 表5結(jié)果表明，5號(hào)傣藥高濃度在0～24、24～48、48～72 h時(shí)均顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù);中濃度在24～48、48～72 h時(shí)顯著減少小鼠巨噬細(xì)胞數(shù);低濃度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)無顯著影響。

3 小結(jié)

據(jù)文獻(xiàn)記載，1號(hào)傣藥其性涼、味苦，入火、土、風(fēng)塔，具有清火解毒、消腫止痛之功效，可用于咽喉腫痛、口舌生瘡、疔瘍斑疹、肺熱咳嗽、胃脘痛、尿痛等，還可用于消除因飲食不潔或用藥不當(dāng)所致的各種不良反應(yīng)[4];2號(hào)傣藥其性涼、味苦，入火、土、風(fēng)塔，具有清火解毒、增強(qiáng)免疫之功效;3號(hào)傣藥其性涼、味甘，入火、土塔，具有清火解毒、強(qiáng)精補(bǔ)腎之功效;4號(hào)傣藥味苦、微甜，氣臭，性溫。入四塔，功效為調(diào)補(bǔ)四塔，解毒。用于治療產(chǎn)后因飲食不潔（節(jié)）等而致的疾病;5號(hào)傣藥的功效為清熱解毒，性溫。入四塔。本研究表明，除3號(hào)傣藥外，其余4種傣藥均對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞生長均有一定的抑制作用，且4、5號(hào)傣藥的高濃度組在0～72 h 3個(gè)時(shí)間段均有顯著性差異（P<0.05）。

傣醫(yī)“雅解”學(xué)說是傣醫(yī)理論最具民族特色的理論之一，使用歷史悠久，是傣醫(yī)基礎(chǔ)理論的重要組成部分，它以四塔、五蘊(yùn)為理論核心，“未病先解，先解后治，同解同治”的解毒理論是其核心內(nèi)容，雅解旨在解除人體內(nèi)各種毒素，并調(diào)節(jié)體內(nèi)“四塔、五蘊(yùn)”功能失調(diào)，達(dá)到防病治病，保持人體健康之目的。但“雅解”的生物學(xué)原理及解藥的作用機(jī)制研究匱乏，本研究以不同濃度的藥物對(duì)巨噬細(xì)胞生長的影響為指標(biāo)，初步評(píng)價(jià)5種常用傣醫(yī)解藥的抗炎活性，對(duì)研究解藥的作用機(jī)制具有一定的重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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[2]Abbadi A，Llfitis J，Wang M，et al.Heparin inhibits proinflammatory and promotes ant-inflammatory macrophage po-larization under hyperglycemic stress [J].Journal of Biological Chemistry，2020，295（15）：4849-4857.

[3]臺(tái)海川，林艷芳.傣醫(yī)“解”的理論與解藥的現(xiàn)代研究初探[J].中國民族醫(yī)藥志，2009，15（10）：37-39.

[4]李海濤，康利平，郭寶林，等.常用傣藥“傣百解”的基原考證[J].中國中藥雜志，2014，39（8）：1525-1529.

（收稿日期：2021-11-18）