段曉婷, 高 永, 梁鈺鎂, 王瑞東, 趙 晨, 郭 鑫

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 沙漠治理學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

沙柳(Salixpsammophila)沙障是中國(guó)西北地區(qū)防沙治沙的主要工程措施之一[1-2]，能夠在一定程度上改善土壤養(yǎng)分狀況[3-4]，有利于增加沙丘表層細(xì)顆粒的含量明顯降低地表粗化[5]，通過(guò)改變近地表風(fēng)沙流結(jié)構(gòu)[1]，有效控制土地沙化，且固沙成本較低[6]，所以被廣泛用于荒漠化地區(qū)。然而，障體的使用效益具有一定周期，這主要是環(huán)境因子與微生物的綜合作用[7]，沙柳沙障沙埋段腐化障體的主要腐解微生物為木腐真菌[8]，木腐真菌以菌絲體或孢子形式在沙柳沙障障體表面以及內(nèi)部生長(zhǎng)[9]，使障體細(xì)胞壁受到破壞，導(dǎo)致障體理化性質(zhì)和物質(zhì)組成發(fā)生變化，障體變得松軟易碎，呈現(xiàn)出篩孔狀或粉末狀等形態(tài)[10]，最終導(dǎo)致沙柳沙障因破損發(fā)生倒伏。

木腐真菌是造成障體沙埋部腐爛的主要微生物[11]，其生長(zhǎng)在各種形態(tài)的木材基質(zhì)上[12]，木腐真菌通過(guò)分泌過(guò)氧化物酶和漆酶降解障體中的木質(zhì)素和纖維素[13-14]使障體內(nèi)部出現(xiàn)一系列細(xì)胞塌陷、空腔等腐化現(xiàn)象，且木腐真菌菌絲對(duì)木材C，N等營(yíng)養(yǎng)元素具有重要的吸收和轉(zhuǎn)移作用，促使障體物質(zhì)組成發(fā)生變化[15]，從而失去其本身的價(jià)值。目前，關(guān)于沙柳沙障腐化規(guī)律、破損規(guī)律、作用機(jī)制、沙柳沙障對(duì)土壤的改良作用及其固沙效益等方面已得到一定的研究[1-6]，微生物作為沙柳沙障腐朽的主要原因，前人研究了不同垂直位置微生物數(shù)量的分布特征，及其與障體腐蝕之間的聯(lián)系，以及致腐因子和防腐性能等方面[7-9]，相對(duì)于沙柳沙障腐朽過(guò)程中不同木腐真菌的生物學(xué)特性研究尚顯不足。

基于此，本研究以分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市獨(dú)貴塔拉鎮(zhèn)境內(nèi)庫(kù)布齊沙漠穩(wěn)定沙埋段障體木腐真菌為研究對(duì)象，探究不同培養(yǎng)條件(碳源、氮源和酸堿度)對(duì)障體沙埋段木腐真菌生長(zhǎng)的影響，以篩選其適宜的生長(zhǎng)條件，初步了解障體沙埋段木腐真菌的生物學(xué)特性，以期為延長(zhǎng)沙柳沙障使用周期提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市獨(dú)貴塔拉鎮(zhèn)境內(nèi)庫(kù)布齊沙漠，地處鄂爾多斯高原脊線的北部(39°22′33″—40°52′14″N，106°55′16″—109°16′02″E)。研究區(qū)屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均降水量227 mm，年均蒸發(fā)量2 400 mm，地貌類型主要為流動(dòng)沙丘、半流動(dòng)沙丘和固定沙丘。土壤質(zhì)地主要為壤土，以粉砂質(zhì)壤土和砂質(zhì)壤土為主，植被類型主要包括沙柳(Salixpsammophila)、甘草(Glycyrrhizauralensis)、花棒(Hedysarumscoparium)、檸條(Caraganakorshinskii)、楊柴(Hedysarummongolicum)和豬毛菜(Salsolacollina)等[16]。

2 研究方法

(1) 菌種制備。障體取自2019年11月3日，選取沿S24穿沙公路兩側(cè)已鋪設(shè)5 a的沙柳沙障1 m×1 m規(guī)格樣地，樣品采集方法參照“樹木病原真菌”的分離方式[17]來(lái)進(jìn)行特定部位取樣，使用經(jīng)高溫滅菌的枝剪剪取穩(wěn)定沙埋段障體受真菌侵染的部位，無(wú)菌密封袋封裝標(biāo)記，低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行兩種操作，一部分直接挑取障體表面菌絲進(jìn)行分離培養(yǎng)，剩余部分用鑷子夾取障體破損較嚴(yán)重部位碎木屑進(jìn)行分離培養(yǎng)，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出不同形態(tài)和不同顏色的菌落后，分別反復(fù)挑取直至獲得純菌株。接種于斜面培養(yǎng)基，存放于4 ℃?zhèn)溆?。本試?yàn)使用的5種木腐真菌均為前期分離純化保存于沙地植物抗逆生理實(shí)驗(yàn)室的菌種。將菌種接種于90 mm的PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，然后用已滅菌的打孔器(直徑5 mm)在菌落邊緣打取菌餅，用于固體和液體培養(yǎng)接種。

(2) 培養(yǎng)基。

①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)100 g，葡萄糖 10 g，瓊脂 10 g，蒸餾水 500 ml，蛋白胨 2.5 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB10.005 g，氯霉素0.05 g。

②碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將葡萄糖用等量甘露醇、羧甲基纖維素鈉、淀粉和麥芽糖代替。

③氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，蛋白胨用等量尿素、氯化銨、硫酸銨和草酸銨代替。

④pH值基礎(chǔ)培養(yǎng)基：以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，使用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度。

(3) 不同碳源、氮源和酸堿度試驗(yàn)。①固體培養(yǎng)：用等量甘露醇、羧甲基纖維素鈉、淀粉和麥芽糖代替不同碳源培養(yǎng)基中的葡萄糖；用等量尿素、氯化銨、硫酸銨和草酸銨代替不同氮源培養(yǎng)基中的蛋白胨；使用NaOH與HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。將5種真菌分別接種于不同碳源、氮源和酸堿度培養(yǎng)基的中心位置，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，以接種塊為中心每24 h測(cè)量菌落直徑(mm)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測(cè)量3次，取平均值。計(jì)算菌絲日均長(zhǎng)速[18]：

②液體培養(yǎng)：去除PDA培養(yǎng)基中的瓊脂進(jìn)行液體培養(yǎng)。于250 ml的錐形瓶中裝入等量100 ml液體PDA培養(yǎng)基，每瓶接種1個(gè)菌餅，25 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，過(guò)濾收集菌絲并用蒸餾水沖洗3次，放于錫紙上，80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量菌絲干質(zhì)量(生物量)，每種處理3個(gè)重復(fù)[19-20]。

(4) 數(shù)據(jù)處理。采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 20.0(one-way ANOVA)分析對(duì)不同碳源、氮源和酸堿度下木腐真菌的平均生長(zhǎng)速率以及生物量進(jìn)行方差分析，并利用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；使用Origin 2021軟件繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同碳源對(duì)5種障體木腐真菌生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，5種碳源下木腐真菌均可以生長(zhǎng)。固體培養(yǎng)條件下，葡萄糖為桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和黑曲霉的最佳碳源，它們的生長(zhǎng)速度分別為12.97 mm/d，8.56 mm/d，13.25 mm/d和5.22 mm/d。桔綠木霉、Xs木霉和哈茨木霉以葡萄糖為碳源較羧甲基纖維鈉顯著提高了52.6%，2.3倍和36.3%(p<0.05)；黑曲霉則在5種碳源下的排序?yàn)椋浩咸烟?甘露醇>麥芽糖>羧甲基纖維素鈉>淀粉。

注：不同大寫字母表示同一碳源下不同木腐真菌間差異顯著(p<0.05)；不同小寫字母表示不同碳源下木腐真菌間差異顯著(p<0.05)。下同。

液體培養(yǎng)條件下，同樣桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉、擬康氏木霉和黑曲霉以葡萄糖為碳源時(shí)生物量最大，其生物量分別為446.67，454.67，728.67，687.67，713.00 mg/100 ml。綜上所述葡萄糖是5種碳源中最適合木腐真菌生長(zhǎng)的碳源。

3.2 不同氮源對(duì)5種障體木腐真菌生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，固體培養(yǎng)條件下，Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉最佳氮源均為蛋白胨，桔綠木霉最佳氮源為硫酸銨。其平均生長(zhǎng)速度表現(xiàn)為：哈茨木霉>Xs木霉>擬康氏木霉；桔綠木霉則在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中平均生長(zhǎng)速度最快13.06 mm/d。桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉以蛋白胨為氮源較以草酸銨為氮源平均生長(zhǎng)速度顯著提高61.0%，3.7倍、2.7倍和7.8倍(p<0.05)。液體培養(yǎng)條件下，桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉以蛋白胨為氮源時(shí)生物量最大，氯化銨為氮源時(shí)黑曲霉生物量較大。以蛋白胨的為氮源時(shí)生物量分別為473.33，453.00，558.33，526.33 mg/100 ml，黑曲霉生物量為610.00 mg/100 ml，且較其他氮源差異顯著(p<0.05)。

圖2 不同氮源對(duì)5種木腐真菌生長(zhǎng)的影響

3.3 不同pH值對(duì)5種障體木腐真菌生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，不同pH值使真菌的生長(zhǎng)以及生物量產(chǎn)生差異。固體培養(yǎng)條件下，初始pH=5為Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉最適酸堿度，初始pH=6的培養(yǎng)基中黑曲霉生長(zhǎng)速度較快，桔綠木霉在初始pH=5和pH=6的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異(p<0.05)。其中Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉分別較pH=9平均生長(zhǎng)速度顯著提高4.1倍、78.0%和56.9%；桔綠木霉在初始pH=5和pH=6的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度為5.22，6.33 mm/d，黑曲霉在初始pH=6的培養(yǎng)基中平均生長(zhǎng)速度為6.33 mm/d。綜上所述，5種木腐真菌適合在弱酸性條件下生長(zhǎng)。

圖3 不同酸堿度對(duì)5種木腐真菌生長(zhǎng)的影響

液體培養(yǎng)條件下，初始pH=7時(shí)桔綠木霉生物量較大，Xs木霉和擬康氏木霉最適酸堿度為初始pH=5，哈茨木霉和黑曲霉在初始pH=6時(shí)生物量較大。其中，桔綠木霉在初始pH=7時(shí)生物量為673.00 mg/100 ml，Xs木霉和擬康氏木霉較初始pH=9顯著提高42.6%和22.7%(p<0.05)，哈茨木霉在初始pH=6時(shí)的生物量為591.00 mg/100 ml，黑曲霉則是較初始pH=9顯著提高14.3%(p<0.05)。

4 討論與結(jié)論

4.1 討 論

充足的碳源、氮源和適宜的pH值是微生物生長(zhǎng)繁殖所需的必要條件。碳源為微生物的生長(zhǎng)代謝主要提供所需碳元素[21]，提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量，其次氮源是作為構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料。pH值改變則會(huì)引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)會(huì)影響酶的活性。明確障體木腐真菌生物學(xué)特性可對(duì)障體的腐朽機(jī)制及腐朽成因等方面的研究提供理論依據(jù)，從而延長(zhǎng)障體使用壽命。

由于不同樣本的木腐真菌群落對(duì)碳源利用的模式也存在一定差異[22]，本文研究的5種木腐真菌除擬康氏木霉以外，剩余4種木腐真菌最適碳源均為葡萄糖，這與Zeng等[23]對(duì)Phellinusbaumii的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)槠咸烟菫閱翁?，真菌可以直接吸收與利用，但在Le等[24]對(duì)P.nebrodensis的研究得出最適碳源為麥芽糖，這與本文結(jié)果不一致，可能是二者所選的真菌類型不同，Le所選的真菌為百靈菇屬于擔(dān)子菌綱，主要引起白色腐朽，而本研究中哈茨木霉和黑曲霉屬絲孢綱，因此其利用碳源的方式不同，將培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為自身需要簡(jiǎn)單碳水化合物的方式存在差異。

5種木腐真菌在不同的氮源培養(yǎng)基質(zhì)下均能夠生長(zhǎng)，但對(duì)不同氮源的利用程度存在一定差異。除桔綠木霉最適氮源為硫酸銨和黑曲霉無(wú)最適氮源外，剩余3種木腐真菌最適氮源均是蛋白胨。該研究結(jié)果與顧瓊楠等[25]對(duì)牛筋草炭疽菌的研究相悖。其研究發(fā)現(xiàn)，牛筋草炭疽菌最適氮源為酵母粉?？赡苁遣煌婢郝渌置诿傅姆N類不同，代謝培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的酶活性有所差異，其次代謝方式存在一定差異。本文中哈茨木霉、Xs木霉和擬康氏木霉在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度均達(dá)13.17，9.44，8.78 mm/d，這與Ha等[26]對(duì)P.japonica研究結(jié)果一致，原因是有機(jī)氮是一種植物、土壤和肥料相結(jié)合的含氮物質(zhì)，所以有機(jī)氮較無(wú)機(jī)氮更有利于真菌的產(chǎn)生和積累一些代謝產(chǎn)物[27]，營(yíng)養(yǎng)更加豐富，成分復(fù)雜。有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂肪和生長(zhǎng)因子有利于木腐真菌的生長(zhǎng)繁殖。同時(shí)，尿素作為氮源時(shí)，除黑曲霉平均生長(zhǎng)速度較快以外，剩余4種木腐真菌平均生長(zhǎng)速度均較緩慢，原因可能是尿素會(huì)使培養(yǎng)基pH值增大，影響菌株對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收速度[28]。

pH值是影響真菌生理和生長(zhǎng)的主要因素之一，真菌通常僅限于在接近中性的狹窄 pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)，許美玲等[29]研究發(fā)現(xiàn)外生菌根真菌在弱酸性條件下生長(zhǎng)最好。在本文研究的5種木腐真菌中，固體培養(yǎng)條件下，桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉最適pH值為6，桔綠木霉和黑曲霉最適pH值為5。液體培養(yǎng)條件下，5種真菌大部分最適酸堿度集中在pH=6，同樣是在弱酸性的條件下生長(zhǎng)最好，與周慧杰[30]對(duì)外生菌根真菌的研究結(jié)果一致。同時(shí)，在龔萍[31]對(duì)沙柳沙障的研究中得出偏酸性的土壤能夠促進(jìn)沙柳沙障的腐蝕，證明了木腐真菌更適合在弱酸性條件下生長(zhǎng)，原因是木腐真菌在堿性條件下會(huì)影響真菌細(xì)胞膜和離子的解離度，從而干擾木腐真菌對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[32]，導(dǎo)致木腐真菌不能正常進(jìn)行產(chǎn)物的積累以及代謝。

障體的分解主要是由于真菌的孢子和細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖而引起的。木腐真菌需要在足夠的條件下才可以生長(zhǎng)，主要有營(yíng)養(yǎng)、溫度、水分和酸堿度等。孫芳利等[33]研究得出化學(xué)防腐可以封閉菌類，使菌類缺乏營(yíng)養(yǎng)，以達(dá)到抑制其生長(zhǎng)和繁殖的目的。本文通過(guò)對(duì)5種木腐真菌的研究得出其最適條件，因此可根據(jù)木腐真菌最適營(yíng)養(yǎng)條件選擇合適的化學(xué)藥劑。如秦理哲等[34]研究發(fā)現(xiàn)ACQ防腐處理會(huì)引起馬尾松木材酸堿性質(zhì)、化學(xué)元素組成和官能團(tuán)強(qiáng)度的變化，從而改變木腐真菌最適生長(zhǎng)環(huán)境。范慧青[35]通過(guò)炭化處理降低木材酸堿度和減少木材碳源氮源的供給使真菌的生命活動(dòng)受到限制。本文5種木腐真菌適合弱酸性條件，因此對(duì)于因腐朽進(jìn)行定期更換的沙柳沙障來(lái)說(shuō)，同樣可以通過(guò)不同濃度的ACQ改變木腐真菌最適條件或?qū)φ象w進(jìn)行一定的處理改變障體為微生物提供的生存環(huán)境，以延長(zhǎng)沙柳沙障使用壽命。

4.2 結(jié) 論

桔綠木霉、Xs木霉、哈茨木霉和黑曲霉的最適碳源為葡萄糖，羧甲基纖維素鈉不適合作為5種木腐真菌的碳源；Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉3種木腐真菌最佳氮源為蛋白胨，草酸銨不適合作為Xs木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉的氮源；5種木腐真菌均適合在弱酸性條件下生長(zhǎng)，pH=9時(shí)5種木腐真菌平均生長(zhǎng)速度變緩，特別是哈茨木霉不適合在pH=9的條件下生長(zhǎng)。