朱洪宇, 史志敏

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院 放療科, 江蘇 蘇州, 215010)

肺癌目前是中國(guó)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤, 5年生存率低于18%[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在肺癌中占比為85%, 其治療方式主要有手術(shù)、化放療、靶向藥物治療等[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，多數(shù)NSCLC患者存在表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變，且EGFR合并腫瘤抑制基因共同突變的患者往往預(yù)后不良。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是EGFR突變NSCLC患者的首選治療方案，但治療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，影響預(yù)后[4]。

微小RNA(miRNA)是廣泛參與機(jī)體各種生命活動(dòng)的單鏈小分子非編碼RNA, 其在腫瘤中的差異表達(dá)及在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、化療抵抗、耐藥等方面的調(diào)控作用已被廣泛報(bào)道[5-7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn), miR-338-3p在肺癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，有望成為NSCLC治療的潛在靶點(diǎn)。研究[10]顯示, miR-338-3p可通過(guò)EGFR信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，但對(duì)NSCLC細(xì)胞出現(xiàn)EGFR-TKI耐藥的作用研究較少。本研究探討miR-338-3p對(duì)EGFR-TKI吉非替尼耐藥的肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9/GR凋亡及程序性死亡配體1(pPD-L1)表達(dá)的影響，并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9及其吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9/GR(貨號(hào)YS2301C、YS3629C)購(gòu)自美國(guó)ATCC; RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號(hào)CP680110A)購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司; 吉非替尼、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)抑制劑Fludarabine(貨號(hào)JKLN007404a、JKMK1417B、JKLN020840)購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司; MTT溶液(貨號(hào)JK3297)購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司; miR-338-3p NC、miR-338-3p模擬物及miR-338-3p、U6引物購(gòu)自柏業(yè)貿(mào)易(上海)有限公司; 兔抗p-STAT1、兔抗STAT1、兔抗PD-L1、兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗GAPDH、羊抗兔二抗(貨號(hào)ab109461、ab210524、ab243877、ab196495、ab232479、ab181603、ab133470)購(gòu)自美國(guó)abcam。NAPCO-8800型培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Shellab; MODEL550型酶標(biāo)儀、GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad; Lightcycler 480II型熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)Roche; CytoFLEX型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman coulter。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組: PC-9細(xì)胞、PC-9/GR細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶80%面積，棄培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮變圓后終止消化，吹打?yàn)閱渭?xì)胞并更換新鮮培養(yǎng)液重懸，按1∶2比例分瓶傳代。

取傳代3次的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9、PC-9/GR細(xì)胞，按2×104個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加0、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L吉非替尼，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，以確定吉非替尼用量。此外，傳代3次的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9、PC-9/GR細(xì)胞按2×104個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)后，檢測(cè)細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)。

將PC-9/GR細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-338-3p NC組、miR-338-3p組和STAT1抑制劑組。其中miR-338-3p NC組、miR-338-3p組、STAT1抑制劑組細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染miR-338-3p NC、miR-338-3p模擬物和miR-338-3p模擬物，培養(yǎng)48 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，之后4組均在培養(yǎng)液中加1 μmol/L吉非替尼, STAT1抑制劑組同時(shí)加100 μmol/L的STAT1抑制劑Fludarabine，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)48 h, 使用TRIzol提取細(xì)胞總RNA并檢測(cè)其濃度、純度，以RNA為模板行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，用熒光定量PCR儀檢測(cè)，U6為內(nèi)參基因, miR-338-3p表達(dá)結(jié)果以2-△△Ct法表示。miR-338-3p上游引物: 5′-GTCAGTTCCAGCATCAGTGATT-3′, 下游引物: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6上游引物: 5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 下游引物: 5′-GAGGTATTCGCA CCAGAGGA-3′。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：細(xì)胞培養(yǎng)48 h, 每孔加10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h, 棄上清，每孔加150 μL DMSO, 震蕩5 min, 用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度(OD)值，計(jì)算增殖率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞培養(yǎng)48 h, 收集后按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理，避光孵育15 min, 使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 蛋白印跡(WB)法檢測(cè)細(xì)胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況：細(xì)胞培養(yǎng)48 h, 收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量。取20 μg蛋白樣本, 95 ℃水浴5 min使蛋白變性，上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移目的蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用封閉液封閉1.5 h, 放入一抗(兔抗p-STAT1、兔抗STAT1、兔抗PD-L1、兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗GAPDH)稀釋液(均1∶1 500)中孵育過(guò)夜，放入羊抗兔二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)稀釋液(1∶2 000)中室溫孵育1 h, 化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描圖像，分析條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)量以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PC-9細(xì)胞、PC-9/GR細(xì)胞在不同濃度吉非替尼作用下的增殖率

隨著吉非替尼濃度逐漸升高, PC-9細(xì)胞、PC-9/GR細(xì)胞的增殖率呈逐漸降低趨勢(shì)(P<0.05); 當(dāng)吉非替尼濃度升高至1.00 μmol/L時(shí), PC-9細(xì)胞與PC-9/GR細(xì)胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用1.00 μmol/L作為吉非替尼的處理濃度。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度吉非替尼作用下PC-9細(xì)胞、PC-9/GR細(xì)胞的增殖率比較

2.2 PC-9細(xì)胞、PC-9/GR細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)情況

與PC-9細(xì)胞miR-338-3p表達(dá)水平(1.00±0)相比, PC-9/GR細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)水平(0.84±0.12)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.266,P=0.008)。

2.3 轉(zhuǎn)染后PC-9/GR細(xì)胞miR-338-3p表達(dá)情況

對(duì)照組與miR-338-3p NC組的miR-338-3p表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與對(duì)照組、miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組、STAT1抑制劑組的miR-338-3p表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); miR-338-3p組與STAT1抑制劑組的miR-338-3p表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染后PC-9/GR細(xì)胞miR-338-3p表達(dá)水平比較

2.4 各組PC-9/GR細(xì)胞增殖情況

對(duì)照組與miR-338-3p NC組的PC-9/GR細(xì)胞增殖率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組PC-9/GR細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與miR-338-3p組相比, STAT1抑制劑組PC-9/GR細(xì)胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組PC-9/GR細(xì)胞增殖率比較

2.5 各組PC-9/GR細(xì)胞凋亡情況

對(duì)照組與miR-338-3p NC組的PC-9/GR細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組PC-9/GR細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與miR-338-3p組相比, STAT1抑制劑組PC-9/GR細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

A: 對(duì)照組; B: miR-338-3p NC組; C: miR-338-3p組; D: STAT1抑制劑組。圖1 各組PC-9/GR細(xì)胞凋亡情況

表4 各組PC-9/GR細(xì)胞凋亡率比較

2.6 各組PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

對(duì)照組與miR-338-3p NC組的PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1/STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表達(dá)水平升高, PD-L1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與miR-338-3p組相比, STAT1抑制劑組PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表達(dá)水平降低, PD-L1、Bcl-2蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表5。

表5 各組PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

3 討 論

肺癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，近年來(lái)其發(fā)病率不斷升高。EGFR是原癌基因c-erb B1的表達(dá)產(chǎn)物，屬于酪氨酸激酶受體，在多種腫瘤中高表達(dá)[11]。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，存在EGFR突變的亞洲肺癌患者占50%, 這部分人群體內(nèi)肺癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)依賴于突變的EGFR, 用EGFR-TKI對(duì)其進(jìn)行治療，臨床療效較好，但治療1年內(nèi)均會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥。故解決EGFR-TKI耐藥問(wèn)題是肺癌治療方面比較棘手的問(wèn)題。吉非替尼是第一代EGFR-TKI, 本研究通過(guò)設(shè)置吉非替尼濃度梯度，檢測(cè)PC-9細(xì)胞、PC-9/GR細(xì)胞的增殖率，最終選擇1.00 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中PC-9/GR細(xì)胞的吉非替尼用藥濃度。

研究[14-15]表明, miRNA在腫瘤組織中異常表達(dá)，發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用，參與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展。由于miRNA具有腫瘤病理的特異性，常被認(rèn)為可作為一種新型靶點(diǎn)用于腫瘤的靶向治療。研究[16]顯示, miRNA不僅可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為，在腫瘤發(fā)生放化療抵抗、耐藥等過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用。miR-338-3p是miR-338家族成員，在食道癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎乳頭狀腎細(xì)胞癌、肺鱗癌及甲狀腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)，而在肝細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌及腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)顯著上調(diào)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn), PC-9/GR細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)水平較PC-9細(xì)胞顯著降低，提示miR-338-3p在EGFR-TKI耐藥的PC-9細(xì)胞中差異表達(dá)，其低表達(dá)可能參與PC-9細(xì)胞發(fā)生EGFR-TKI耐藥的機(jī)制。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-338-3p模擬物，上調(diào)miR-338-3p在PC-9/GR細(xì)胞中的表達(dá)水平后, PC-9/GR細(xì)胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高，細(xì)胞中Bcl-2家族促凋亡成員Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，抑凋亡成員Bcl-2蛋白水平[19]顯著降低，提示上調(diào)miR-338-3p可一定程度逆轉(zhuǎn)PC-9/GR細(xì)胞的EGFR-TKI耐藥，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PD-L1是在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的因子，可幫助腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，其高表達(dá)往往與腫瘤預(yù)后不良呈正相關(guān)[20-22]。上調(diào)miR-338-3p表達(dá)后, PC-9/GR細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平顯著降低，提示miR-338-3p可能抑制PC-9/GR細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

STAT1是一種信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，能從各個(gè)角度參與對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活及凋亡的調(diào)控，目前多被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[23-24]。孫思博等[25]研究表明, STAT家族成員在NSCLC獲得性耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示, miR-338-3p表達(dá)上調(diào)后, PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT1/STAT1蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示STAT1激活參與miR-338-3p逆轉(zhuǎn)PC-9/GR細(xì)胞的EGFR-TKI耐藥過(guò)程。在miR-338-3p表達(dá)上調(diào)基礎(chǔ)上，加入STAT1抑制劑抑制STAT1激活后, miR-338-3p表達(dá)無(wú)顯著變化，細(xì)胞增殖率顯著升高，凋亡率顯著降低，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低, PD-L1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步提示miR-338-3p逆轉(zhuǎn)PC-9/GR細(xì)胞的EGFR-TKI耐藥過(guò)程可能與激活STAT1有關(guān)。

綜上所述, miR-338-3p表達(dá)上調(diào)可激活STAT1, 抑制EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9/GR細(xì)胞中PD-L1表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能為臨床解決EGFR-TKI耐藥問(wèn)題提供理論依據(jù)。