夏 群, 王德望, 郭 虹, 王成海

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009; 2. 江蘇省南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院, 江蘇 南京, 211800; 3. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 外科, 江蘇 揚(yáng)州, 225012)

腎細(xì)胞癌(RCC)是起源于腎單位中腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)是RCC最常見的病理學(xué)亞型，約占RCC的80%[2]。局限性ccRCC可以通過部分或全部手術(shù)切除腎臟來治療，但找到ccRCC早期診斷、治療的靶目標(biāo)仍然是一個臨床難題。癌癥是一種復(fù)雜的遺傳疾病，其不僅由蛋白質(zhì)編碼基因的失調(diào)引起，還且由非編碼RNA (ncRNA)的失調(diào)引起。研究[3-4]表明，長鏈非編碼RNA影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。uc.339作為一種長鏈非編碼RNA, 也參與了腫瘤的微環(huán)境，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程[5]。目前, uc.339在腎癌中的功能和發(fā)生機(jī)理的文獻(xiàn)報道較少，故本研究重點關(guān)注uc.339對腎細(xì)胞癌的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

76例新鮮的腎透明細(xì)胞癌組織和鄰近正常組織來源于揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)患者，手術(shù)時間為 2019年1月—2021年1月，年齡31～75 歲，中位年齡為 53歲; 男48例，女28例。透明細(xì)胞癌的診斷由病理科醫(yī)師負(fù)責(zé)。所有患者手術(shù)前未經(jīng)過放療和化療處理。標(biāo)本使用及臨床資料的收集均經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。新鮮標(biāo)本采集后立即放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱內(nèi)長期保存，以備后期實驗所用。

1.2 材料和細(xì)胞

人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O細(xì)胞株購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。腎癌細(xì)胞系在RPMI-1640培養(yǎng)基(US)中培養(yǎng)，并添加青霉素G(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)和10%胎牛血清(FBS)。所有細(xì)胞系均在37 ℃、含5% CO2的增濕空氣中培養(yǎng)。K-RAS抗體購自美國Abcam。過表達(dá)/敲低uc.339載體質(zhì)粒購買于上海生工生物工程公司。

1.3 RNA原位分子雜交實驗(RISH)

uc.339 RNA探針和原位雜交試劑盒購于武漢BOSTER生物工程有限公司，探針序列5′-GGATCGGTGTGAAATAACGGGCCCATATAAATCCC-3′。主要實驗步驟如下: 將厚度5 μm切片用胃蛋白酶消化RNA核酸片段。先是預(yù)雜交，然后使用uc.339 RNA探針進(jìn)行雜交, H2O2封閉液后滴加抗地高辛, 1 h后滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，最后滴加生物素化過氧化物酶。使用DAB將陽性物質(zhì)染成棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，用蘇木素將胞核染成藍(lán)色進(jìn)行對比，封片后光鏡觀察。結(jié)果判定: 細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為uc.339陽性細(xì)胞; 光鏡下隨機(jī)選擇5個高倍視野，計算陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分率, <1%為陰性, 1%～100%為陽性。根據(jù)試劑說明書推薦設(shè)置陽性對照組，不加探針的染色組織為空白對照組。

1.4 CCK8實驗檢測細(xì)胞增殖活性

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞(實驗組和對照組)按照每個孔內(nèi)添加4 000個細(xì)胞，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每個孔內(nèi)添加100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按1∶10的比例混合CCK8培養(yǎng)液與相應(yīng)培養(yǎng)液，備用。棄去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL CCK-8溶液。置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育30～60 min。使用酶標(biāo)儀測定每孔液體在450 nm波長下的吸光度(OD)變化。

1.5 Transwell侵襲遷移實驗

用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸浮液(2×105/mL); 若進(jìn)行侵襲實驗，將Matrigel膠用無血清培養(yǎng)基稀釋至300 μL/mL, 取100 μL均勻涂抹PET膜上表面，然后將小室輕輕放入24孔板孔內(nèi), 37 ℃放置3 h左右，取出于超凈工作臺過夜干燥(如進(jìn)行遷移實驗，則跳過此步驟)。在下室加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)孵化24 h; 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，添加95%的乙醇固定15 min, 用結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選5個視野，在光鏡下統(tǒng)計侵襲遷移數(shù)量。

1.6 生物信息學(xué)預(yù)測下游靶基因及驗證

uc.339的靶基因微小RNA(miRNA)預(yù)測見先前的文獻(xiàn)[6]。miR-95-5p (miR-95)下游靶基因預(yù)測網(wǎng)站為www.targetscan.org 和mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php。miR-95下游靶基因的有效驗證通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?/p>

1.7 Western blot檢測蛋白的表達(dá)

實驗組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，在細(xì)胞中加入RIPA液[含1% 苯甲磺酰氟(PMSF)], 冰上裂解30 min, 然后4 ℃、12 000 g離心15 min, 吸取上清并分裝，以BCA方法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)采用10%分離膠、5%濃縮膠。把2×Loading Buffer添加到蛋白溶液中，在100 ℃前提下孵化5 min。每個上樣孔中分別加入30 μg蛋白樣品，電泳使用70 V的電壓，觀察染料到達(dá)分離膠時，調(diào)整電壓為100 V繼續(xù)電泳，觀察溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的下端時，終止電泳。把凝膠取出，裁剪合適大小的NC膜，放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡備用。設(shè)置200 mA恒流、冰上轉(zhuǎn)膜50 min。把NC膜置于5%牛血清白蛋白內(nèi)，于室溫環(huán)境孵育2 h。將一抗(1∶1 000)溶液稀釋后放入NC膜，放在4 ℃孵化12 h。最后用二抗工作液浸泡NC膜, 37 ℃結(jié)合2 h。按照顯色后分析條帶的灰度值計算蛋白表達(dá)水平。將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參。

1.8 Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞4×106/mL, 緩沖液洗滌，用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min。離心、緩沖液洗滌后，加入熒光SA-FLOUS溶液。 4 ℃下孵育20 min, 避光并不時振動。然后使用流式細(xì)胞儀檢測FITC熒光和PI染料。結(jié)果判斷: 在散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FITC-/PI-); 右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為(FITC+/PI+); 而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(FITC+/PI- )。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 uc.339在ccRCC組織中的表達(dá)情況

ccRCC常規(guī)HE染色顯示，癌細(xì)胞排列腺泡狀或管狀似腎小管，癌細(xì)胞大小不一，胞漿透明(圖1A)。RISH結(jié)果表明, 76例ccRCC組織中uc.339 陽性染色為深淺不一的棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和胞核(圖1B); 癌旁正常腎小管組織中為陰性表達(dá)，偶有棕黃色顆粒(圖1C)。uc.339 在ccRCC組織中的陽性百分比值為(0.814±0.126), 高于癌旁正常組織 (0.081±0.023), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.268,P<0.05); 陽性百分比<1%為陰性病例(17例), 1%～100%為陽性病例(59例)。

2.2 uc.339的陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

在76例ccRCC組織中，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比, uc.339陽性例數(shù)為59例，陰性例數(shù)17例。統(tǒng)計結(jié)果顯示, uc.339的陽性表達(dá)與腫瘤的大小、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05), 但是與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表1。

表1 uc.339的陽性表達(dá)及其臨床病理意義

與對照組比較, *P<0.05。圖2 uc.339對腎癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 uc.339促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖活性

過表達(dá)uc.339后，腎癌細(xì)胞的增殖活性升高(P<0.05); 敲低uc.339表達(dá)后，腎癌細(xì)胞的增殖活性降低(P<0.05)。說明uc.339能增加腎癌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)腎癌細(xì)胞的生長。見表2、圖2。

表2 uc.339對腎癌細(xì)胞增殖活性(OD值)影響

2.4 uc.339抑制腎癌細(xì)胞的凋亡

在786-O細(xì)胞中，對照組細(xì)胞凋亡的數(shù)目為13.9%, 細(xì)胞壞死的數(shù)目為12.6%; 過表達(dá)uc.339后，細(xì)胞凋亡數(shù)目(7.8%, Q4)和細(xì)胞壞死數(shù)目(7.2%, Q2)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 降低uc.339表達(dá)后，細(xì)胞凋亡數(shù)目(21.8%, Q4)和細(xì)胞壞死數(shù)目(20.4%, Q2)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明uc.339在抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的同時促進(jìn)了細(xì)胞的生長。見圖3。

2.5 uc.339對腎癌細(xì)胞遷移的影響不大

Transwell結(jié)果表明，與對照組相比，過表達(dá)uc.339后腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)目無增多，敲低uc.339表達(dá)后的腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)目也未減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

A: 常規(guī)HE染色顯示癌細(xì)胞排列腺泡狀或管狀似腎小管,癌細(xì)胞胞漿透亮; B: ccRCC組織中uc.339呈陽性棕黃色染色; C: 癌旁正常腎小管組織中呈陰性或弱陽性表達(dá)。圖1 uc.339在ccRCC組織中的表達(dá)(放大倍數(shù)為200倍和400倍)

2.6 uc.339的下游靶基因的預(yù)測及驗證

uc.339預(yù)測的下游miRNA[6], 包括miR-339-3P、miR-95和miR-663b-3P。在腎癌細(xì)胞中改變uc.339的表達(dá)后僅僅miR-95隨之變化(圖5), 因此得出miR-95是uc.339的下游靶基因。同時根據(jù)miRNA網(wǎng)站預(yù)測出miR-95的靶基因，再結(jié)合雙熒光素酶報告實驗驗證(圖6)得出K-RAS是miR-95的靶基因。在轉(zhuǎn)染K-RAS3′UTR 野生型后, miR-95 高表達(dá)可抑制相應(yīng)的熒光活性，而在轉(zhuǎn)染突變型后miR-95則無這種抑制作用。因此miR-95與K-RAS的結(jié)合是特異性的。K-RAS3′UTR是miR-95的直接結(jié)合位點,K-RAS是miR-95的直接靶基因。

2.7 uc.339對miR-95/K-RAS信號通路和增殖的影響

改變uc.339和miR-95表達(dá)后，觀察K-RAS蛋白的變化。實驗組包括: 過表達(dá)uc.339組、敲低uc.339表達(dá)組、過表達(dá)uc.339組+過表達(dá)miR-95組、敲低uc.339表達(dá)組+敲低miR-95表達(dá)組、過表達(dá)uc.339組+敲低miR-95表達(dá)組和敲低uc.339表達(dá)組+過表達(dá)miR-95組。另設(shè)立對照組(未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒)。結(jié)果顯示, uc.339能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的K-RAS蛋白表達(dá); 功能研究證實，過度表達(dá)miR-95可以消除uc.339對腎癌增殖的促進(jìn)作用，而降低miR-95的表達(dá)可進(jìn)一步激發(fā)腎癌細(xì)胞的增殖能力，因而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的生長。見圖7、表3。

表3 Rescue回復(fù)實驗對腎癌細(xì)胞增殖活性(OD值)影響

圖3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死情況

圖4 腎癌細(xì)胞的遷移情況(放大倍數(shù)為400倍)

A: 過表達(dá)uc.339對miRNA影響; B: 降低uc.339表達(dá)對miRNA影響，過表達(dá)uc.339后miR-95的表達(dá)水平下降(P<0.05), miR-339-3P和miR-663b-3P表達(dá)水平變化不大P>0.05); 降低uc.339表達(dá)后miR-95的表達(dá)水平升高(P<0.05), miR-339-3P和miR-663b-3P表達(dá)水平仍然變化不大(P>0.05)。與對照組比較, *P<0.05。

3 討 論

腎癌是最常見的惡性腫瘤之一，在所有新發(fā)癌癥病例中占4.2%[7]。腎癌最常見的病理類型是腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)，其發(fā)病率和死亡率逐年上升[8]。雖然局部ccRCC可以通過腎臟手術(shù)消融治療，使得患者病情有所好轉(zhuǎn)，但最終晚期患者的預(yù)后較差, 5年總生存率(OS)低于20%[9], 主要是因為用于ccRCC早期檢測和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物有限[10]。因此尋找新的生物標(biāo)志物就變得尤其迫切。通過ncRNA的測序[11]和生物信息學(xué)[12]挖掘可以快速選擇可能的靶點，為治療和干預(yù)腎透明細(xì)胞癌患者提供理論基礎(chǔ)。本研究通過預(yù)測uc.339的下游靶基因，為研究uc.339在腎癌中的作用提供了依據(jù)。

A: K-RAS 3'UTR(69～75位)與miR-95種子序列(1～7位) 有直接的結(jié)合位點; B: 雙熒光素酶報告質(zhì)粒與野生型或突變型K-RAS 3'UTR的關(guān)系圖。 C: 野生型或突變型K-RAS 3'UTR質(zhì)粒與miR-95共轉(zhuǎn)染后,測定786-O細(xì)胞熒光素酶的相對活性。與NC比較, *P< 0.05。圖6 雙熒光素酶報告實驗驗證

uc.339定位于12號染色體52357363～52357614區(qū)間，全長252 nt, 是超保守RNA(UCR)中的一員，屬于長鏈非編碼RNA, 但也有其獨自的特點，主要表現(xiàn)為其在遠(yuǎn)親哺乳動物物種(如人類、小鼠、大鼠)的同源區(qū)域具有100%的相似性[13]。在人類基因組中共有483個UCR, 一些UCR在癌癥中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)[14]。例如, uc.339的高表達(dá)與210例非小細(xì)胞肺癌患者的低生存率相關(guān)。uc.339作為miR-339、miR-663b和miR-95的內(nèi)源性競爭RNA(ceRNA), 通過海綿作用抑制這些miRNAs, 使得靶基因cyclin E2具有更高的表達(dá)水平，引起肺癌細(xì)胞生長加速和遷移能力增加[6]。SANA J等[15]發(fā)現(xiàn)54例大腸癌和15例鄰近正常組織中uc.339、uc. 43、uc. 73、uc. 134、uc. 230、uc. 399和uc. 388的表達(dá)水平與大腸癌臨床病理特征相關(guān)。MORANDI L等[16]研究結(jié)果表明, 7個UCRs(uc.339，uc. 160, uc. 283, uc. 416, uc. 270, uc. 299和 uc. 328)在人類和其他哺乳動物鱗狀細(xì)胞癌中高度甲基化。這些結(jié)論闡明了uc.339在人類腫瘤中的作用，也為uc.339在腎癌中研究提供了依據(jù)。本研究結(jié)果顯示, uc.339在ccRCC組織中呈陽性表達(dá)，并與腫瘤大小、腫瘤TNM分期密切相關(guān)。過表達(dá)uc.339能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖并能抑制細(xì)胞凋亡。這就說明uc.339在腎癌細(xì)胞中也是一個促癌基因，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，進(jìn)一步證實了uc.339能在不同腫瘤中起到重要的作用。VANNINI I等[6]結(jié)果還表明uc.339能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移能力，但本研究未發(fā)現(xiàn)uc.339在腎癌細(xì)胞中有促進(jìn)遷移的能力，究其原因可能是uc.339在不同腫瘤中的作用具有差異。

在腎癌機(jī)制方面的研究中，本研究表明uc.339僅作為miR-95的海綿體，吸引并抑制其對下游靶基因K-RAS的調(diào)控。K-RAS基因在多種腫瘤中容易出現(xiàn)基因突變，是一種常見的致癌基因。在非小細(xì)胞肺癌中K-RAS突變后抑制AKT1表達(dá)，激活MARCKS-LAMC2復(fù)合體促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[17]。在胰腺癌中K-RAS基因突變后蛋白活化，從而導(dǎo)致激活Hedgehog通路和NF-κB蛋白表達(dá)，參與胰腺癌的發(fā)生[18]。K-RAS表達(dá)增高和Smad4表達(dá)降低，相互作用影響表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)，導(dǎo)致p65的表達(dá)升高，激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和uPA表達(dá)上調(diào)，引起癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19]。K-RAS是RASSF1A下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個效應(yīng)物,RASSF1A基因可能因甲基化等因素，導(dǎo)致其表達(dá)缺失，對K-RAS的抑制作用解除,K-RAS更多地發(fā)揮促進(jìn)生長效應(yīng)，而最終導(dǎo)致大腸癌和非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[20-21]。本研究并未去檢驗K-RAS基因有無突變位點，而是發(fā)現(xiàn)其在腎癌中表達(dá)水平升高, miR-95被uc.339大量的內(nèi)源性競爭，解除了miR-95對K-RAS的轉(zhuǎn)錄后抑制，導(dǎo)致其高水平表達(dá); 亦不排除uc.339直接促進(jìn)K-RAS的表達(dá)。在功能性研究中, uc.339能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖活性并抑制細(xì)胞凋亡，可以理解為uc.339能縮短細(xì)胞的生長周期時間，且成熟的腎癌細(xì)胞也不會輕易凋亡死掉，從而使得腫瘤瘤體不斷增大，為后續(xù)的腫瘤發(fā)生發(fā)展做準(zhǔn)備。

綜上所述, uc.339通過下調(diào)miR-95表達(dá)后，升高K-RAS的蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的生長，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡。這一研究為豐富腎癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了新的內(nèi)容，也為今后在ccRCC研究中，開發(fā)基于uc.339的診斷指標(biāo)和治療靶點提供一定的理論依據(jù)。