霍寧，詹曉萍，周夢(mèng)竹，張躍，梁雪，李廣平，劉長(zhǎng)樂(lè)

心房顫動(dòng)（AF）是臨床中最常見(jiàn)的心律失常之一［1］。近幾年AF發(fā)生率不斷增高，75歲以上人群可達(dá)10%，且與冠心病、高血壓、腦卒中和心力衰竭等疾病存在密切關(guān)系［2-3］。促進(jìn)AF 發(fā)生的機(jī)制眾多，如心臟炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心肌纖維化等。其中心肌纖維化是無(wú)法逆轉(zhuǎn)的，使得AF 治療更加困難［4］。糖尿病（DM）是AF 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［5］，可改變心房肌細(xì)胞的排列順序，使間質(zhì)纖維化增多，心房肌細(xì)胞內(nèi)徑增大，引發(fā)電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)，促使AF 發(fā)生［6］。格列本脲（GLB）是一種經(jīng)典的磺酰脲類(lèi)降糖藥，適用于通過(guò)單純飲食控制未能達(dá)到理想血糖水平的輕、中度2 型糖尿病患者［7］。除具有降糖作用外，GLB 在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等疾病中也起到抑制炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，減少組織纖維化的作用［8-10］。但GLB與心肌組織纖維化的相關(guān)研究較少，本研究旨在探索GLB 是否可以抑制DM 動(dòng)物模型心肌組織纖維化的產(chǎn)生以及對(duì)AF 誘發(fā)率的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 檸檬酸鈉緩沖液、鏈脲佐菌素、Masson 染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；血糖試紙條、血糖儀購(gòu)于三諾生物傳感股份有限公司；GLB（2.5 mg×100 片）購(gòu)于天津太平洋制藥有限公司；電子體重秤購(gòu)于北京電子儀器公司；小動(dòng)物心臟彩色超聲儀購(gòu)于美國(guó)Visual Sonics公司；心內(nèi)電生理刺激器∕放大器（STG3008-FA）購(gòu)于澳大利亞ADInstruments 公司；心外膜激活映射標(biāo)測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)MappingLab 公司；TP1020全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)、病理石蠟切片機(jī)、石蠟切片展片機(jī)、病理組織烤片機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica公司；生物組織包埋機(jī)（BMJ-1）購(gòu)于上海珂淮有限公司，無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)購(gòu)于Softron biotechnology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。將48只體質(zhì)量200~220 g的健康成年雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組（Ctl組）、糖尿病組（DM組）和糖尿病+格列本脲組（GLB組），每組16只。每組按隨機(jī)數(shù)字表法抽取8只進(jìn)行心臟超聲檢查，隨后行無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)并留取心臟組織進(jìn)行組織病理實(shí)驗(yàn)，另8只行在體心臟電生理實(shí)驗(yàn)以及心外膜激活映射標(biāo)測(cè)。

1.3 DM動(dòng)物模型建立 造模前大鼠禁食12 h。將鏈脲佐菌素溶解于檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol∕L，pH=4.5）中配成鏈脲佐菌素溶液并使用0.22μm 一次性過(guò)濾器充分過(guò)濾雜質(zhì)2 遍，以55 mg∕kg 的劑量經(jīng)腹腔快速注射入大鼠體內(nèi)。藥物注射后3 d及7 d測(cè)量大鼠空腹血糖（禁食12 h，不禁水），2次空腹血糖均≥11 mmol∕L或單次≥14 mmol∕L視為DM大鼠模型建立成功。如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空腹血糖未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)，則以55 mg∕kg劑量追加鏈脲佐菌素1次；如追加藥物后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空腹血糖仍未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)則剔除實(shí)驗(yàn)。造模成功當(dāng)日，對(duì)GLB組大鼠以10 mg∕kg（將GLB研磨成粉末狀，加入蒸餾水混合）劑量GLB 灌胃。將各組大鼠置于相同環(huán)境下飼養(yǎng)6 周，記錄第6周空腹血糖及體質(zhì)量。

1.4 心臟超聲檢查 造模成功6周后，剪去動(dòng)物前胸及四肢末端體毛，連接體表心電圖并行經(jīng)胸二維超聲心動(dòng)圖檢查。應(yīng)用高分辨率小動(dòng)物超聲，心尖四腔切面測(cè)量二尖瓣血流頻譜舒張?jiān)缙诓ǚ逯邓俣龋‥）、舒張晚期波峰值速度（A），于左心室長(zhǎng)軸及短軸觀(guān)測(cè)左心房?jī)?nèi)徑、左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率、E∕A、肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間、平均肺動(dòng)脈壓、收縮與舒張期室間隔、左心室內(nèi)徑和左心室后壁厚度。共測(cè)量3次。

1.5 無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè) 心臟超聲檢查結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)。提前將大鼠放于室內(nèi)保持安靜以適應(yīng)環(huán)境，待穩(wěn)定后，固定大鼠并對(duì)尾巴進(jìn)行加溫使血管擴(kuò)張，利于檢測(cè)，大鼠穩(wěn)定10 min 后測(cè)定心率、收縮壓和舒張壓，計(jì)算平均動(dòng)脈壓，共進(jìn)行3次測(cè)量，每次間隔20 s。

1.6 組織病理學(xué)檢測(cè) 完成無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定后，開(kāi)胸取大鼠心臟置于4 ℃PBS 緩沖液中，擠去殘血并剪除多余組織，稱(chēng)取心臟總質(zhì)量后將心房肌組織用于組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。將組織放于10%中性福爾馬林液中固定10~14 d，經(jīng)乙醇梯度脫水后用石蠟包埋并切片，行Masson 染色。每只動(dòng)物取Masson染色切片在400 倍視野下隨機(jī)讀取5 個(gè)視野的圖像存入電腦，后使用Image J v1.8.0軟件測(cè)量膠原總面積及圖像組織總面積，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）。

1.7 在體電生理實(shí)驗(yàn)以及心外膜激活映射標(biāo)測(cè) 造模成功6 周后，將各組動(dòng)物用3%三溴乙醇溶液（150 mg∕kg）全身麻醉，剪開(kāi)頸部皮膚，將右側(cè)頸靜脈分離，結(jié)扎頸靜脈后插入電極導(dǎo)絲進(jìn)行房室文氏周長(zhǎng)、竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間、有效不應(yīng)期、AF誘發(fā)率的檢測(cè)（每只大鼠行15次刺激，每組合計(jì)誘發(fā)總次數(shù)為120 次；AF 誘發(fā)率=誘發(fā)成功次數(shù)∕誘發(fā)總次數(shù)×100%）。之后游離氣管進(jìn)行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)后開(kāi)胸行心外膜激活映射標(biāo)測(cè)，將記錄電極陣列（6格×6格）置于心臟表面，記錄絕對(duì)不均勻指數(shù)與傳導(dǎo)相對(duì)異質(zhì)性、心外膜傳導(dǎo)速度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間多重比較采用Dunn's（經(jīng)Bonferron 法校正）檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 周時(shí)基本特征及心臟超聲指標(biāo)比較 與Ctl組相比，DM組的心臟體質(zhì)量比、心房體質(zhì)量比、心室體質(zhì)量比、血糖水平、E∕A比值、左心房?jī)?nèi)徑均增加，體質(zhì)量、心率、舒張期左心室后壁厚度、收縮期左心室后壁厚度和舒張期室間隔厚度均降低（P＜0.05）；與DM組相比，GLB組的心臟體質(zhì)量比降低，左心房?jī)?nèi)徑減小。余指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2 在體心外膜激活映射標(biāo)測(cè)比較 DM 組較Ctl組心外膜傳導(dǎo)速度降低，傳導(dǎo)相對(duì)異質(zhì)性增加；與DM組相比，GLB組心外膜傳導(dǎo)速度提高（P＜0.05），傳導(dǎo)相對(duì)異質(zhì)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、表2。

2.3 心房肌病理比較 Ctl組、DM組和GLB組CVF（%）分別為0.97±0.40、7.54±1.11 和3.73±1.06，3 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=90.711，P＜0.01）；GLB組和DM組較Ctl 組心房肌纖維化程度加重，CVF 增大（P＜0.05）。GLB 組較DM 組心房肌纖維化程度減輕，CVF減?。≒＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 在體電生理結(jié)果比較 在體電生理學(xué)研究表明，與Ctl 組相比，DM 組的R-R 間期、文式周長(zhǎng)、有效不應(yīng)期延長(zhǎng)，AF 誘發(fā)率升高（P＜0.05）；GLB 組較DM 組R-R 間期縮短，AF 誘發(fā)率下降（P＜0.05）。3組間竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

Fig.1 The mapping results of rat epicardial activation between the three groups圖1 3組大鼠心外膜激活映射標(biāo)測(cè)結(jié)果

Fig.2 Pathological results of atrial muscle in three groups of rats（Masson dyeing,×400）圖2 3組大鼠的心房肌病理結(jié)果（Masson染色，×400）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標(biāo)測(cè)結(jié)果比較（n=8，±s）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標(biāo)測(cè)結(jié)果比較（n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Ctl組比較，b與DM組比較，P＜0.05。

組別Ctl組DM組GLB組F心外膜傳導(dǎo)速度（m∕s）0.73±0.05 0.52±0.11a 0.70±0.12b 9.126＊＊絕對(duì)不均勻指數(shù)2.80±0.34 3.11±0.83 2.86±0.29 0.641傳導(dǎo)相對(duì)異質(zhì)性1.44±0.34 2.11±0.53a 1.62±0.35 4.762＊

3 討論

研究表明，DM 促進(jìn)AF 發(fā)生涉及多種因素。隨著疾病進(jìn)展，DM 患者AF 的發(fā)生率增高［11］。DM 動(dòng)物模型的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)可引起心肌細(xì)胞以及結(jié)締組織重新排列［12］；高血糖可刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖，使神經(jīng)體液級(jí)聯(lián)反應(yīng)與氧化應(yīng)激增強(qiáng)，這些反應(yīng)均會(huì)導(dǎo)致組織纖維化程度加重。糖基化終產(chǎn)物是指氨基酸、脂類(lèi)或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖的醛基經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)后產(chǎn)生的終末產(chǎn)物。在高糖狀態(tài)刺激下，糖基化終產(chǎn)物逐漸積累，促進(jìn)組織增生肥大且加重纖維化，加強(qiáng)其炎癥反應(yīng)［13］，最終導(dǎo)致心臟發(fā)生電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)，電位活動(dòng)發(fā)生異常，AF發(fā)生率增高。本研究以心臟超聲指標(biāo)與病理染色評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)，在體心外膜激活映射標(biāo)測(cè)與在體電生理實(shí)驗(yàn)評(píng)估心臟電重構(gòu)。

Zhan 等［14］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)注射血管緊張素Ⅱ的小鼠服用一種日本植物藥rikkunshito 后，心房纖維化程度較對(duì)照組減輕，AF誘發(fā)率下降。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，DM 組心房肌纖維化程度比Ctl組明顯加重，經(jīng)過(guò)GLB 治療的DM 大鼠心房肌纖維化程度減輕，AF誘發(fā)率下降。心臟體質(zhì)量比是反映心臟肥厚的有效指標(biāo)。Qin 等［15］發(fā)現(xiàn)心臟肥厚的小鼠心臟體質(zhì)量比顯著大于正常小鼠。本研究DM組大鼠心臟體質(zhì)量比、心房體質(zhì)量比和心室體質(zhì)量比均顯著大于Ctl組，其中心臟體質(zhì)量比與心室體質(zhì)量比在GLB 組中得到顯著改善。DM動(dòng)物模型中左心房?jī)?nèi)徑顯著擴(kuò)大［16］。左心房?jī)?nèi)徑可作為導(dǎo)管射頻消融術(shù)患者AF 復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因子，與AF 發(fā)生率關(guān)系密切［17］。有研究納入3 750例環(huán)肺靜脈隔離術(shù)的患者，發(fā)現(xiàn)左心房擴(kuò)張可顯著增加術(shù)后AF復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［18］。研究發(fā)現(xiàn)飲酒者心房?jī)?nèi)徑可以伴隨乙醇攝入量增加而增大，AF 發(fā)生率也隨之提高［19］。本研究DM 大鼠在高血糖刺激下左心房?jī)?nèi)徑增大，AF 誘發(fā)率上升，與既往研究結(jié)果一致，經(jīng)GLB 治療后，左心房?jī)?nèi)徑減小，AF 誘發(fā)率顯著下降。近期有研究表明，與左心房?jī)?nèi)徑相比，左心房球形度是預(yù)測(cè)AF 發(fā)生更加敏感的指標(biāo)［20］，DM 對(duì)于動(dòng)物左心房球形度改變的影響以及是否可作為AF 發(fā)生的預(yù)測(cè)指標(biāo)有待進(jìn)一步研究。

Tab.3 Electrophysiological results of the three groups of rats表3 3組大鼠電生理結(jié)果 （n=8）

DM對(duì)于心臟電活動(dòng)有較大影響，高血糖狀態(tài)下心肌纖維化程度加重，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激刺激可導(dǎo)致心肌動(dòng)作電位時(shí)間延長(zhǎng)，電位幅度減小，復(fù)極離散度增大［21］。Gong 等［22］研究表明，DM 可顯著降低大鼠的心外膜傳導(dǎo)速度，增加絕對(duì)不均勻指數(shù)與傳導(dǎo)相對(duì)異質(zhì)性。本研究中DM 組大鼠較Ctl 組大鼠傳導(dǎo)相對(duì)異質(zhì)性顯著增大，心外膜傳導(dǎo)速度顯著降低，經(jīng)GLB治療后可提高心外膜傳導(dǎo)速度，但3組動(dòng)物模型中絕對(duì)不均勻指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Karam 等［12］發(fā)現(xiàn)DM 患者有效不應(yīng)期較正常人群縮短。但相關(guān)研究表明DM動(dòng)物模型有效不應(yīng)期較正常組延長(zhǎng)［23-24］，與本研究結(jié)果一致，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

Spallone 等［25］發(fā)現(xiàn)DM 患者由于迷走神經(jīng)功能損害以及交感神經(jīng)敏感性增加，心率可高于非DM人群。本實(shí)驗(yàn)中DM 組與GLB 組心率低于Ctl 組。筆者分析認(rèn)為可能由于此次造模時(shí)間較短，自主神經(jīng)功能未受明顯影響，下一步可以延長(zhǎng)造模時(shí)間，探究大鼠DM 狀態(tài)對(duì)自主神經(jīng)功能的影響。Diwan等［8］發(fā)現(xiàn)GLB在可以改善慢性腎臟病大鼠腎臟結(jié)構(gòu)并減少纖維化，且經(jīng)GLB 治療的大鼠收縮壓得到改善，但并未發(fā)現(xiàn)對(duì)心臟纖維化的作用。本研究中GLB 組大鼠心房肌組織纖維化明顯改善，但未發(fā)現(xiàn)對(duì)血壓有影響，分析可能由于動(dòng)物模型不同，本研究中3組大鼠的血壓均處于正常范圍［26］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DM 可以提高大鼠的AF誘發(fā)率，GLB 通過(guò)改變其電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)降低其AF 誘發(fā)率。今后將從基因、蛋白水平進(jìn)一步探究GLB 在DM動(dòng)物模型中改善心房電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及降低AF誘發(fā)率的具體機(jī)制。