向顯玉,黃 靜,劉愛(ài)平,周 康,劉書亮,敖曉琳,*
(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625014;2.千禾味業(yè)食品股份有限公司,四川 眉山 620010)
干發(fā)酵香腸一般可作為即食發(fā)酵肉制品,在世界范圍內(nèi)深受消費(fèi)者喜愛(ài)。傳統(tǒng)干發(fā)酵香腸主要以自然發(fā)酵為主,存在一定的食品安全隱患[1],同時(shí)由于干發(fā)酵香腸的營(yíng)養(yǎng)豐富,且其傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程沒(méi)有滅菌處理,所以容易存在沙門氏菌污染,成為食源性疾病的食品來(lái)源之一。本文對(duì)即食干發(fā)酵香腸生產(chǎn)過(guò)程中沙門氏菌的污染現(xiàn)狀、生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)沙門氏菌的減菌措施及減菌效果以及沙門氏菌對(duì)減菌措施的應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行綜述,以期為即食干發(fā)酵香腸生產(chǎn)過(guò)程中沙門氏菌減菌措施的選擇,以及開(kāi)發(fā)新型的沙門氏菌減菌措施提供一定的參考。
干發(fā)酵香腸一般可作為即食發(fā)酵肉制品,在世界范圍內(nèi)深受消費(fèi)者喜愛(ài)。干發(fā)酵香腸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式通常是將瘦肉(一般是豬肉或牛肉)與脂肪(一般是豬肉脂肪)按質(zhì)量比2∶1切碎后與香料、鹽、糖、發(fā)酵劑混合,然后將混合物裝入不同直徑的腸衣中,經(jīng)發(fā)酵、干燥、煙熏或不煙熏制成[2]。發(fā)酵劑通常是單一種類的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)或與其他微生物(葡萄球菌、霉菌和酵母等)混合的LAB。發(fā)酵過(guò)程中,LAB生長(zhǎng)可以將糖轉(zhuǎn)化為乳酸,引起pH值降低[3]。發(fā)酵的溫度通常為15~26 ℃,相對(duì)濕度為90%左右;干燥成熟過(guò)程一般采用自然風(fēng)干或梯度降溫降濕等方式,溫度一般在12~15 ℃,相對(duì)濕度比香腸內(nèi)相對(duì)濕度低5%~10%,發(fā)酵和干燥結(jié)束后通常會(huì)使干發(fā)酵香腸的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至35%左右,且水分活度(water activity,aw)不高于0.90[4-6]。但是不同地區(qū)的干發(fā)酵香腸具有不同特點(diǎn),其主要類型及特點(diǎn)如表1所示。
表1 干發(fā)酵香腸的主要類型及其特點(diǎn)[4,7-8]Table 1 Major types and characteristics of dry fermented sausages[4,7-8]
沙門氏菌是一種人畜共患病原體,通常在食用受污染的食物時(shí)傳播給人類,也可以通過(guò)與動(dòng)物或其環(huán)境接觸傳播,沙門氏菌是引起歐盟和歐洲經(jīng)濟(jì)區(qū)食源性疾病的重要原因[9]。人類感染的最常見(jiàn)感染源是動(dòng)物源性食品,豬肉是最主要的來(lái)源之一[10]。被沙門氏菌污染的即食發(fā)酵肉制品也會(huì)引起食源性疾病,早在1990年,美國(guó)食品安全檢驗(yàn)局就開(kāi)始對(duì)即食食品進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)[11]。最近幾年,歐盟的沙門氏菌流行率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),2015年沙門氏菌占食源性疾病暴發(fā)原因的10%左右,2016年以及2017年均超過(guò)20%,2018年突破30%。其中沙門氏菌主要出現(xiàn)在新鮮豬肉、牛肉、雞肉樣品及其相關(guān)肉制品中[12-14]。在美國(guó),2015—2017年由沙門氏菌引起的食源性疾病均超過(guò)總病例的30%,其中由豬肉引起的病例占10%~20%[15-17]。
在干發(fā)酵香腸的傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中,沙門氏菌的潛在來(lái)源可能包括受污染的生肉、添加成分、加工設(shè)備、后處理過(guò)程和加工人員等。近年來(lái),干發(fā)酵香腸中的沙門氏菌仍有較高的檢出率,如表2所示,這可能是豬肉發(fā)酵香腸成為沙門氏菌病主要來(lái)源的一個(gè)重要原因[3]。
表2 干發(fā)酵香腸中沙門氏菌的檢出率Table 2 Detection rates of Salmonella in dry fermented sausages
有研究表明,pH值、aw和微生物種類以及發(fā)酵和干燥條件的組合阻止了干腌火腿生產(chǎn)過(guò)程中沙門氏菌的生長(zhǎng)并可以在4 ℃下35 d的保質(zhì)期內(nèi)控制食源性病原體[21]。這表明干發(fā)酵香腸的傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程也可能對(duì)沙門氏菌的生存造成一定的威脅,例如在發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵劑引起的pH值降低,干燥成熟過(guò)程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和aw的降低、滲透壓升高等。干發(fā)酵香腸傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中沙門氏菌數(shù)量的減少量如表3所示。
表3 干發(fā)酵香腸傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中沙門氏菌數(shù)量的減少量Table 3 Reduction of Salmonella in traditional production of dry fermented sausages
由表3可知,傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程可以一定程度上減少沙門氏菌,但其減少量均低于美國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的即食肉制品發(fā)酵過(guò)程中沙門氏菌減少7.0(lg(CFU/g))的目標(biāo)[26],并且沙門氏菌能夠耐受干腌生產(chǎn)過(guò)程中的嚴(yán)苛條件,存活于最終的產(chǎn)品中。這種現(xiàn)象可能緣于沙門氏菌對(duì)食品加工的苛刻條件所產(chǎn)生的耐受機(jī)制,并且干肉制品中食源性病原體的持久存在可能會(huì)促進(jìn)高傳染性食源性病原體向人類傳播,增加食源性疾病的暴發(fā)次數(shù)[27]。因此,對(duì)干發(fā)酵香腸傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)或者施加額外的沙門氏菌減菌處理對(duì)保證干發(fā)酵香腸的最終品質(zhì)十分必要。
除了干發(fā)酵香腸的傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程本身對(duì)沙門氏菌的減少,額外進(jìn)行的對(duì)沙門氏菌的干預(yù)措施主要可分為物理干預(yù)、化學(xué)干預(yù)、生物干預(yù)以及聯(lián)合處理。不同干預(yù)措施的減菌效果及其特點(diǎn)如表4所示。
表4 不同干預(yù)措施對(duì)發(fā)酵香腸中沙門氏菌的減菌效果及特點(diǎn)Table 4 Efficiencies and characteristics of different intervention measures for reducing Salmonella in fermented sausages
由表4可知,物理干預(yù)中電子束輻射效果最好,可以達(dá)到即食食品中沙門氏菌減少7.0(lg(CFU/g))的目標(biāo),高壓處理的減菌效果次之。對(duì)原料肉進(jìn)行冷凍處理并不能有效減少沙門氏菌的數(shù)量。此外,熱乳酸處理原料肉雖能一定程度上減少沙門氏菌,但在Blagojevic等[29]的研究中,熱乳酸處理的溫度較高(90、85、80 ℃),發(fā)酵香腸的感官品質(zhì)下降較明顯。加速干燥過(guò)程是對(duì)傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行改進(jìn),使香腸中的水分快速降低,但其對(duì)沙門氏菌的減菌效果并不理想。巴氏殺菌在美國(guó)已經(jīng)被商業(yè)化地應(yīng)用于即食食品的減菌處理[26],但對(duì)干發(fā)酵香腸進(jìn)行巴氏殺菌的研究較少,其減菌效果能達(dá)到美國(guó)農(nóng)業(yè)部的要求,但長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)使沙門氏菌處于亞致死狀態(tài),誘導(dǎo)其熱應(yīng)激反應(yīng)并且會(huì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成不良影響。此外,紫外線輻射(紫外-可見(jiàn)光和脈沖紫外)的處理效果一般,這可能與其有限的穿透力有關(guān)。巴氏殺菌、紫外-可見(jiàn)光、電子束輻射、高壓處理、脈沖紫外處理主要是對(duì)成熟后的香腸進(jìn)行處理,在包裝之前對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行減菌處理,可以有效降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
據(jù)報(bào)道,植物精油對(duì)干腌肉中沙門氏菌的抑菌效果較好[37],但會(huì)導(dǎo)致食品的風(fēng)味變化,并且使用時(shí)需要考慮消費(fèi)者對(duì)其接受程度。黃芥末在發(fā)酵香腸中的抑菌應(yīng)用較少,Zuo Huizi等[37]的研究表明,添加黃芥末不會(huì)對(duì)發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,但由于其不易熱降解,是食品過(guò)敏源之一,同時(shí)具有濃烈的香氣以及潛在的毒性,所以對(duì)于其在食品加工方面的應(yīng)用應(yīng)該采取謹(jǐn)慎的態(tài)度。
生物減菌方式主要有兩種,包括改善發(fā)酵劑組成以及在原料中添加噬菌體。據(jù)報(bào)道,利用多種乳酸菌復(fù)配發(fā)酵可以有效降低意大利干發(fā)酵香腸中沙門氏菌和單增李斯特菌的數(shù)量[44]。噬菌體在食品中的減菌應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛,包括牛奶、豬肉、牛肉、發(fā)酵香腸[40,45-46]等,但據(jù)Huang Chenxi[39]以及Galarce[40]等的研究結(jié)果顯示,噬菌體對(duì)發(fā)酵香腸中沙門氏菌的減菌效果并不明顯,其減菌效果受樣品儲(chǔ)存溫度以及噬菌體效價(jià)和細(xì)菌計(jì)數(shù)的比值的影響較大。
聯(lián)合減菌措施的組合方式較多且減菌效果較好,例如Patarata等[41]的研究表明,單獨(dú)紅酒處理和紅酒與大蒜混合處理對(duì)沙門氏菌的減菌效果幾乎一樣,但后者的降低速度更快,所以對(duì)于一些生產(chǎn)周期較短的干發(fā)酵香腸來(lái)說(shuō),紅酒和大蒜混合處理的減菌方式具有一定的應(yīng)用前景。總的來(lái)說(shuō),聯(lián)合處理的減菌效果較好,且組合方式多樣,有望開(kāi)發(fā)出減菌效果更好且對(duì)干發(fā)酵香腸特性影響更小的組合方式。
研究沙門氏菌在食品加工過(guò)程中的應(yīng)激機(jī)制,這對(duì)選擇合適的滅菌方法以及開(kāi)發(fā)新型的滅菌方式有重要的指導(dǎo)意義。沙門氏菌在干發(fā)酵香腸生產(chǎn)過(guò)程的主要環(huán)節(jié)所面臨的環(huán)境脅迫因子如圖1所示。沙門氏菌能夠適應(yīng)各種環(huán)境壓力,并得以存活和/或生長(zhǎng)[47]。沙門氏菌經(jīng)某種不利條件的長(zhǎng)時(shí)間脅迫后,對(duì)該不利條件的適應(yīng)性增強(qiáng),稱之為沙門氏菌的同源性保護(hù)作用;經(jīng)某種不利條件的長(zhǎng)時(shí)間脅迫后,對(duì)其他不利環(huán)境條件的適應(yīng)性增強(qiáng),稱為沙門氏菌的交叉性保護(hù)作用。沙門氏菌一般可以通過(guò)這兩種保護(hù)作用適應(yīng)不利的環(huán)境條件[48]。
圖1 沙門氏菌在干發(fā)酵香腸主要生產(chǎn)環(huán)節(jié)所面臨的環(huán)境脅迫因子Fig. 1 Environmental stress factors for Salmonella in the main production stages of dry fermented sausages
低pH值環(huán)境可以引起細(xì)胞膜電位變化,損傷細(xì)胞膜功能以及抑制細(xì)胞內(nèi)某些重要酶的活性,阻斷酶促反應(yīng)和影響營(yíng)養(yǎng)傳遞系統(tǒng)[49]。沙門氏菌的酸應(yīng)激機(jī)制與菌株差異、菌株生長(zhǎng)階段、脅迫時(shí)間、溫度以及酸的種類等相關(guān)[49]。其在低pH值環(huán)境中主要通過(guò)以下3 個(gè)方面維持自身穩(wěn)定:一是維持細(xì)胞內(nèi)的pH值穩(wěn)態(tài);二是合成酸性休克蛋白(acid shock proteins,ASPs)以保護(hù)和修復(fù)自身DNA和蛋白質(zhì);三是改變細(xì)胞膜組成,以抵抗酸性環(huán)境[50-51]。
沙門氏菌主要通過(guò)賴氨酸脫羧酶和精氨酸脫羧酶系統(tǒng)維持細(xì)胞內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài),賴氨酸脫羧酶系統(tǒng)由賴氨酸脫羧酶(CadA)和賴氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CadB)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(CadC)組成;精氨酸脫羧酶系統(tǒng)由精氨酸脫羧酶(AdiA)、精氨酸/胍丁胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AdiC)和轉(zhuǎn)錄激活因子(AdiY)組成。低pH值條件下,CadC可以充當(dāng)信號(hào)傳感器并激活賴氨酸脫羧酶系統(tǒng),CadA消耗H+將細(xì)胞內(nèi)賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺,從而升高細(xì)胞內(nèi)pH值,CadB排出尸胺以換取胞外的賴氨酸,使整個(gè)過(guò)程得以持續(xù)進(jìn)行。而精氨酸脫羧酶系統(tǒng)是由轉(zhuǎn)錄因子AdiY激活,AdiA消耗H+將精氨酸轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)中的胍丁胺,升高細(xì)胞內(nèi)pH值,之后由AdiC排出胍丁胺以換取外部精氨酸[50,52]。同時(shí),酸信號(hào)也可以誘導(dǎo)三羧酸循環(huán)相關(guān)基因prpBC以及ribH(核黃素合酶編碼基因)的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)乙酰輔酶A的消耗,防止細(xì)胞內(nèi)pH值進(jìn)一步下降[53]。
沙門氏菌對(duì)數(shù)期的耐酸機(jī)制主要與ASPs的合成有關(guān),可分為σS依賴的ASPs和非σS依賴的ASPs,由rpoS基因編碼的σS本身就是一種ASPs,但同時(shí)也調(diào)控著對(duì)數(shù)期酸誘導(dǎo)的至少10 種ASPs,包括sodCII和功能未知的OsmY、YciE、YajQ等,同時(shí)σS的積累可能受MviA的間接調(diào)控,而由ClpXP蛋白酶直接降解σS[27,50]。非σS依賴的ASPs主要由Fur、PhoP控制。Fur與細(xì)菌同化或吸收外源鐵的調(diào)節(jié)相關(guān),其直接或間接地正調(diào)控幾種ASPs,賦予菌體對(duì)有機(jī)酸脅迫的保護(hù)作用[49,52];PhoP是PhoQ/PhoP雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的組件,也是一種ASPs,其主要響應(yīng)無(wú)機(jī)酸脅迫[53]。此外,OmpR是OmpR/EnvZ雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的反應(yīng)調(diào)控因子,磷酸化的OmpR是穩(wěn)定期酸耐受的一種ASP,其誘導(dǎo)不需要σS,OmpR可以通過(guò)一種依賴于DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)改變的機(jī)制來(lái)控制沙門氏菌特異性基因的表達(dá)[54]。
酸處理后,沙門氏菌細(xì)胞膜組成的變化主要包括不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)與飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量比值的改變以及大部分UFA轉(zhuǎn)化為其環(huán)狀衍生物環(huán)丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acids,CFA),其形成與cfa基因編碼的環(huán)丙烷脂肪酸合酶有關(guān)[55]。Kim等[56]的研究表明,UFA和CFA是鼠傷寒沙門氏菌酸耐受性所必需的,并且CFA的合成是σS依賴的。沙門氏菌在低pH值環(huán)境中的主要應(yīng)激機(jī)制如圖2所示。
圖2 沙門氏菌主要的酸應(yīng)激機(jī)制[57-59]Fig. 2 Major mechanism for acid stress in Salmonella[57-59]
滲透壓升高會(huì)引起水分子跨內(nèi)膜運(yùn)動(dòng),引起細(xì)胞質(zhì)中水分流失,導(dǎo)致細(xì)胞失水死亡[47]。沙門氏菌可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)K+濃度以及通過(guò)自身合成或胞外轉(zhuǎn)運(yùn)增加胞質(zhì)和周質(zhì)中可溶性物質(zhì)(包括脯氨酸、甜菜堿、四氫嘧啶、海藻糖)的濃度,維持合適的細(xì)胞膨壓[60],如圖3所示。沙門氏菌在高滲條件下涉及的滲透保護(hù)劑轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要有4 種:ProP系統(tǒng)和ProU系統(tǒng),主要轉(zhuǎn)運(yùn)甜菜堿、脯氨酸甜菜堿、脯氨酸;OsmU系統(tǒng),主要轉(zhuǎn)運(yùn)海藻糖;當(dāng)胞外沒(méi)有可利用的可溶性物質(zhì),或者這些物質(zhì)不足以平衡滲透壓力時(shí),沙門氏菌會(huì)自身合成海藻糖以平衡滲透壓,合成海藻糖的酶由otsBA操縱子轉(zhuǎn)錄,但otsBA操縱子由σS調(diào)控;YehZYXW系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)甘氨酸甜菜堿,YehZ是一種假定的與底物結(jié)合的蛋白,可以抑制海藻糖的產(chǎn)生[60-62]。在沙門氏菌進(jìn)入高滲透壓的初始階段,rpoS、proV、proP基因表達(dá)上調(diào),稍后引起kdp表達(dá)上調(diào),最后誘導(dǎo)otsB和ompC表達(dá)上調(diào)。rpoS的上調(diào)可能與高滲透壓導(dǎo)致的生長(zhǎng)速率變慢有關(guān);proU和proP膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有利于將可溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至膜內(nèi);kdpABC操縱子的轉(zhuǎn)錄可以迅速積累細(xì)胞內(nèi)K+濃度;otsBA操縱子由RpoSRNA聚合酶全酶轉(zhuǎn)錄,因此rpoS的表達(dá)上調(diào)會(huì)引起otsB的表達(dá)上調(diào);ompC編碼OmpR/EnvZ雙組分調(diào)控系統(tǒng)的外膜蛋白OmpC,能為可溶性物質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)提供通道[47,63]。Zhang Xia等[64]研究表明,σS能在高滲透壓環(huán)境下影響另一個(gè)替代σ因子σE的表達(dá),σE對(duì)sipC(編碼一種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的正向調(diào)控,表明σE可能通過(guò)sipC影響膜流動(dòng)性[65]。除此之外,高滲條件也會(huì)誘導(dǎo)沙門氏菌中編碼吖啶外排泵的acrA基因的表達(dá),推測(cè)沙門氏菌可能利用AcrAB-TolC外排泵(acrA基因參與編碼)感應(yīng)細(xì)胞外信號(hào),通過(guò)運(yùn)輸鹽和可溶性溶質(zhì)來(lái)適應(yīng)環(huán)境條件[61]。
圖3 沙門氏菌對(duì)高滲透壓環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[57]Fig. 3 Responses of Salmonella to high osmotic pressure environment[57]
干燥環(huán)境下細(xì)胞酶反應(yīng)被抑制,代謝減弱;同時(shí)會(huì)影響DNA的共價(jià)修飾,造成雙鍵斷裂,引起DNA損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[66]。沙門氏菌在干燥條件下的應(yīng)激機(jī)制包括平衡細(xì)胞內(nèi)滲透壓以及利用胞外纖維素和卷曲菌毛抵抗干燥環(huán)境[67]。目前,對(duì)于沙門氏菌在干燥條件下的應(yīng)激機(jī)制尚不完全清楚[68]。可以知道的是,沙門氏菌對(duì)干燥的應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)與其他環(huán)境脅迫的應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)存在明顯重疊。如Mandal等[69]的研究顯示,超過(guò)50%的抗干燥基因與饑餓生存基因(饑餓12 d)是相同的,超過(guò)30%與過(guò)氧化氫(1 mmol/L)脅迫所需的基因相同,這表明沙門氏菌在干燥過(guò)程中可能經(jīng)歷了饑餓和氧化應(yīng)激。而在Gruzdev等[70]的研究中,對(duì)經(jīng)過(guò)干燥處理后的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行乙醇(10%~30%,5 min)、干熱(100 ℃、1 h)、紫外線照射(125 μW/cm2、25 min)處理,發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對(duì)這些應(yīng)激源具有更高的耐受性,說(shuō)明干燥會(huì)誘導(dǎo)沙門氏菌對(duì)多種脅迫產(chǎn)生交叉耐受性。對(duì)干燥后的沙門氏菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),參與干燥的主要基因aceA(編碼異檸檬酸裂合酶)、ddg(編碼脂質(zhì)A生物合成棕櫚油?;??;D(zhuǎn)移酶)、nifU(編碼模塊化Fe-S簇骨架蛋白)、fnr(全局調(diào)節(jié)因子)、rpoE、proP、proU、osmU的表達(dá)上調(diào),此外還觀察到海藻糖和組氨酸合成增加、脂肪酸代謝增強(qiáng)[71-72]。Maserati等[66]的研究還表明,對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行aw=0.11處理后,參與細(xì)菌毒力形成的基因sopD和sseD表達(dá)上調(diào),且sseD和sopD缺失引起細(xì)胞形態(tài)改變,這與mreC(屬于mre操縱子,負(fù)責(zé)細(xì)胞形狀和細(xì)胞骨架的正確形成)缺失引起的細(xì)胞形態(tài)改變類似,猜測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的干燥應(yīng)激機(jī)制可以由sopD/sseD依賴的mre操縱子誘導(dǎo)。
沙門氏菌的熱脅迫主要?dú)w因于對(duì)干發(fā)酵香腸成品進(jìn)行的巴氏殺菌,過(guò)高的溫度會(huì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成不可接受的影響[23],所以一般采用較溫和的溫度(低于53 ℃)對(duì)干發(fā)酵香腸進(jìn)行處理。但由于沙門氏菌在5.5~45.0 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)[73],所以較溫和的熱脅迫下(如42 ℃)僅會(huì)造成其細(xì)胞膜損傷和完整性破壞,導(dǎo)致沙門氏菌處于亞致死狀態(tài),只有延長(zhǎng)脅迫的時(shí)間,細(xì)菌細(xì)胞才會(huì)失活[74]。對(duì)沙門氏菌的熱應(yīng)激機(jī)制還沒(méi)有系統(tǒng)的研究,但有研究表明σ因子在熱應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用,主要有σH(調(diào)控細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熱應(yīng)激)和σE(調(diào)控細(xì)胞膜和胞外的熱應(yīng)激),此外,σS作為全局調(diào)節(jié)因子也參與了對(duì)熱的應(yīng)激[47,75]。高于42 ℃的溫度會(huì)誘導(dǎo)沙門氏菌中rpoH的轉(zhuǎn)錄和翻譯,而σH又可以指導(dǎo)30多種熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)的轉(zhuǎn)錄,這些蛋白質(zhì)具有分子伴侶和蛋白酶的功能,可以介導(dǎo)變性蛋白的重新折疊以及降解錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì);高于45 ℃處理時(shí),蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊會(huì)誘導(dǎo)DegS蛋白酶切割σE-RseA復(fù)合體,導(dǎo)致σE釋放到細(xì)胞質(zhì)中,σE與RNA聚合酶形成聚合物,指導(dǎo)σE依賴的相關(guān)基因的表達(dá),包括rpoH、htrA等[47]。同時(shí)有研究表明,在45 ℃下處理3 min,沙門氏菌編碼Hsp70的dnaK表達(dá)上調(diào),Hsp70可作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的形成;此外,fadA基因的表達(dá)也發(fā)生變化,fadA編碼3-酮脂酰基CoA硫解酶,可以分解長(zhǎng)鏈脂肪酸,生成乙酰輔酶A,用于三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生ATP,并且fadA可能與膜脂肪酸的分解有關(guān)[76]。Sirsat等[77]對(duì)熱適應(yīng)后的沙門氏菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果表明,除了調(diào)控?zé)釕?yīng)激的rpoS、rpoE、rpoH的表達(dá)上調(diào)外,熱脅迫還會(huì)導(dǎo)致編碼主要熱激蛋白和一般抗逆蛋白的基因表達(dá),如ibpA、uspA、uspB、htpG、dnaK和htrA,以修復(fù)受損和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì);DNA代謝中涉及的各種基因,如dnaG、stpA、holC和uvrA會(huì)發(fā)生差異表達(dá),與細(xì)胞過(guò)程有關(guān)的基因如osmC、pipA、pipB和slyA表達(dá)上調(diào),與運(yùn)動(dòng)和附著相關(guān)的鞭毛基因如flgH、flgG、flgB、fliI、fliJ和fliM表達(dá)下調(diào)。沙門氏菌的耐熱性受菌株差異性、加熱條件、食品基質(zhì)條件的影響較大[73],此外,干燥、低pH值條件等也會(huì)增加沙門氏菌的耐熱性,具體的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
在干發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過(guò)程以及成品的運(yùn)輸、銷售和儲(chǔ)存環(huán)節(jié),都可能會(huì)運(yùn)用到4 ℃低溫。低溫條件下,沙門氏菌的核糖體突變會(huì)喪失功能,翻譯受到抑制,導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊不足,影響沙門氏菌生長(zhǎng);此外,溫度降低引起細(xì)胞膜流動(dòng)性降低,細(xì)胞膜功能遭到破壞,導(dǎo)致細(xì)菌死亡[75,78]。沙門氏菌對(duì)冷的應(yīng)激機(jī)制主要有冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)的產(chǎn)生、細(xì)胞膜修飾、DNA修復(fù)[78](圖4)。鼠傷寒沙門氏菌的CSPs主要有6 種,包括CspA~E、CspH,其中CspA、CspB、CspH是冷誘導(dǎo)的,CSPs可以參與生物膜形成,在低溫條件下對(duì)細(xì)菌形成一定的保護(hù)作用[79]。例如,Michaux等[80]的研究發(fā)現(xiàn),鼠傷寒沙門氏菌SL1344生物膜的形成與CspA和CspE相關(guān)。而在Ray等[79]的研究中,CspE是鼠傷寒沙門氏菌14028s生物膜形成所必需的,CspE在介導(dǎo)生物膜形成的同時(shí)也可以增強(qiáng)細(xì)菌的群體運(yùn)動(dòng)能力,這或許可以促進(jìn)細(xì)菌形成聚集體,從而更好地抵抗環(huán)境脅迫。細(xì)胞膜修飾方面,低溫條件下,細(xì)菌細(xì)胞可以調(diào)整細(xì)胞膜UFA/SFA比例、脂肪酸鏈長(zhǎng)度,改變順式與反式脂肪酸比例以及膜蛋白數(shù)量等以恢復(fù)細(xì)胞膜流動(dòng)性[81]。參與DNA修復(fù)和表達(dá)的蛋白質(zhì)主要有RecA(recA編碼的一種CSP,參與DNA的修復(fù)重組,LexA失活時(shí)引發(fā)SOS反應(yīng))、TF(tig基因編碼、糾正蛋白質(zhì)折疊、水解錯(cuò)誤折疊的多肽)、RbfA(rbfA基因編碼的一種CSP,翻譯啟動(dòng)增強(qiáng)因子,促進(jìn)高效翻譯)、PNPase(pnp基因編碼,參與RNA代謝,促進(jìn)細(xì)胞存活和生長(zhǎng))、NusA(nusA基因編碼,DNA轉(zhuǎn)錄早期與RNA聚合酶結(jié)合,影響轉(zhuǎn)錄的暫停/終止),DnaA(轉(zhuǎn)錄全局調(diào)節(jié)因子)[78]。
圖4 沙門氏菌對(duì)低溫環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[78,81]Fig. 4 Response of Salmonella to low temperature[78,81]
400~600 MPa的高壓處理可以延長(zhǎng)肉類產(chǎn)品的貨架期并減少沙門氏菌等病原體[47]。高壓對(duì)微生物的影響主要有:1)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)泄漏,使細(xì)胞膜喪失屏障功能;2)破壞蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu),影響多種細(xì)胞過(guò)程,包括DNA復(fù)制和細(xì)胞代謝等[82]。高壓處理的效果受食品基質(zhì)、工藝參數(shù)、菌株差異的影響,以及受酸、熱、干燥等環(huán)境因素的協(xié)同或拮抗影響[83]。Tamber等[82]對(duì)沙門氏菌中耐壓菌株(600 MPa、3 min)的膜特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)部分菌株對(duì)碘化丙啶攝取水平降低,而CFA水平升高。這表明沙門氏菌可以通過(guò)改變膜脂肪酸組成響應(yīng)高壓應(yīng)激,根據(jù)對(duì)其他應(yīng)激源(熱、饑餓、干燥、酸)的反應(yīng),因此他們提出細(xì)胞膜和σS在沙門氏菌抗壓方面有潛在作用。關(guān)于細(xì)菌對(duì)高壓應(yīng)激機(jī)制的研究主要集中在大腸桿菌方面,由于營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞對(duì)高壓的敏感性存在顯著的種屬差異[84],所以要明確沙門氏菌對(duì)高壓的應(yīng)激機(jī)制,這還需要進(jìn)一步的研究。
紫外線可以使細(xì)菌核酸變性,造成核酸或核蛋白的分解、變性或交聯(lián),引起DNA鏈斷裂,阻礙其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等[85]。Amar等[86]的研究表明,低劑量的UVA可以誘導(dǎo)沙門氏菌中ppGpp(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,抑制RNA和蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其他參與毒力和保護(hù)功能的基因表達(dá))的合成,而ppGpp可以調(diào)控rpoE的表達(dá)。在對(duì)UVA的響應(yīng)中,rpoE和rpoS雙突變株比rpoS單突變株更敏感,表明rpoE可能通過(guò)依賴rpoS和獨(dú)立于rpoS的功能參與對(duì)UVA的防御;rpoS參與紫外線應(yīng)激可能與rpoS調(diào)控著維持包膜完整性或氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[87]。Kramer等[88]的研究表明,oxyR缺失的鼠傷寒沙門氏菌比野生型菌株對(duì)紫外線更為敏感,而oxyR是參與氧化防御機(jī)制的基因,這說(shuō)明沙門氏菌對(duì)紫外線的應(yīng)激引起了氧化應(yīng)激反應(yīng)。但Gayán等[89]的研究表明,在紫外線暴露中存活的鼠傷寒沙門氏菌STCC878的細(xì)胞膜沒(méi)有發(fā)生氧化損傷,暴露初期沙門氏菌可以通過(guò)DNA修復(fù)維持自身存活,并且pH值(7.0~3.0)對(duì)沙門氏菌的紫外線抗性沒(méi)有影響,此外他們認(rèn)為,沙門氏菌的紫外線抗性存在菌株差異。對(duì)沙門氏菌暴露于紫外線下存活機(jī)制的研究還不夠深入,沙門氏菌對(duì)紫外線的抵抗機(jī)制還需要進(jìn)一步明確[75]。
電子束輻射是電離輻射的一種,電離輻射通過(guò)高能帶電的或電離的粒子直接作用于細(xì)菌的DNA、RNA或蛋白質(zhì),引起細(xì)胞死亡或者間接作用于水分子,產(chǎn)生自由基(-OH、-H等),自由基導(dǎo)致DNA斷裂,引發(fā)細(xì)胞死亡[90]。低劑量的γ射線照射會(huì)誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌的SOS反應(yīng),對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)[91]。Bhatia等[92]的研究表明,經(jīng)2 kGy的電子束照射后,鼠傷寒沙門氏菌的β-丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑均受到顯著影響,可能是為了將能量消耗轉(zhuǎn)向DNA修復(fù)和細(xì)胞膜修復(fù)。Calini等[93]的研究表明,經(jīng)3.5 kGy的較高劑量γ射線照射會(huì)誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌中熱休克蛋白Hsp70的過(guò)表達(dá),大大減輕DNA損傷,提高細(xì)胞存活率。此外,Caillet等[94]的研究表明,γ射線會(huì)誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌中熱休克蛋白GroEL、GroES的表達(dá),這些蛋白可以作為分子伴侶參與電離輻射后的DNA修復(fù)[93]。沙門氏菌對(duì)電離輻射的響應(yīng)主要與DNA修復(fù)有關(guān),但其具體的應(yīng)激機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
精油是從植物中分離的揮發(fā)性次生代謝物的混合物[95],多具有抗菌活性,食品中使用的植物精油主要來(lái)自于中草藥及香料,主要是酚類、烯萜類和醛類化合物。精油分子可改變細(xì)胞膜通透性以及與磷脂分子相互作用,改變脂肪酸在細(xì)胞膜中的比例和結(jié)構(gòu),從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)成分泄漏;也可以通過(guò)細(xì)胞膜直接作用于遺傳物質(zhì),破壞DNA結(jié)構(gòu),抑制基因表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞死亡;此外對(duì)細(xì)胞呼吸和能量代謝也會(huì)產(chǎn)生一定影響[96]。Barbosa等[97]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),精油處理后的沙門氏菌中超氧化物歧化酶和GrpE、ClpB、HtpG、Usp表達(dá)量增加,細(xì)胞發(fā)生了活性氧(reactive oxygen species,ROS)樣的應(yīng)激反應(yīng),說(shuō)明對(duì)精油的應(yīng)激中存在氧化應(yīng)激機(jī)制,GrpE、ClpB、HtpG作為HSPs,可以參與多肽天然構(gòu)象的形成以及胞質(zhì)蛋白質(zhì)修飾和修復(fù),Usp蛋白可以與有害物質(zhì)結(jié)合,防止DNA損傷。此外,沙門氏菌還可以通過(guò)快速打開(kāi)和關(guān)閉OmpA和OmpC通道蛋白,調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性,以應(yīng)對(duì)不利條件、有毒物質(zhì)和ROS[98]。關(guān)于精油與沙門氏菌的研究主要還集中在精油的抑菌作用方面,沙門氏菌的應(yīng)激機(jī)制還需要更加深入的研究。
在噬菌體對(duì)沙門氏菌的入侵方面,研究較多的是P22噬菌體,其尾突蛋白可以與沙門氏菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)中的O抗原結(jié)構(gòu)相互作用,導(dǎo)致LPS被破壞,從而使自身DNA注入細(xì)菌細(xì)胞,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[99-100]。沙門氏菌的抗噬菌體機(jī)制主要可以根據(jù)噬菌體的入侵過(guò)程分為3 個(gè)部分:1)阻止噬菌體吸附,主要是通過(guò)改變LPS結(jié)構(gòu),減少LPS含量,阻斷噬菌體受體,產(chǎn)生細(xì)胞外聚合物,以及產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[101];2)靶向裂解噬菌體核酸,主要是通過(guò)Cas1基因編碼的Cas1蛋白,通過(guò)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(clustered regularly interspaced palindromic repeats/clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated proteins system,CRISPR/Cas系統(tǒng))切割噬菌體核酸[101-102];3)噬菌體的流產(chǎn)感染,但這會(huì)引起細(xì)菌死亡[103]。在Wang Changbao等[101]的研究中,噬菌體fmb-p1入侵后,鼠傷寒沙門氏菌的recA基因表達(dá)上調(diào),RecA蛋白可以導(dǎo)致LexA蛋白失活,引起細(xì)胞的SOS反應(yīng),對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù);此外,參與I型限制性修飾系統(tǒng)(restriction modification system,RM)的hsdR、hsdM、hsdS基因和參與III型RM的res和mod基因均發(fā)生表達(dá)上調(diào),I型RM系統(tǒng)可以將細(xì)菌自身DNA甲基化,從而區(qū)分細(xì)菌自己的甲基化DNA和外源進(jìn)入的非甲基化DNA,III型RM系統(tǒng)可以對(duì)DNA進(jìn)行半甲基化以及在特定位點(diǎn)上使DNA裂解。Amar等[86]發(fā)現(xiàn),P22噬菌體在抑制鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)RseA依賴的σE活性,并在rpoE缺失菌株的固體培養(yǎng)物上產(chǎn)生比野生型更多的噬菌斑,而rseA缺失菌株比野生型更能抵抗噬菌體的攻擊,分析可能是由于其σE活性水平較高。目前關(guān)于沙門氏菌對(duì)噬菌體抵抗機(jī)制的研究還不夠全面,要明確其抵抗機(jī)制,還需要更深入全面的研究。
沙門氏菌可以通過(guò)其交叉應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)適應(yīng)多種不利環(huán)境條件,這會(huì)對(duì)食品安全造成很大的威脅。Ye Beining等[104]的研究結(jié)果表明,沙門氏菌在酸適應(yīng)后,其熱應(yīng)激相關(guān)基因rpoH、uspB、htrA,滲透壓應(yīng)激相關(guān)基因proP、proV、osmW以及冷應(yīng)激相關(guān)基因cspA、cspC均上調(diào),說(shuō)明沙門氏菌的酸脅迫誘導(dǎo)了其對(duì)冷、熱、滲透壓的交叉保護(hù)機(jī)制。根據(jù)Gómez-Baltazar等[55]的研究結(jié)果,鼠傷寒沙門氏菌ST19和ST213基因型在4 ℃下應(yīng)激2 h后,其rpoS基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),同時(shí),這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在酸應(yīng)激和高滲透壓應(yīng)激后,這說(shuō)明rpoS參與了多個(gè)環(huán)境壓力的應(yīng)激反應(yīng)。此外,低溫條件下,鼠傷寒沙門氏菌質(zhì)膜脂肪酸的組成會(huì)發(fā)生變化,UFA含量降低,SFA含量增加(主要是CFA),導(dǎo)致UFA/SFA的比值降低,膜流動(dòng)性降低,同時(shí)也有研究表明,這種變化可以使鼠傷寒沙門氏菌對(duì)酸環(huán)境有更高的抵抗力[105]。從以上沙門氏菌對(duì)環(huán)境條件的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)看,σS、脂肪酸組成、SOS反應(yīng)可以響應(yīng)多個(gè)條件,例如,σS可以通過(guò)控制ASPs響應(yīng)酸脅迫;通過(guò)調(diào)控σE以及otsBA操縱子響應(yīng)高滲透壓;并且與高壓、紫外線照射、低溫條件的響應(yīng)有關(guān),但其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚;同時(shí),沙門氏菌通過(guò)改變細(xì)胞膜的脂肪酸組成響應(yīng)酸和低溫條件;此外,由recA誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)可以幫助沙門氏菌在低溫、電離以及噬菌體侵蝕時(shí)進(jìn)行DNA修復(fù)??傊?,沙門氏菌的交叉應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,還需要大量的研究,以探明其交叉應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)。
總的來(lái)說(shuō),沙門氏菌病在食源性疾病中的占比有上升趨勢(shì),而沙門氏菌在干發(fā)酵香腸中的污染情況仍然十分嚴(yán)重,傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程不能有效減少沙門氏菌污染。在干發(fā)酵香腸生產(chǎn)過(guò)程中的沙門氏菌干預(yù)方面,電子束輻射的減菌效果最好,但是由于處理后的肉類顏色易發(fā)生變化以及脂質(zhì)氧化會(huì)引起腐臭味,目前消費(fèi)者對(duì)暴露于這類處理的肉類產(chǎn)品的接受程度不高[75]。此外,精油的減菌效果較好,但其在食品工業(yè)中的應(yīng)用需要考慮其本身的氣味對(duì)產(chǎn)品的影響以及其合理的安全添加量;高壓處理、多菌種發(fā)酵以及聯(lián)合處理對(duì)沙門氏菌的減菌效果良好,且對(duì)食品本身特性的改變較小,能夠較好保持食品的感官特性,因此,高壓、多菌種發(fā)酵以及聯(lián)合減菌可能會(huì)成為今后對(duì)干發(fā)酵香腸中沙門氏菌減菌處理的主要方式。
從對(duì)沙門氏菌的減菌效果以及沙門氏菌的應(yīng)激機(jī)制來(lái)說(shuō),兩者是一種相互影響的關(guān)系。一方面,沙門氏菌會(huì)不斷進(jìn)化以適應(yīng)更嚴(yán)峻的食品加工環(huán)境或新型減菌措施;另一方面,沙門氏菌的交叉應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)也會(huì)使減菌處理的效果大大降低,這要求研究人員不斷開(kāi)發(fā)新型的減菌處理方式。在干發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過(guò)程中,沙門氏菌不可避免地會(huì)經(jīng)受酸、高滲透壓和干燥的刺激,而酸刺激會(huì)誘導(dǎo)沙門氏菌對(duì)后處理(如低溫、熱、高壓處理以及紫外線處理)產(chǎn)生交叉應(yīng)激,這必然會(huì)影響后處理中這些干預(yù)措施的參數(shù)設(shè)置和減菌效果,所以,在干發(fā)酵香腸的原料處理階段以合適的方式對(duì)沙門氏菌進(jìn)行干預(yù)或許是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。此外,通過(guò)研究沙門氏菌的交叉應(yīng)激機(jī)制開(kāi)發(fā)合適的聯(lián)合減菌措施也將成為干發(fā)酵香腸中減少沙門氏菌的一個(gè)必然趨勢(shì)。