丁 洋，趙瑞瑞，孫存一，申 琳，生吉萍

（1.北京物資學(xué)院物流學(xué)院，北京市物流系統(tǒng)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101149；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.中國(guó)人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872）

隨著居民生活水平的提高和網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物的普及，我國(guó)生鮮電商行業(yè)和冷鏈物流市場(chǎng)發(fā)展迅速[1]。雖然冷鏈物流能夠延緩果蔬采后成熟、抑制病原菌生長(zhǎng)、保持果實(shí)貯藏品質(zhì)，但許多熱帶、亞熱帶果蔬對(duì)低溫卻相當(dāng)敏感，若溫度控制不當(dāng)，極易發(fā)生冷害[2]。冷害是指果蔬在其冰點(diǎn)以上的不適低溫環(huán)境中受到的生理傷害，是冷敏型果蔬在逆境脅迫下的一種不良反應(yīng)[3]。冷敏型果蔬在不適低溫下并不會(huì)立即產(chǎn)生冷害癥狀，只有將這些在低溫下貯藏的果蔬產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至較溫暖的環(huán)境（20～25 ℃）之后冷害癥狀才會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)[4]，而此時(shí)的果蔬產(chǎn)品已進(jìn)入終端消費(fèi)者手中，嚴(yán)重地影響采后果蔬的食用品質(zhì)和產(chǎn)品價(jià)值，影響到消費(fèi)者再次購(gòu)買的意愿。我國(guó)是果蔬生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，銷售的果蔬中大約有50%是冷敏型果蔬，目前我國(guó)每年采后經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)上千億元，其中由冷害造成的損失占總損失的1/3以上[4]。因此，采后冷害仍是制約我國(guó)果蔬產(chǎn)業(yè)和生鮮電商平臺(tái)發(fā)展的重大難題。

水楊酸（salicylic acid，SA）作為一種重要的植物內(nèi)源激素，參與植物體內(nèi)多種生理生化過(guò)程和抗性調(diào)控過(guò)程[5-6]。Zhang Xinhua等[7]研究發(fā)現(xiàn)，外源水楊酸甲酯（methyl salicylate，MeSA）處理櫻桃番茄果實(shí)可促進(jìn)內(nèi)源多胺積累，使冷害癥狀減輕。任邦來(lái)等[8]研究發(fā)現(xiàn)，外源SA處理能減少果蔬水分蒸發(fā)，降低果實(shí)質(zhì)量損失率，對(duì)保持果實(shí)硬度和可溶性固形物、VC、可滴定酸含量有較好作用。朱璇等[9]發(fā)現(xiàn)，SA處理可以維持細(xì)胞器和膜系統(tǒng)的完整性，從而提高杏果實(shí)冷藏期間的抗冷性。由此可見(jiàn)，SA在采后果蔬的貯藏保鮮和抗性誘導(dǎo)中均發(fā)揮著重要作用。張春光等[10]將細(xì)菌中編碼水楊酸羥化酶的nahG基因轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥后發(fā)現(xiàn)，病原物侵染后這兩種轉(zhuǎn)基因植物中SA的積累受到了抑制，從而減弱了植株限制病原物擴(kuò)展和產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（system acquired resistance，SAR）的能力。與野生型擬南芥植株相比，NahG突變體更易受臭氧傷害[11]。

番茄作為典型的冷敏型果蔬，是采后果實(shí)冷害研究的重要模式材料[7]。目前內(nèi)源SA在果實(shí)抗冷調(diào)控中的作用機(jī)制及其相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)研究尚未完全清楚，特別是關(guān)于低溫對(duì)SA缺失型番茄果實(shí)抗冷性影響的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用NahG（SA缺失型）番茄果實(shí)和野生型（wild type，WT）番茄果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，于4 ℃下貯藏28 d，分析冷害指數(shù)、游離脯氨酸含量及磷脂酶C（phospholipase C，PLC）、磷脂酶D（phospholipase D，PLD）、脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和纖維素酶活力的變化情況以及木質(zhì)素、纖維素、總酚和兒茶素水平，比較研究冷藏過(guò)程中WT和NahG番茄果實(shí)的抗冷性變化，為掌握水楊酸在果實(shí)抗冷過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可穩(wěn)定遺傳的NahG番茄（體內(nèi)不能積累高水平的SA）和野生型（WT）番茄（Solanum lycopersicumcv.moneymaker）種子來(lái)源于美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的C.M.Rick番茄遺傳資源中心。將上述番茄種子播種于自北京金六環(huán)農(nóng)業(yè)生態(tài)園，于開(kāi)花后對(duì)花期進(jìn)行標(biāo)記，綠熟期挑選大小基本相同、果型飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

常用試劑和藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用有限責(zé)任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器有限責(zé)任公司；GL-20G-II型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；s210 pH酸度計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；ANKOM 2000i全自動(dòng)纖維分析儀 北京安科博瑞科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將采摘后的番茄先運(yùn)至冷庫(kù)（15 ℃）預(yù)冷過(guò)夜后，用體積分?jǐn)?shù)3%次氯酸鈉溶液表面消毒2 min，然后清水洗凈2 次，自然晾干。整個(gè)貯藏期間，果實(shí)均貯藏于冷庫(kù)中（（4±1）℃、相對(duì)濕度85%～90%）。對(duì)照組（WT果實(shí)）和實(shí)驗(yàn)組（NahG果實(shí)）各固定90 個(gè)果實(shí)用于統(tǒng)計(jì)冷害指數(shù)：分別于14、21、28 d從冷庫(kù)中各取30 個(gè)樣品，于室溫下放置2 d，用于測(cè)定冷害指數(shù)。其余果實(shí)分別在0、3、7、14、21、28 d取樣，每次樣品取5 個(gè)，取樣部位為果實(shí)赤道部位1 cm寬的外果皮和果肉，用液氮速凍后放入－80 ℃冰箱中冷凍，待樣品全部取完后，用冷凍研磨機(jī)研磨，用于測(cè)定PLC、PLD、LOX、PG和纖維素酶的活力以及脯氨酸含量、木質(zhì)素和纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總酚和兒茶素含量。

1.3.2 冷害指數(shù)測(cè)定

統(tǒng)計(jì)采用Zhao Danying等[12]的方法，每次從各組中隨機(jī)抽取8 個(gè)果實(shí)統(tǒng)計(jì)冷害級(jí)別：0級(jí)，冷害面積占比為0；1級(jí)，冷害面積占比為0～25%；2級(jí)，冷害面積占比為25%～50%；3級(jí)，冷害面積占比為50%～75%；4級(jí)，冷害面積占比為75%～100%。統(tǒng)計(jì)各冷害級(jí)別果實(shí)個(gè)數(shù)后，按式（1）計(jì)算冷害指數(shù)。

1.3.3 游離脯氨酸含量測(cè)定

游離脯氨酸含量測(cè)定參考曹建康等[13]的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 LOX活力測(cè)定

LOX活力測(cè)定參考Minguez-Mosquera等[14]的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 PLC、PLD活力測(cè)定

PLC、PLD活力測(cè)定分別參考Mao Linchun[15]和Kurioka[16]等的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 纖維素酶活力測(cè)定

纖維素酶活力測(cè)定參考曹建康等[13]的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 PG活力測(cè)定

PG活力測(cè)定參考Gayathri等[17]的方法，并略有改動(dòng)。稱取5 g 樣品，加入10 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液研磨，離心后棄上清液，沉淀中加入5 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液，離心后去上清液，沉淀中加入5 mL預(yù)冷的提取緩沖液，離心后收集上清液，為酶提取液。加入1.0 mL 50 mmol/L pH 5.5醋酸鈉緩沖液和0.5 mL 10 g/L多聚半乳糖醛酸，加入0.5 mL酶提取液，以加入0.5 mL 經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對(duì)照，37 ℃保溫1 h后加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min，以蒸餾水稀釋至25 mL，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處吸光度。以每克鮮樣品每小時(shí)分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸定義為1 個(gè)酶活力單位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.8 木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參考范鵬程等[18]的方法，略有改動(dòng)。取0.1 g樣品加入10 mL體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液，離心后棄上清液，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液洗滌沉淀。再加入4 mL乙醇和乙醚混合液（體積比1∶1）浸泡沉淀3 min，棄上清液，重復(fù)3 次，沸水中蒸干沉淀，加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)72%硫酸溶液，靜置16 h以溶解全部纖維素，加入10 mL蒸餾水，沸水加熱5 min，冷卻后加入5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氯化鋇溶液，搖勻離心后棄上清液。沉淀中加入10 mL體積分?jǐn)?shù)10%硫酸溶液和10 mL 0.025 mol/L重鉻酸鉀溶液，沸水加熱15 min。冷卻后轉(zhuǎn)入燒杯，用20 mL蒸餾水洗滌殘余部分后也轉(zhuǎn)入燒杯。在燒杯中先加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%碘化鉀溶液和1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%淀粉溶液，再用0.2 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定，記錄顏色變化時(shí)所用的硫代硫酸鈉用量以計(jì)算木質(zhì)素含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.9 纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用全自動(dòng)纖維分析系統(tǒng)。稱取樣品1 g（m/g）放置在坩堝中熱浸提5 min，結(jié)束后關(guān)掉加熱開(kāi)關(guān)，用樣品夾轉(zhuǎn)移到冷浸提裝置。將坩堝在（105±2）℃下處理5 h，冷卻坩堝到室溫（最好放在干燥器中）稱質(zhì)量（m1/g，精確到0.1 mg），灰化樣品在（525±10）℃條件下處理3 h；冷卻坩堝到室溫，稱質(zhì)量（m2/g，精確到0.1 mg）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按式（2）計(jì)算纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.10 總酚和兒茶素含量測(cè)定

總酚含量測(cè)定參考Pirie等[19]的方法。兒茶素含量測(cè)定參考胡鳳等[20]的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 10.0軟件制圖。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，具體采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為兩對(duì)比組之間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NahG和WT番茄果實(shí)的冷害情況分析

如圖1A所示，NahG果實(shí)和WT果實(shí)在4 ℃下貯藏14 d并轉(zhuǎn)移至室溫下放置2 d后均出現(xiàn)冷害癥狀。之后，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，兩組果實(shí)冷害指數(shù)均呈上升趨勢(shì)。到貯藏28 d時(shí)，NahG果實(shí)冷害指數(shù)顯著低于WT果實(shí)，比WT果實(shí)降低了23.53%（P＜0.05）。如圖1B所示，冷藏28 d后，NahG果實(shí)和WT果實(shí)移至室溫放置2 d，NahG果實(shí)的冷害癥狀比WT果實(shí)明顯減輕。

圖1 冷藏過(guò)程中NahG和WT番茄果實(shí)冷害指數(shù)及冷害癥狀的變化Fig. 1 Changes in chilling injury index and symptoms in NahG and WT tomato fruits during cold storage

2.2 NahG和WT番茄果實(shí)的游離脯氨酸含量比較

受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，植物組織中游離脯氨酸含量會(huì)明顯升高，這可以增強(qiáng)細(xì)胞的滲透性、穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝、降低冰點(diǎn)，對(duì)提高低溫脅迫下果蔬組織的抗逆性、避免細(xì)胞遭到氧化脅迫的傷害等方面有十分重要的作用[21]。如圖2所示，在貯藏期間WT與NahG果實(shí)中游離脯氨酸含量不斷增加，NahG果實(shí)中游離脯氨酸含量顯著高于WT果實(shí)（P＜0.05）。貯藏14 d后，NahG果實(shí)游離脯氨酸含量快速升高，到28 d達(dá)到最大值（22.15 μg/g），而WT果實(shí)僅為8.06 μg/g。這說(shuō)明NahG果實(shí)抗冷能力比WT果實(shí)更強(qiáng)。

圖2 冷藏過(guò)程中NahG和WT番茄果實(shí)游離脯氨酸含量的變化Fig. 2 Changes in proline content in NahG and WT tomato fruits during cold storage

2.3 NahG和WT番茄果實(shí)的細(xì)胞膜相關(guān)酶活力比較

脂類是生物膜的重要組成成分，其不飽和程度與生物膜的穩(wěn)定性及流動(dòng)性密切相關(guān)，不飽和脂肪酸的水平是影響膜流動(dòng)性的主要因素[22]。PLC和PLD為磷酸二脂酶，能夠水解磷酸二脂鍵，催化多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性有非常重要的作用，是造成膜損傷和發(fā)生冷害的主要物質(zhì)[23]。由圖3A可以看出，WT果實(shí)中PLC活力在整個(gè)貯藏期間都顯著高于NahG果實(shí)（P＜0.05）。在貯藏期間WT果實(shí)中PLC活力呈先下降后增加的變化趨勢(shì)，而NahG果實(shí)PLC活力是先下降后上升再下降，到貯藏第7天達(dá)到最大值（127 U/kg），此時(shí)WT果實(shí)PLC活力仍顯著高于NahG果實(shí)。由圖3B看出，NahG與WT果實(shí)PLD活力變化趨勢(shì)一致，均在第7天時(shí)達(dá)到最小值，除第7天外，其余時(shí)間WT果實(shí)PLD活力均顯著高于NahG果實(shí)（P＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，在低溫脅迫下，NahG果實(shí)PLC和PLD活力的增加受到明顯抑制。

LOX是酶促脂質(zhì)過(guò)氧化的重要因子，能催化游離的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化自由基，這些自由基能直接作用于膜磷脂中的結(jié)合態(tài)不飽和脂肪酸，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂雙分子層破壞，與后熟衰老過(guò)程的啟動(dòng)和逆境脅迫、傷誘導(dǎo)、病原信號(hào)的產(chǎn)生和識(shí)別等關(guān)系密切[23]。如圖3C所示，在貯藏過(guò)程中，NahG和WT果實(shí)LOX活力呈先上升后降低趨勢(shì)。貯藏14 d時(shí)，NahG果實(shí)LOX活力顯著低于WT果實(shí)（P＜0.05）。貯藏第3天，NahG果實(shí)LOX活力達(dá)到最大值（4.24 U/（g·min）），WT果實(shí)在第14天時(shí)LOX活力達(dá)到最大值（7.59 U/（g·min）），比同期NahG果實(shí)高86.95%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NahG果實(shí)冷害癥狀的發(fā)展被延緩，同時(shí)PLC、PLD和LOX的活力受到抑制，保持了細(xì)胞膜的相對(duì)穩(wěn)定。

圖3 冷藏過(guò)程中NahG 和WT番茄果實(shí)PLC（A）、PLD（B）和LOX（C）活力的變化Fig. 3 Changes in activities of PLC (A), PLD (B) and LOX (C) in NahG and WT tomato fruits during cold storage

2.4 NahG和WT番茄果實(shí)的細(xì)胞壁相關(guān)酶活力比較

在低溫脅迫下，采后果實(shí)中的PG、纖維素酶、半乳糖苷酶等一系列水解酶會(huì)將細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、原果膠、木質(zhì)素等物質(zhì)分解，使細(xì)胞壁解體，果蔬組織變軟，導(dǎo)致細(xì)胞壁代謝異常，發(fā)生冷害[24]。如圖4A所示，在貯藏期間除了0、14 d和28 d外，NahG果實(shí)PG活力顯著低于WT果實(shí)（P＜0.05）。WT果實(shí)的PG活力在貯藏第7天迅速增加到13.53 mg/（kg·h），而NahG果實(shí)此時(shí)僅為3.18 mg/（kg·h）。到貯藏第14天，NahG果實(shí)PG活力達(dá)到最大。如圖4B所示，WT果實(shí)中纖維素酶活力在貯藏14 d時(shí)達(dá)到最大值（6.32 mg/（kg·h）），此時(shí)可能番茄果實(shí)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生改變，而NahG果實(shí)中纖維素酶活力在28 d時(shí)才達(dá)到最大（4.42 mg/（kg·h）），在整個(gè)貯藏期，除第28天外，WT果實(shí)中纖維素酶活力顯著高于NahG果實(shí)（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與WT果實(shí)相比，NahG果實(shí)中不但PG的活力顯著降低，且PG和纖維素酶活力峰值出現(xiàn)時(shí)間也被推遲。

2.5 NahG和WT番茄果實(shí)的木質(zhì)素和纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，與纖維素協(xié)同作用可增強(qiáng)果實(shí)的表皮結(jié)構(gòu)，提高植物抗病性[25]。如圖5A所示，在貯藏第3天和第21天，NahG果實(shí)中的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于WT果實(shí)（P＜0.05）。WT果實(shí)中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在貯藏14 d之前變化幅度不大，到21 d時(shí)降低到2.80%；而NahG果實(shí)木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在貯藏第3天就增加到最大（4.18%），后期貯藏過(guò)程中變化幅度不大。與WT果實(shí)相比，NahG果實(shí)的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高，可推遲果實(shí)軟化。

植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變與纖維素、半纖維素的結(jié)構(gòu)變化和果膠物質(zhì)的降解有關(guān)。纖維素可以支持和保護(hù)細(xì)胞骨架，防止植物組織變軟[26]。由圖5B可以看出，在整個(gè)貯藏期間，NahG果實(shí)與WT果實(shí)纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)相似，均在貯藏第14天時(shí)達(dá)到最大值，此后均呈降低趨勢(shì)，結(jié)合冷害指數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：貯藏14 d以后番茄果實(shí)出現(xiàn)冷害癥狀，隨時(shí)間推移，冷害發(fā)展嚴(yán)重，品質(zhì)下降。與WT果實(shí)相比，NahG果實(shí)能有效提高細(xì)胞壁的穩(wěn)定性。

圖5 冷藏過(guò)程中NahG和WT番茄果實(shí)木質(zhì)素（A）和纖維素（B）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig. 5 Changes in contents of lignin (A) and cellulose (B) in NahG and WT tomato fruits during cold storage

2.6 NahG和WT番茄果實(shí)的總酚和兒茶素含量比較

酚類化合物是植物重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一。果蔬色澤、品質(zhì)和味道的形成、成熟與衰老進(jìn)程、組織色變、抗逆性抗病性代謝等都與酚類有很大的關(guān)系[27]。由圖6A可以看出，在貯藏初期，兩組番茄果實(shí)中的總酚含量相差不大。第7天時(shí)，NahG果實(shí)中總酚含量迅速增加，從貯藏第7天開(kāi)始，NahG果實(shí)中的總酚含量顯著高于WT果實(shí)（P＜0.05）。在貯藏0～21 d，兩組番茄果實(shí)中總酚含量在貯藏期間不斷增加，而21～28 d總酚含量下降，可能到第28天時(shí)兩組番茄果實(shí)都發(fā)生嚴(yán)重冷害，導(dǎo)致果實(shí)中總酚物質(zhì)含量減少，但NahG果實(shí)中總酚含量仍高于WT果實(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NahG果實(shí)在低溫脅迫下能夠保持酚類物質(zhì)含量處于較高水平，抑制酚類物質(zhì)進(jìn)一步氧化，從而減輕番茄組織褐變等冷害癥狀。

兒茶素可以清除自由基，具有強(qiáng)抗氧化作用，并能夠調(diào)控植物的抗性[28]。如圖6B所示，在貯藏期間，NahG果實(shí)中的兒茶素含量顯著高于WT果實(shí)（P＜0.05）。在21 d前，兩組兒茶素的含量不斷增加，到21 d時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)NahG果實(shí)兒茶素含量為8.29 μg/g，比WT果實(shí)高27.93%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，NahG番茄果實(shí)內(nèi)的抗氧化物質(zhì)總酚和兒茶素的含量均高于WT果實(shí)，表明NahG果實(shí)抗冷和清除自由基的能力增強(qiáng)。

圖6 冷藏過(guò)程中NahG和WT番茄果實(shí)總酚（A）和兒茶素（B）含量的變化Fig. 6 Changes in contents of total phenolic compounds (A) and catechin (B) in NahG and WT tomato fruits during cold storage

3 討 論

SA是植物中非常重要的內(nèi)源激素類物質(zhì)和信號(hào)分子，不僅參與植物的抗病過(guò)程，還參與植物的抗冷反應(yīng)。在番茄果實(shí)中施用低濃度的MeSA可以減輕低溫貯藏過(guò)程中的冷害和腐爛發(fā)生率[29]。NahG番茄是從細(xì)菌中轉(zhuǎn)入了一個(gè)編碼SA羥化酶的NahG基因[30]。該酶能分解植物體內(nèi)產(chǎn)生的SA，產(chǎn)生兒茶素，使體內(nèi)不能積累高水平的SA。本實(shí)驗(yàn)中的NahG突變體番茄果實(shí)中兒茶素的含量顯著高于野生型（P＜0.05），其抗冷能力也顯著提高。這與擬南芥NahG突變體植株抗冷能力高于野生型植株[31]的結(jié)果一致。在低溫脅迫下，SA積累過(guò)高促進(jìn)了擬南芥的膜脂過(guò)氧化，而不能積累高水平SA的NahG突變體生長(zhǎng)狀況卻明顯好于野生型，表明SA高濃度積累不利于擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受[32]。在果實(shí)采后貯藏中的研究表明，外源SA誘導(dǎo)的抗冷性存在濃度依賴效應(yīng)。陳國(guó)品等[33]分別用0.04、0.36、0.72、1.08、1.44 mmol/L的SA溶液噴灑巨峰葡萄葉片，在自然低溫條件下（＜10 ℃），1.08 mmol/L的SA對(duì)冬葡萄果實(shí)的抗冷性有更好的促進(jìn)作用。蔡琰[34]采用1.0 mmol/L SA處理水蜜桃，比0.7 mmol/L和1.3 mmol/L SA處理在0 ℃下貯藏能更好地抑制后熟軟化和果肉褐變，顯著抑制冷害的發(fā)生。盡管外源SA處理能夠有效提高采后果實(shí)的抗冷性[7,9,33-34]，但關(guān)于內(nèi)源SA的水平對(duì)采后果實(shí)抗冷性影響的研究甚少且機(jī)制尚未明確。

低溫通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)丙二醛和活性氧含量對(duì)植物造成嚴(yán)重?fù)p傷[35]。低溫最先損傷的是細(xì)胞膜，而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)于低溫下植物維持細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)必不可少。脂質(zhì)成分的改變與否決定了低溫下細(xì)胞膜是否受損。在許多植物中，細(xì)胞膜中脂肪酸不飽和度和不飽和磷脂酰膽堿比例的增加對(duì)提高植物抗冷能力起至關(guān)重要的作用[36]。磷脂是生物膜的骨架成分，PLC和PLD參與磷脂分子的水解反應(yīng)[37]，在持續(xù)低溫條件下，植物中PLD會(huì)大量水解磷脂，引起細(xì)胞膜不可逆的損傷[38]。LOX具有膜脂過(guò)氧化的作用，其活性的升高會(huì)引起質(zhì)膜的降解和過(guò)氧化物的積累[39]。PG和纖維素酶分別調(diào)節(jié)果膠和纖維素的降解，是引起細(xì)胞壁降解并最終導(dǎo)致果實(shí)軟化的主要參與酶類[40]。在本實(shí)驗(yàn)中，NahG突變體番茄果實(shí)的PLC、PLD、PG和纖維素酶活性低于WT果實(shí)，木質(zhì)素和纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于WT果實(shí)，進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)入NahG基因有效抑制了細(xì)胞內(nèi)磷脂、果膠和纖維素的降解，保護(hù)了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，防止了果實(shí)的軟化，進(jìn)而提高了果實(shí)自身的抗冷能力。nahG編碼的SA羥化酶能夠水解SA，形成具有抗氧化能力的兒茶素。NahG突變體果實(shí)中總酚和兒茶素含量的增加使得細(xì)胞內(nèi)抗氧物的提高，從而抑制細(xì)胞成分的氧化，對(duì)提高果實(shí)的抗冷性起到促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將NahG突變體和野生型番茄果實(shí)進(jìn)行4 ℃下28 d的低溫貯藏，對(duì)貯藏期間果實(shí)的冷害癥狀、冷害指數(shù)，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁相關(guān)酶活力，以及游離脯氨酸、總酚、兒茶素含量及木質(zhì)素、纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明，NahG番茄果實(shí)具有更強(qiáng)的抗冷性，其原因可能是SA水解影響低溫下果實(shí)中抗氧化物質(zhì)總酚和兒茶素的水平以及細(xì)胞膜和細(xì)胞壁降解酶系統(tǒng)活性，促使番茄果實(shí)的抗冷能力增強(qiáng)。