肖 杰，侯 粲，陳 鑫，應 劍,*，朱 炫，王黎明，牛興和，唐培安，李 頌，郝彬秀，常國生

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；3.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；4.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；5.中茶科技（北京）有限公司，北京 102209；6.廣州市藝洋實業(yè)有限公司，廣東 廣州 510360）

糖脂代謝異常主要表現(xiàn)為腹部肥胖、胰島素抵抗、高血壓、高脂血癥等[1]，其患病率已從2002年的9.5%達到了2012年的18.7%[2]。以糖尿病為例，2015—2017年一項針對我國31 個省級行政區(qū)、75 880 名調(diào)查者的研究中發(fā)現(xiàn)，我國成人居民的糖尿病標準化總患病率約為12.8%，糖尿病前期標準化患病率約為35.2%[3]。探討糖脂代謝異常人群患病進程及干預措施，對改善當前的患病現(xiàn)狀，提高患者的生存質(zhì)量具有重要意義。

改善糖脂代謝異常的傳統(tǒng)方式是利用他汀類化合物、二甲雙胍、α-葡萄糖苷酶抑制劑等進行藥物治療。但是，由于糖脂代謝調(diào)控機制復雜，藥物治療作用靶點單一且存在不良反應風險，因此，有必要尋找安全、有效的替代方式[4]。利用健康食品調(diào)整現(xiàn)有飲食結構是改善糖脂代謝異常的重要手段之一[5]。茶富含多酚類物質(zhì)，具有改善糖尿病、肥胖、心血管疾病等糖脂代謝異常的潛力[6]。在糖脂代謝領域，近年來，對于以微生物發(fā)酵為標志性工藝的后發(fā)酵茶的研究逐漸深入。其中，冠突散囊菌發(fā)酵的茯磚茶可以調(diào)節(jié)腸道菌群減輕高脂誘導的C57BL/6J小鼠肥胖[7]。隨著研究的日趨深入，冠突散囊菌發(fā)酵的技術亦被應用于紅茶、烏龍茶等各品類[8-9]。烏龍茶經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后，可有效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性，同時，0.4～1.6 g/kgmb茶湯干預可以有效改善高糖高脂飼料誘導的大鼠體質(zhì)量增加，改善血脂水平，增加雙歧桿菌等益生菌的相對豐度[10]。

陳皮是蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，作為食藥兩用的中藥材廣為應用。中醫(yī)典籍中記載，陳皮氣香、味辛、微苦，歸肺經(jīng)、脾經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[11]。陳皮含有川陳皮素、橙皮苷等活性成分，具有廣泛的藥理作用，廣泛作用于心血管、消化和呼吸系統(tǒng)等，具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎特性，可以對肝臟和神經(jīng)有保護作用[12-13]。有研究顯示，灌胃0.25%和0.5%陳皮提取物超過15 周，由于其富含獨特的5-羥基聚甲氧基黃酮可顯著預防高脂飲食誘導的肥胖、肝脂肪變性和糖尿病癥狀[14]。

發(fā)酵陳皮黑茶是以黑毛茶和廣東新會陳皮為原料，借鑒傳統(tǒng)茯磚茶的工藝，將陳皮和黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌（Eurotium cristatum）發(fā)酵后干燥制成的新工藝茶。前期研究顯示，與發(fā)酵前原料相比，發(fā)酵陳皮黑茶成品總多糖含量由原料中的0.96%上升至發(fā)酵后的2.15%～3.56%，茶多酚含量從14.96%下降至8.99%～12.44%。發(fā)酵陳皮黑茶在體外實驗中表現(xiàn)為改善脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的活性[15]。

盡管茯磚茶與陳皮都有抗氧化、抗炎、改善糖脂代謝等的作用，但是由于發(fā)酵陳皮黑茶采用了陳皮與黑毛茶共同發(fā)酵，不同于其他簡單拼配的茶產(chǎn)品，因此量效關系及機制研究尚不明確，亟需進行新的研究明確其改善糖脂代謝異常的作用機制。本研究以發(fā)酵陳皮黑茶為研究目標，用高脂誘導C57bl/6J小鼠糖脂代謝異常模型，測定小鼠體質(zhì)量增加率、攝食量、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平、口服糖耐量測試（oral glucose tolerance test，OGTT）、血脂水平、病理特征及腸道菌群結構等指標，旨在考察評價發(fā)酵陳皮黑茶改善糖脂代謝異常的潛力，探索其改善作用的主要機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡雄性C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。

發(fā)酵陳皮黑茶 貴州梵錦茶業(yè)有限公司；大鼠維持飼料（14.23 kJ/g） 北京科澳協(xié)力飼料有限公司；高脂飼料D12492（21.93 kJ/g） 北京華阜康生物有限公司。

FBG、胰島素、膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

脫水機、包埋機 武漢俊杰電子有限公司；病理切片機 德國徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡日本尼康公司；全自動生化儀 德國羅氏公司；酶標分析儀 美國Biotek公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵陳皮黑茶浸提液制備

發(fā)酵陳皮黑茶生產(chǎn)工藝：黑毛茶與10%廣東新會陳皮拼配后經(jīng)蒸汽渥堆，在25～30 ℃，相對濕度大于70%條件下自然發(fā)花15 d，后經(jīng)干燥過程，制成成品。發(fā)酵陳皮黑茶主要成分：茶多糖2.70%（質(zhì)量分數(shù)，下同）；總黃酮2.82%；總多酚11.63%[15]。

發(fā)酵陳皮黑茶浸提液的制備：準確稱取3 g茶葉粉碎，按料液比3∶10（m/V）加入10 mL加熱至沸騰的蒸餾水置于離心管內(nèi)，沸水浴加熱45 min（每10 min振搖一次），浸提結束后使用中速定性濾紙常溫常壓過濾，最終定容至10 mL。浸提液每周配制一次，于4 ℃保存，此浸提液為高劑量干預組茶葉浸提液，分別稀釋2、4 倍后為中、低劑量干預組茶浸提液。

1.3.2 分組及飼養(yǎng)

6 周齡雄性C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，室溫（22±2）℃，相對濕度40%～70%，12 h人工照明/黑暗循環(huán)，換氣次數(shù)15 次/h。小鼠自由攝食并飲水，基礎飼料（即大小鼠維持飼料）適應性飼喂一周后進行實驗。

雄性C57BL/6J小鼠隨機分為6 組，每組10 只，分別為正常對照組（基礎飼料＋10 mL/kgmb蒸餾水，NC組）、模型組（高脂飼料＋10 mL/kgmb蒸餾水，MC組）、低劑量干預組（高脂飼料＋10 mL/kgmb稀釋4 倍的茶葉浸提液，LI組）、中劑量干預組（高脂飼料＋10 mL/kgmb稀釋2 倍的茶葉浸提液，MI組）、高劑量干預組（高脂飼料＋10 mL/kgmb茶葉茶浸提液，HI組）、陽性對照組（高脂飼料＋200 mg/kgmb二甲雙胍，PC組）（灌胃體積均為10 mL/kgmb，低、中、高劑量干預組對應的發(fā)酵陳皮黑茶干預劑量分別為0.75、1.50、3.00 g/kgmb）。各組小鼠每日灌胃給藥1 次，預防性干預12 周，觀察記錄各組小鼠每周體質(zhì)量、攝食量，實驗期間，小鼠自由飲水采食。按式（1）計算干預結束期較造模初期不同組別動物的體質(zhì)量增加率。

1.3.3 口服糖耐量測試

干預第10周第1天，各組小鼠禁食10 h，給藥前測定各組小鼠FBG水平，測試后分別給予0.75、1.50、3.00 g/kgmb受試樣品、二甲雙胍200 mg/kgmb以及蒸餾水，灌胃體積均為10 mL/kgmb，20 min后經(jīng)口給予0.2 g/mL葡萄糖溶液（10 mL/kgmb），尾靜脈取血使用血糖儀試紙測定經(jīng)口給予葡萄糖后0、0.5、1.0、2.0 h時的血糖水平，繪制糖耐量曲線，按式（2）計算血糖曲線下面積。

1.3.4 標本采集及處理

干預期結束后，各組小鼠禁食12 h后處死；禁食期間，保持正常飲水。實驗當天，眼球采血并分離血清，于－80 ℃保存待測。小鼠采血后頸椎脫臼處死，取完整心臟、肝、腎、胸腺等，生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干測定質(zhì)量，并使用福爾馬林液常溫保存，計算臟器系數(shù)（小鼠臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值）。

在標本采集前2 d使用懸尾法取小鼠糞便，置于無菌凍存管中－80 ℃保存。待后續(xù)腸道菌群分析。

1.3.5 生化指標測定

實驗動物眼球采血后分別按照試劑盒說明書測定血清FBG、ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平；肝組織勻漿后離心，取上清液參照試劑盒說明書進行肝臟TC、TG、FFA水平的測定。

1.3.6 臟器組織切片觀察

肝組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色、脫水透明、封片后于顯微鏡下觀察，每個組織隨機選擇5 個視野進行拍照[16]。

肝組織制備冰凍切片，復溫后，經(jīng)油紅O染色、分化、復染細胞核、封片后于顯微鏡下觀察，每個組織隨機選擇5 個視野進行拍照[16]。

1.3.7 腸道菌群檢測

使用細菌DNA提取試劑盒提取小鼠腸道內(nèi)容物中的細菌基因組，經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計測定后選擇DNA質(zhì)量濃度為20 ng/μL的樣本進行下一步聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增?；蚪M通過PCR進行擴增得到細菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)。擴增子經(jīng)質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠回收提取，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒按照制造商的說明進行純化，并使用QuantiFluor?-ST進行定量。純化后的擴增子匯集在等分子質(zhì)量的測序池中，使用Illumina MiSeq進行配對測序（2×PE300）。原始fastq文件使用QIIME（1.17版）進行質(zhì)量過濾。具有97%相似性的序列通過UPARSE 7.1軟件（http://drive5.com/uparse/）聚類為一個操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并使用UCHIME識別和去除嵌合體序列。基于得到的ASV（feature）特征序列和ASV（feature）相對豐度表格進行α多樣性（Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)）分析和β多樣性分析（使用主成分分析（principal component analysis，PCA）表征）。利用RDP分類器（http://rdp.cme.msu.edu/）對置信閾值為70%的Silva（SSU115）16S rRNA數(shù)據(jù)庫中每個16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育親緣關系進行分析及注釋。使用PICRUSt（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）軟件對OTU進行標準化后，預測其功能，通過與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫的KEGG Mapper軟件（https://www.genome.jp/）比對獲得代謝通路以及酶的注釋，篩選差異代謝酶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差表示，使用Graph Pad Prism 7.0軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，通過最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠體質(zhì)量、攝食量、臟器系數(shù)的影響

如圖1所示，與正常對照組相比，在第12周，模型組小鼠體質(zhì)量增加率極顯著增加（P＜0.01）。經(jīng)0.75～3.00 g/kgmb發(fā)酵陳皮黑茶干預后，由高脂飼料誘導的小鼠體質(zhì)量增加有所改善，體質(zhì)量增加率具有一定的下降趨勢，體質(zhì)量增長率由模型組（35.89±5.59）%下降至低劑量干預組的（29.57±6.89）%，中劑量干預組的（28.67±5.01）%，高劑量干預組的（30.67±6.07）%，但沒有顯著差異。對小鼠攝食量進行分析，高脂飲食會增加小鼠的能量攝入，而和模型組相比，各組小鼠攝食量沒有明顯差異，說明陳皮黑茶對小鼠攝食沒有影響。

圖1 發(fā)酵陳皮黑茶對干預終點小鼠體質(zhì)量變化率、攝食量的影響Fig. 1 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on body mass and feed intake in mice

如表1所示，干預12 周后對小鼠的肝、腎、心臟、脾以及胸腺等主要臟器稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)。與正常對照組相比，模型組肝臟指數(shù)高度顯著降低（P＜0.001），其余主要臟器沒有明顯差異。與模型組相比，0.75～3.00 g/kgmb發(fā)酵陳皮黑茶干預后，主要臟器的臟器指數(shù)沒有明顯差異，提示發(fā)酵陳皮黑茶具有較好的安全性。

表1 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on visceral organ coefficients of mice

2.2 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠糖代謝的影響

FGB及糖耐量是反應糖代謝的重要指標。OGTT結果如圖2A、B所示，與NC組相比，MC組小鼠高脂飲食導致糖耐量異常，曲線下面積增加了49.78%，差異高度顯著（P＜0.001），二甲雙胍陽性藥物可以高度顯著降低曲線下面積（P＜0.001），緩解由于高脂飲食帶來的小鼠糖耐量異常。而HI組和MC組相比，曲線下面積由1 694.0±137.2下降至1 491.0±112.9，且差異高度顯著（P＜0.001），改善小鼠的糖耐量異常，緩解葡萄糖穩(wěn)態(tài)失調(diào)的現(xiàn)象。

干預第12 周，各組小鼠禁食8 h后，測定各組小鼠FGB濃度（圖2C）。和NC組相比，和NC組相比，MC組高脂飲食可以誘導小鼠FGB濃度升高，F(xiàn)GB濃度由（5.76±0.57）mmol/L上升至（7.43±0.77）mmol/L，且差異高度顯著（P＜0.001）。實驗結果顯示，和MC組相比，LI、MI及HI組可以有效降低高脂飲食誘導的小鼠的FGB水平上升。進一步對小鼠的空腹胰島素水平進行測定，發(fā)現(xiàn)各組小鼠空腹胰島素水平?jīng)]有顯著差異（圖2D）。

圖2 發(fā)酵陳皮黑茶干預對小鼠糖代謝的影響Fig. 2 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on glucose tolerance of mice

2.3 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠脂代謝的影響

血脂水平是評價機體脂代謝情況的重要指標。如圖3所示，與NC組小鼠相比，MC組小鼠的TC、TG、LDL-C的水平顯著增高。和MC組相比，LI組和MI組的TC、LDL-C和HDL-C水平變化不大，高劑量發(fā)酵陳皮黑茶干預組對TC、LDL-C和HDL-C具有一定的降低作用，但是差異沒有顯著性。LDL-C濃度/HDL-C濃度異常升高是心血管疾病重要的危險因素之一，與NC組小鼠相比，MC組小鼠飼喂高脂飲食后，會在一定程度上升高LDL-C濃度HDL-C濃度，而發(fā)酵陳皮黑茶各干預組均不同程度上能夠緩解高脂飲食帶來的LDL-C濃度/HDL-C濃度升高，但差異沒有顯著性。與NC組小鼠相比，MC組小鼠的TG水平極顯著增加（P＜0.01），發(fā)酵陳皮黑茶各干預組對TG具有一定的降低作用，但是差異沒有顯著性。

圖3 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠血脂水平的作用Fig. 3 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on blood lipid levels of mice

圖4 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠肝組織結構及肝內(nèi)脂質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on hepatic histological changes and hepatic lipid levels of mice

如圖4A所示，小鼠肝組織切片HE染色結果顯示，正常對照組小鼠肝組織結構均勻；高脂飲食誘導后，小鼠肝細胞里呈現(xiàn)零散的脂肪空泡（黑色箭頭處）；而發(fā)酵陳皮黑茶干預能夠明顯改善脂肪變性的情況，表現(xiàn)為肝細胞空泡減少，且存在一定程度的劑量依賴性。對小鼠肝組織進行油紅O染色，以觀察輕度早期的肝脂肪變性，正常對照組小鼠無脂肪性肝損傷表現(xiàn)；高脂飲食誘導后，可見小鼠肝組織中出現(xiàn)輕度脂肪變性；低、中、高劑量發(fā)酵陳皮黑茶干預分別有9、8、2 只小鼠的肝組織發(fā)生脂肪變性（表2），說明發(fā)酵陳皮黑茶，尤其是高劑量發(fā)酵陳皮黑茶早期預防性干預可以在一定程度上緩解由高脂飲食帶來的肝組織早期脂肪變性。如圖4B～D所示，與正常對照組相比，高脂飲食誘導后，小鼠肝組織中TG、TC、FFA的含量沒有明顯變化。和模型組小鼠相比，中劑量發(fā)酵陳皮黑茶干預后，可以極顯著降低小鼠肝組織中的總膽固醇濃度（P＜0.01）。

表2 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠肝組織形態(tài)學的影響Table 2 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on hepatic histological changes

2.4 發(fā)酵陳皮黑茶對小鼠腸道菌群的影響

Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別用來評估物種的豐富度和均勻度。如圖5A、B所示，和正常對照組相比，高脂飲食使小鼠菌群物種豐富度高度顯著下降（P＜0.001）；發(fā)酵陳皮黑茶干預后，小鼠腸道微生物菌群豐富度有所提高，其中低劑量干預后，小鼠腸道菌群Chao1指數(shù)極顯著提高（P＜0.01）。和正常對照組相比，高脂飲食使得小鼠菌群的均勻度極顯著下降（P＜0.01），發(fā)酵陳皮黑茶干預對小鼠腸道菌群的均勻度沒有明顯改變。

圖5 發(fā)酵陳皮黑茶干預對各組小鼠腸道菌群的影響Fig. 5 Effect of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on gut microbiota

各組小鼠腸道菌群PCA結果如圖5C所示，PC1、PC2貢獻率分別為30.07%、13.76%，正常對照組聚集在坐標軸的右下角，其余各組聚集在坐標軸的左側，說明高脂飲食對小鼠腸道菌群結構有所影響；給予發(fā)酵陳皮黑茶干預后，與模型組及正常組都有區(qū)別，說明發(fā)酵陳皮黑茶可以定向改變菌群結構，但是并沒有完全逆轉由于高脂飲食帶來的菌群結構的改變。

對小鼠的腸道菌群的門水平進行分析，結果如圖5D所示，各組小鼠的糞便微生物菌群在門水平上主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）以及變形菌門（Proteobacteria）構成。與正常對照組相比，高脂飲食誘導變形菌門相對豐度增加；發(fā)酵陳皮黑茶干預后，變形菌門的相對豐度隨著劑量增加而下降。變形菌門相對豐度增加與腸道上皮功能障礙密切相關，發(fā)酵陳皮黑茶干預可能有助于維持腸道上皮細胞完整性，從而維持腸道厭氧環(huán)境[17]。如圖5E所示，高脂飲食誘導厚壁菌門的比例增加，同時擬桿菌門的相對豐度下降，厚壁菌門/擬桿菌門比例高度顯著升高（P＜0.001），而發(fā)酵陳皮黑茶干預可以高度顯著降低厚壁菌門/擬桿菌門（P＜0.001），并呈明顯的劑量依賴性（LI：12.300±3.943；MI：9.137±2.143；HI：1.157±0.233）。Turnbaugh等[18]最早報道厚壁菌門和擬桿菌門與肥胖密切相關，高脂或高纖維膳食飼喂別表現(xiàn)為厚壁菌門或擬桿菌門水平的提高[19-20]。菌群中厚壁菌門/擬桿菌門的異常增加，與促進能量獲取、脂肪生成及蓄積相關。因此，厚壁菌門/擬桿菌門的降低，可能與發(fā)酵陳皮黑茶緩解小鼠由于高脂飲食誘導的肥胖趨勢相關。

對各組小鼠腸道菌群的屬水平進行分析，如圖5F所示，與NC組相比，MC組脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）相對豐度由（1.281±2.004）%上升至（4.657±3.598）%，差異顯著（P＜0.05），梭菌屬（Clostridium）相對豐度由（0.746±0.465）%下降至（0.553±0.441）%；和MC組相比，發(fā)酵陳皮黑茶尤其是高劑量發(fā)酵陳皮黑茶干預可以顯著降低脫硫弧菌相對豐度，其相對豐度由（1.278±1.280）%上升至（4.657±3.598）%，差異顯著（P＜0.05），并提高梭菌相對豐度。脫硫弧菌屬與脂多糖生成密切相關，是2型糖尿病的風險因素[21]。脫硫弧菌屬的分泌物，可以促進參與脂質(zhì)吸收的受體CD36的表達，進而調(diào)節(jié)宿主的脂質(zhì)吸收能力，最終影響宿主的體質(zhì)量等[22]，此外，產(chǎn)生的脂多糖可以促進炎癥反應，促進宿主肥胖[23]。反之，梭菌Clostridum則使得CD36減少[22,24]。因此，飲茶后體質(zhì)量增速的減緩，可能與CD36通路被抑制，脂肪酸吸收減少有關。

與NC組相比，MC組嗜膽菌屬（Bilophila）相對豐度由（0.479±0.721）%上升至（4.741±5.646）%，差異顯著（P＜0.05），與人體進食動物性飲食的結果一致[25]。飲用發(fā)酵陳皮黑茶后嗜膽菌的相對豐度繼續(xù)升高，LI組為（9.287±9.144）%，MI組為（7.142±5.393）%，HI組為（6.249±4.259）%，提示飲茶可能進一步促進膽汁酸分泌；隨著飲茶劑量增加，嗜膽菌屬相對豐度下降，可能與機體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關。有研究認為，動物性飲食促進嗜膽菌增殖，與機體自發(fā)性降低動物性飲食帶來的心血管風險相關[26]，飲用陳皮黑茶后的一系列變化支持這一推論。和NC組相比，MC組Lactobacillus和Lactococcus相對豐度有所上升，Lactobacillus由（1.486±1.034）%上升至（3.108±3.176）%，但差異不顯著（P＞0.05），和MC組相比，LI組相對豐度由（3.108±3.176）%下降至（0.352±0.287）%，差異顯著（P＜0.05），MI組下降至（1.107±0.917）%，差異顯著（P＜0.05）。而Lachnospiraceae_NK4A136_group則呈現(xiàn)相反的變化趨勢，NC組為（23.230±13.130）%，MC組為（10.230±8.903）%，LI組為（25.070±15.450）%，MI組為（12.350±10.370）%，HI組為（12.670±9.847）%。腸道中的膽鹽在Lactobacillus和Lactococcus等微生物表達的膽鹽水解酶作用下分解，從結合型膽汁酸轉化為游離型膽汁酸；進一步地，在梭菌屬和Lachnospiraceae_NK4A136_group等微生物的作用下，轉化為次級膽汁酸。因此，飲用發(fā)酵陳皮黑茶后可能導致Lachnospiraceae_NK4A136_group有激活腸道法尼醇X受體作用的游離膽汁酸減少，而具有抑制法尼醇X受體作用的次級膽汁酸增加；這一變化很可能進一步作用于肝臟的法尼醇X受體-小異二聚體伴侶，從而促進脂解和膽固醇代謝，改善肝臟脂肪沉積[27]。

高脂飼料誘導后，Ruminiclostridium_9相對豐度有所上升，由NC組的（2.871±2.974）%上升至（7.422±8.804）%，且差異顯著（P＜0.05），與非酒精性脂肪肝人群中觀察到的變化一致[28]；而高劑量發(fā)酵陳皮黑茶干預可以顯著降低其相對豐度，由MC組的（7.422±8.804）%下降至HI組的（1.719±2.477）%，且差異顯著（P＜0.05）。此外，和NC組相比，MC組Ruminococcaceae_UCG-014相對豐度有所下降，由（3.675±2.380）%下降至（1.417±1.049）%，但差異不顯著（P＞0.05），而MI組相對豐度上升至（5.255±4.860）%，且差異極顯著（P＜0.01），說明發(fā)酵陳皮黑茶干預可以顯著提高其相對豐度。

對小鼠的生化指標（包括FBG、空腹血清胰島素、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平）同腸道菌群進行相關性分析，結果如圖6所示，與代謝指標呈正相關的菌包括Dubosiella、Ruminiclostridium_9、Desulfovibrio、Alloprevotella、Coriobacteriaceae_UCG-002、Alistipes、Lactococcus等，而呈負相關的菌包括Muribaculaceae_unclassified、Akkermansia、Ruminococcaceae_UCG-014、Allobaculum、Paramuribaculum、Eubacterium以及Odoribacter等。

圖6 微生物代謝指標相關性分析Fig. 6 Correlation analysis between gut microbiota and metabolic indexes

通過PICRUSt以及KEGG數(shù)據(jù)庫分析發(fā)酵陳皮黑茶對營養(yǎng)物質(zhì)的微生物消化的影響，預測發(fā)酵陳皮黑茶干預組與模型組間的微生物消化差異代謝酶，結果表明，差異代謝酶分布在糖酵解與糖異生、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝等多種途徑。對主要差異代謝酶基因表達量進行分析，結果如圖7所示，發(fā)酵陳皮黑茶各劑量干預組中，在糖酵解途徑發(fā)揮關鍵作用的乳酸脫氫酶[EC1.1.1.27]、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶[EC:3.2.1.86]被高度顯著抑制（P＜0.001），因此，微生物消化乳酸轉變?yōu)楸嵋约傲姿峄堑乃獾韧緩奖灰种啤４送?，參與脂磷壁酸合成的酶脂磷壁酸合酶[EC:2.7.8.20]以及1,2-二?；视?-α-葡糖基轉移酶[EC:2.4.1.337]經(jīng)發(fā)酵陳皮黑茶干預后表達顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖7），而脂磷壁酸是革蘭氏陽性菌細胞壁的重要成分，與革蘭氏陽性菌的富集、黏附作用等密切相關，有研究顯示，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠會導致革蘭氏陽性細菌的積累[29]，而發(fā)酵陳皮黑茶的干預，可以導致脂磷壁酸的下降，提示其具有潛在的緩解高脂飲食帶來的菌群結構的變化的作用。

圖7 主要差異代謝酶基因表達量Fig. 7 Main differential metabolic enzyme gene expression

3 討 論

發(fā)酵陳皮黑茶是一種以陳皮和黑毛茶為原料，經(jīng)過“金花菌”（冠突散囊菌）標準化發(fā)酵制成的新型茶品。飲用發(fā)酵陳皮黑茶不影響小鼠臟器指數(shù)，呈現(xiàn)良好的安全性，同時有助于緩解因高脂飲食導致的小鼠FGB及糖耐量異常并改善肝臟脂肪沉積，其中以糖耐量異常的改善最為顯著。中劑量干預組還可以顯著降低肝組織中的總膽固醇。

飲用發(fā)酵陳皮黑茶，具有較為顯著的調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，在門水平主要表現(xiàn)為屬抑制變形菌門、降低厚壁菌門/擬桿菌門，從而與維持腸道屏障完整、降低炎癥反應相關。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，飲用陳皮黑茶可能通過抑制脂磷壁酸合成，干擾革蘭氏陽性菌在腸道的富集和黏附。

此外，屬水平的分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵陳皮黑茶逆轉高脂飲食導致的脫硫弧菌屬相對豐度增加、梭菌屬相對豐度降低，從而與抑制CD36通路、減少脂肪酸吸收相關。在促進嗜膽菌增殖的同時，減少表達膽鹽水解酶的Lactobacillus和Lactococcus相對豐度，提高作用于次級膽汁酸生成環(huán)節(jié)的梭菌屬和Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對豐度，因此發(fā)酵陳皮黑茶極有可能通過作用于膽汁酸代謝通路，促進脂解和膽固醇代謝，從而改善肝臟脂肪沉積。

發(fā)酵陳皮黑茶中沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量較低，而茶褐素和茶多糖的含量較為豐富，同時含有橙皮苷等黃酮類化合物[15]。普洱茶中的茶褐素可以降低小鼠和人類腸道菌群中乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬和乳球菌屬等的相對豐度，從而降低膽鹽水解酶活性，作用于膽汁酸激活核受體法尼醇X受體相關信號通路，進而降低肝臟膽固醇水平，發(fā)揮降脂作用[30]。本研究表明，發(fā)酵陳皮黑茶的茶褐素也可能作用于相同的通路，與發(fā)酵陳皮黑茶中的其他成分協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群、改善糖脂代謝的作用。