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        琥珀消石顆粒對(duì)腎臟草酸鈣結(jié)石大鼠BMP2通路及炎癥應(yīng)激反應(yīng)的影響

        2022-04-01 01:10:40劉玉剛張石軍劉龍史馬龍
        海南醫(yī)學(xué) 2022年6期
        關(guān)鍵詞:模型

        劉玉剛,張石軍,劉龍,史馬龍

        榆林市第一醫(yī)院泌尿外科,陜西 榆林 719000

        腎結(jié)石是常見的泌尿系統(tǒng)疾病,外科治療雖然能夠有效清除結(jié)石,但卻無(wú)法消除結(jié)石形成的病因,因此復(fù)發(fā)率較高[1]。草酸鈣結(jié)石是最常見的腎結(jié)石類型,骨形成蛋白2(bone morphoenetic protein 2,BMP2)通路激活造成鈣鹽過(guò)度沉積、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活造成腎草酸鈣小管上皮細(xì)胞損傷與結(jié)石形成密切相關(guān)[2-4]。近年來(lái),中醫(yī)中藥在腎結(jié)石治療中的價(jià)值受到越來(lái)越多關(guān)注。琥珀消石顆粒由赤小豆、當(dāng)歸、琥珀、海金沙、金錢草、雞內(nèi)金、蒲黃、牛膝組成,是治療泌尿系結(jié)石、膽結(jié)石的常用中成藥。國(guó)內(nèi)馬治中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),琥珀消石顆粒對(duì)腎結(jié)石大鼠的腎臟病理改變及鈣結(jié)晶沉積具有改善作用[5],但與之相關(guān)的分子機(jī)制并不清楚。本研究將以BMP2通路及炎癥應(yīng)激反應(yīng)為切入點(diǎn),分析琥珀消石顆粒用于腎臟草酸鈣結(jié)石大鼠治療的價(jià)值。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠10只、成年遺傳性高鈣尿結(jié)石雄性大鼠(SD遺傳背景)20只均購(gòu)自上海南方模式生物公司,生產(chǎn)許可SCXK(滬)2019-0002。

        1.2 藥物 琥珀消石顆粒(山東沃華醫(yī)藥公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z37020101),15 g/袋、10袋/盒。

        1.3 試劑與儀器 Von Kossa鈣染色試劑盒(西安赫特生物公司,ST087),骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)一抗(美國(guó)Abcam公司),白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)檢測(cè)試劑盒(上海西唐公司),丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成研究所)。

        1.4 方法

        1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 成年雄性SD大鼠10只作為對(duì)照組,成年遺傳性高鈣尿結(jié)石雄性大鼠隨機(jī)分為模型組和治療組各10只,模型組給予10 mL/kg純水灌胃,2 次/d;治療組給予琥珀消石顆粒3.335 g·kg-1·d-1、每日分2 次灌胃,每次灌胃用10 mL/kg 純水溶解。連續(xù)治療4周。

        1.4.2 尿液中草酸及鈣含量的檢測(cè) 末次灌胃后將大鼠放入代謝籠內(nèi),收集24 h 尿液,采用全自動(dòng)尿液生化分析儀檢測(cè)草酸含量及鈣含量。

        1.4.3 腎臟內(nèi)鈣沉積的檢測(cè) 完成24 h 尿液樣本收集后,腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉麻醉后解剖左側(cè)腎臟,用4%多聚甲醛固定后制作病理切片,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Von Kossa 鈣染色,在顯微鏡下觀察染色呈黑色的鈣鹽沉積情況。

        1.4.4 腎臟中BMP2表達(dá)的檢測(cè) 收集右側(cè)腎臟組織,加入組織裂解液提取組織蛋白,將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進(jìn)行Western blot 檢測(cè),電泳、電轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后孵育BMP2、RUNX2、β-actin一抗過(guò)夜,次日孵育二抗,最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶、計(jì)算條帶吸光值,以β-actin 條帶的吸光值為內(nèi)參,計(jì)算BMP2、RUNX2的表達(dá)水平。

        1.4.5 腎臟中炎癥指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 另取右側(cè)腎臟組織適量,加入組織裂解液提取組織蛋白,按照試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD的含量。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,三組間比較采用方差分析,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的資料進(jìn)一步采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 三組大鼠腎臟內(nèi)鈣鹽沉積比較 對(duì)照組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)未見鈣鹽沉積,模型組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)可見明顯鈣鹽沉積,治療組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)鈣鹽沉積與模型組比較明顯減少,見圖1。

        圖1 三組大鼠腎臟內(nèi)鈣鹽沉積的Von Kossa鈣染色(×200)

        2.2 三組大鼠24 h 尿草酸及鈣含量比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠24 h尿草酸及鈣含量均明顯升高,與模型組比較,治療組大鼠24 h 尿草酸及鈣含量均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

        表1 三組大鼠24 h尿草酸及鈣含量比較()

        表1 三組大鼠24 h尿草酸及鈣含量比較()

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

        組別24 h尿鈣含量(μmol)只數(shù)24 h尿草酸含量(mg)對(duì)照組模型組治療組F值P值13.75±2.75 62.44±10.34a 29.37±5.12b 19.292 0.001 10 10 10 63.83±11.37 161.38±27.65a 94.17±15.57b 13.474 0.001

        2.3 三組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2的表達(dá)水平均明顯升高,與模型組比較,治療組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2 的表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2和圖2。

        圖2 三組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2表達(dá)水平

        表2 三組大鼠腎臟中的BMP2、RUNX2表達(dá)水平比較()

        表2 三組大鼠腎臟中的BMP2、RUNX2表達(dá)水平比較()

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

        組別BMP2只數(shù)RUNX2對(duì)照組模型組治療組F值P值0.68±0.09 0.98±0.10a 0.74±0.08b 5.686 0.006 10 10 10 0.65±0.08 1.09±0.15a 0.77±0.10b 6.123 0.002

        2.4 三組大鼠腎臟中炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明顯升高,與模型組比較,治療組大鼠腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

        表3 三組大鼠腎臟中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較()

        表3 三組大鼠腎臟中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較()

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

        組別對(duì)照組模型組治療組F值P值IL-6(pg/mL)152.67±29.24 371.45±65.37a 226.51±54.29b 12.383 0.001只數(shù)10 10 10 IL-1β(ng/mL)0.93±0.15 2.85±0.47a 1.42±0.26b 15.812 0.001 TNF-α(ng/mL)1.66±0.28 4.31±0.84a 2.93±0.55b 14.202 0.001

        2.5 三組大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟中MDA 的含量均明顯升高、SOD的含量明顯降低,與模型組比較,治療組大鼠腎臟中MDA的含量明顯降低、SOD的含量明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

        表4 三組大鼠腎臟MDA、SOD含量比較()

        表4 三組大鼠腎臟MDA、SOD含量比較()

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

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        3 討論

        草酸鈣結(jié)石是最常見的腎結(jié)石類型,臨床治療腎結(jié)石的主要方式是外科碎石和排石,效果確切,但因?yàn)闊o(wú)法消除結(jié)石形成的原因,所以排石治療后的復(fù)發(fā)率高。腎結(jié)石的發(fā)病原因復(fù)雜,尿鈣排泄增加、鈣鹽在腎臟內(nèi)過(guò)度沉積是造成腎結(jié)石的直接原因,針對(duì)性減少尿鈣排泄是治療腎結(jié)石的潛在途徑[6-7]。本研究以遺傳性高鈣尿結(jié)石大鼠作為腎結(jié)石模型大鼠,通過(guò)Von Kossa鈣染色及24 h尿液檢測(cè)證實(shí):模型大鼠腎間質(zhì)內(nèi)鈣鹽明顯沉積,24 h 尿鈣含量及草酸含量均明顯增加,表明鈣鹽沉積、尿鈣排泄增多與腎結(jié)石的發(fā)病有關(guān),與既往關(guān)于腎結(jié)石發(fā)病相關(guān)因素的研究一致。

        中醫(yī)中藥是目前臨床上治療結(jié)石的常用方式,其中琥珀消石顆粒在腎結(jié)石、膽結(jié)石等疾病的治療中展現(xiàn)出積極價(jià)值[8-9]。該顆粒方劑中的多種中藥成分具有利小便、通淋、通經(jīng)絡(luò)、化瘀血的功效。腎結(jié)石屬于中醫(yī)“石淋”、“尿血”的范疇,發(fā)病與腎氣虧虛以及下焦?jié)駸嵊嘘P(guān),使用琥珀消石顆粒能夠針對(duì)腎結(jié)石的中醫(yī)病機(jī)發(fā)揮治療作用[10-11]。本研究采用琥珀消石顆粒灌胃的方式對(duì)腎結(jié)石模型大鼠進(jìn)行干預(yù),干預(yù)后發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)內(nèi)鈣鹽明顯減少,24 h 尿鈣含量及草酸含量均明顯降低,表明琥珀消石顆粒治療腎結(jié)石大鼠能夠減少鈣鹽沉積及尿鈣排泄。

        隨著近些年分子生物學(xué)研究的進(jìn)展,多項(xiàng)研究從分子層面闡明了腎結(jié)石發(fā)病的可能機(jī)制。BMP2是成骨分化過(guò)程中參與礦化調(diào)控的關(guān)鍵基因,該基因能夠刺激鈣沉積。白栩搏的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),在特發(fā)性高鈣尿大鼠腎結(jié)石形成過(guò)程中,腎臟內(nèi)BMP2 及下游RUNX2的表達(dá)水平明顯增加,提示BMP2通路參與腎結(jié)石的形成[2]。本研究對(duì)腎結(jié)石模型大鼠腎臟內(nèi)BMP2 通路的分析結(jié)果與白栩搏的研究結(jié)果一致,即模型組大鼠腎臟內(nèi)BMP2 及RUNX2 的表達(dá)水平高于對(duì)照組;加用琥珀消石顆粒治療后,腎臟內(nèi)BMP2 及RUNX2 的表達(dá)水平明顯降低,表明琥珀消石顆粒治療腎結(jié)石的作用與抑制BMP2通路有關(guān)。

        在腎結(jié)石的發(fā)病過(guò)程中,鈣鹽沉積是始動(dòng)因素和刺激因素,過(guò)度沉積的鈣鹽能夠刺激炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),大量生成的炎癥因子及自由基會(huì)造成腎小管上皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而加重鈣鹽沉積、促進(jìn)腎結(jié)石發(fā)病[12-14]。IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的炎癥因子[15],MDA 是自由基與脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物,SOD 是促進(jìn)自由基代謝的抗氧化酶[16]。本研究的分析結(jié)果顯示:腎結(jié)石模型大鼠腎臟內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA 的含量增加,SOD 的含量降低,與既往關(guān)于腎結(jié)石發(fā)病過(guò)程中炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的認(rèn)知一致;加用琥珀消石顆粒治療后,腎臟內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD 含量增加,表明琥珀消石顆粒治療腎結(jié)石的作用與抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

        綜上所述,琥珀消石顆粒明顯改善腎臟草酸鈣結(jié)石大鼠的腎間質(zhì)鈣鹽沉積,這一作用與抑制BMP2通路及炎癥應(yīng)激反應(yīng)激活有關(guān),未來(lái)琥珀消石顆粒有望成為防治腎結(jié)石的新藥物,BMP2通路及炎癥應(yīng)激反應(yīng)則有望成為研究腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制及防治手段的新靶點(diǎn)。

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