張志琴，王振飛，何大偉，陸軻，郝彥明，李翀

1.昆山市第一人民醫(yī)院生物樣本庫，江蘇 昆山 215316；2.徐州市中心醫(yī)院骨科，江蘇 徐州 221009；3.昆山市第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 昆山 215316

胸腹主動脈瘤術后有較高截癱發(fā)生率[1-2]。由于術中臨時阻斷了動脈血供造成脊髓缺血，研究普遍認為脊髓缺血缺氧在脊髓繼發(fā)性損傷中具有重要作用。對于脊髓損傷病理機制研究及治療方法的改進均有賴于成功制作動物模型。目前，脊髓損傷模型種類較多，包括機械性、血管性、光化學性損傷等[3]，其中缺血損傷又包括夾閉腹主動脈法、阻斷腰動脈法、氣囊栓塞法等。有學者認為，大鼠脊髓的血供節(jié)段性不強，應用大鼠制作脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)模型并不十分理想。但較多文獻報道，脊髓缺血損傷模型具有可操作性強、行為學穩(wěn)定、病理改變一致等優(yōu)點，而且大鼠脊髓血供與人相似[4]。在制作大鼠SCII 模型時，大多學者選取左腎動脈下夾閉腹主動脈[5-6]。據(jù)報道，該模型只能造成第三腰椎以下范圍缺血，并不能造成高位脊髓缺血。有學者對該模型進行了改良，通過夾閉右腎動脈上腹主動脈近心端制作SCII，該模型可以造成T13節(jié)段以下脊髓缺血，但缺血程度、時限及可以造成的病理損傷尚沒有一致的認識，因此該模型的評價顯得十分重要。本研究擬建立并評價一種改良大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，為脊髓缺血再灌注損傷相關研究提供可靠、穩(wěn)定的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 實驗動物選用清潔級雄性 SD 大鼠36 只，體質量300～400 g，由中國科學院上海實驗動物中心(斯萊克實驗動物有限公司)提供。實驗經昆山市第一人民醫(yī)院動物倫理委員會批準實施。隨機分為7 組，A1、A2 每組3 只，B1、B2、B3、B4、B5 每組6 只。A1 組不結扎腹主動脈僅行單純手術操作，心臟灌注Microfil(Flow Tech，USA)。A2組結扎腹主動脈后心臟灌注Microfil。B1組為空白對照組，B2、B3 組夾閉腹主動脈60 min 后開放腹主動脈分別再灌注24 h、48 h；B4、B5 組夾閉腹主動脈90 min后開放腹主動脈分別再灌注24 h、48 h；觀察大鼠下肢功能改變并取脊髓做病理檢測。

1.2 改良缺血再灌注模型的建立及方法 模型制作參考既往文獻介紹的方法，即選擇性夾閉大鼠右腎動脈上極腹主動脈近心端造成脊髓缺血。2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，消毒鋪巾，術中予以體溫檢測，維持大鼠體溫恒定。取腹部正中切口，打開腹膜，暴露腹主動脈，使用50 g 夾閉力的動脈夾夾閉腹主動脈。A1 組動物麻醉后打開胸腔及腹腔，剪斷下腔靜脈，進行體循環(huán)灌注，應用含有肝素鈉的生理鹽水左心室灌流約300 mL至肝臟變白，下腔靜脈流出清涼液體。然后應用4%的多聚甲醛灌流約250 mL 進行組織內固定，大鼠表現(xiàn)為全身肌肉痙攣，鼠尾翹起，至大鼠全身僵硬。將配好的Microfil 20 mL 加壓注射至左心室，灌注成功后明顯可見肝臟以及腹腔腸系膜毛細血管內充盈黃色造影劑。待Microfil 凝固后取出T11～L6脊髓組織，置于4%的多聚甲醛中保存。A2 組在灌注Microfil前夾閉腹主動脈，其余步驟同A1 組。同步輻射螺旋顯微CT于中國科學院上海應用物理研究所進行。B1 組為空白對照組，打開腹腔后隨即關閉腹腔。B2、B3 組夾閉腹主動脈 60 min 再灌注24 h、48 h。動物蘇醒后表現(xiàn)雙下肢完全癱瘓，針刺下肢有反應，但肢體不能活動者列入研究對象。術后每天給予慶大霉素8 萬單位肌肉注射預防感染。再灌注24 h、48 h后2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，肝素鈉生理鹽水及4%多聚甲醛心臟灌流，取出脊髓后置于4%多聚甲醛中保存。B4、B5 組夾閉腹主動脈90 min 后再灌注24 h、48 h。其余手術操作同B2、B3組。

1.3 神經行為學評價 采用BBB 評分于術后6 h、12 h、24 h和48 h對B組大鼠進行行為學評估，包括0～21級，完全功能缺失為0分，完全正常鼠為21分，評價的內容主要包括大鼠后肢的運動軀干位置及穩(wěn)定性步態(tài)協(xié)調性爪的置放足趾間隙以及尾的位置等。

1.4 組織病理學檢測 4%多聚甲醛浸沒組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，依次修塊切片攤片烤片后保存?zhèn)溆?。HE 染色：切片脫蠟至水，蘇木素染色3～8 min，流水稍沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化30 s(觀察分化效果)，流水稍沖洗；1%氨水溶液返藍30 s，流水稍沖洗；鏡檢著色滿意后入伊紅染液染色1～3 min；梯度酒精各5 min，二甲苯，中性樹脂封片。尼氏染色：切片脫蠟至水，入0.5%甲苯胺藍染液染3 min，水洗，用95%酒精分化，顯微鏡下控制，烤干，中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用SNK 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 脊髓動脈血供 L1節(jié)段脊髓動脈分布情況見圖1。A1 組水平面可見位于腹側面的脊髓前動脈，和成對的脊髓后動脈，正常脊髓動脈系統(tǒng)血供豐富；A2 組水平面顯示當夾閉右腎動脈上腹主動脈近心端時，兩條脊髓后動脈被完全阻斷。從側面觀機與上面觀對比可見腹主動脈夾閉前后L1節(jié)段的脊髓后動脈被阻斷，僅脊髓前動脈未被阻斷。通過查閱文獻，了解到脊髓前動脈來源于椎動脈的顱內分支，通過阻斷腹主動脈無法阻斷該動脈。通過血管鑄型CT 三維重建，顯示夾閉腹主動脈后，自L1以下的脊髓大部分血流被阻斷。

圖1 夾閉腹主動脈前后的節(jié)段脊髓血管矢狀位及水平位三維重建圖像

2.2 各組大鼠的BBB 評分比較 如表1 所示，與 B1 組比較，B2、B3 組 BBB 評分明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，B3 組比 B2 組有升高趨勢，6 h、12 h 兩個時間點差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；B4、B5 組同 B1 組比較，BBB 評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同 B2、B3 組同時間點比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，B5 組評分較 B4 有升高趨勢。

表1 各組大鼠的BBB評分比較()

表1 各組大鼠的BBB評分比較()

注：與6 h組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與12 h組比較，cP＜0.01，dP＜0.05；與24 h組比較，eP＜0.01。

組別60 min 90 min B1組B2組B3組B4組B5組F值t值P值6 h 21.00±0 4.02±0.54 4.14±0.35 12 h 21.00±0 10.10±0.71a 10.76±0.92a 24 h 21.00±0 14.02±0.76c 14.40±0.52c 48 h 21.00±0-17.00±0.71e 6 h 21.00±0 12 h 21.00±0 24 h 21.00±0 48 h 21.00±0--------------5.06±0.34e-----47.29 0.000 1 696.60-0.000 1 82.02-0.000 1 54.21-0.000 1 5.657 0.004 8 1.84±0.34 2.00±0.35 1 526-0.000 1 1.90±0.34a 3.14±0.33b 1 532-0.000 1 3.90±0.34c 4.20±0.36d 1 183-0.000 1

2.3 病理檢測 如圖2所示，B1組神經元細胞形態(tài)多樣化，胞體較大，細胞質呈嗜酸性粉染，細胞核大呈嗜堿性藍染，核仁明顯。神經膠質細胞呈小圓形或橢圓形，數(shù)量較多，細胞較小，細胞質淡粉染，細胞核小而深染，核仁不明顯，細胞間質呈粉色淡染。再灌注24 h、48 h時后可見脊髓組織出現(xiàn)神經細胞腫脹、嗜酸性增加。隨缺血時間及阻斷時間的延長，其損傷程度逐漸加重。如圖3 所示，尼氏體受染后呈塊狀或顆粒狀，核周圍尼氏體顆粒較大，近邊緣處較小而細長。在神經元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失，因此根據(jù)尼氏體受染情況和數(shù)量差異，可以判斷神經元受損程度。對照組、B1組脊髓尼氏染色神經元細胞形態(tài)基本正常。缺血60 min再灌注24 h、48 h，缺血90 min再灌注24 h、48 h組脊髓病理改變逐漸加重，且以脊髓前灰質受損更明顯。B2、B3 組脊髓組織病理顯示運動神經元腫脹，核仁尚清楚、深染，中央性尼氏小體腫脹，排列松散；B4、B5 部分尼氏小體溶解或消失。

圖2 各組大鼠缺血前后的脊髓組織HE染色結果(100×)

圖3 各組大鼠缺血前后的脊髓組織尼氏染色結果(100×)

3 討論

自從ZIVIN等[7]以夾閉兔腎動脈下腹主動脈建立脊髓缺血再灌注損傷模型以來，各種改良的模型不斷涌現(xiàn)。伍亞民等[8]通過選擇性阻斷家兔腰動脈模擬出不同程度的損傷，避免了夾閉腹主動脈而造成的下肢及腹腔臟器的缺血損傷。CHENG 等[9]由家兔右股動脈插入Swan-Ganz 球囊導管至腹主動脈，并在動脈造影X射線監(jiān)視下插至腎動脈起始部，通過充氣和排氣復制脊髓缺血再灌注模型。SCII模型逐漸引入狗、大鼠等試驗動物[10-11]。大鼠因接近人類脊髓血供情況，而且價格適宜，易于飼養(yǎng)及管理而被廣泛用于實驗研究。有學者應用2F Fogarty帶囊導管插入鼠脊髓胸主動脈造成脊髓缺血。另有有較多研究應用夾閉大鼠左腎動脈下腹主動脈造成脊髓缺血，均獲得良好效果。然而，由于夾閉左腎動脈下腹主動脈僅平脊髓L4～5位置，造成脊髓缺血范圍較局限，所以該模型并不是一個十分理想的SCII模型。因此，有學者對該模型進行了改良，夾閉右腎動脈上腹主動脈近心端以造成脊髓更大范圍的缺血損傷[12]。目前，改良模型在造成脊髓缺血前后的血供情況及缺血后脊髓組織病理改變等資料仍然缺乏。該研究應用脊髓血管鑄型三維重建技術及脊髓組織病理觀察重新評估該模型的可靠性及穩(wěn)定性。

脊髓動脈同步輻射CT 三維重建圖像顯示了夾閉腹主動脈前后T13節(jié)段以下脊髓動脈血供分布情況，為夾閉腹主動脈后脊髓血供分布提供了客觀依據(jù)。通過查閱文獻資料我們了解到，未被阻斷的動脈分支來源于椎動脈的顱內分支，向下走行至腰膨大并逐漸變細，證實了有學者認為的大鼠脊髓血供節(jié)段性不強的觀點。同時也證實了該模型能夠阻斷T13以下節(jié)段脊髓大部分動脈供應。BBB評分顯示，隨著缺血時間的延長，BBB評分呈下降趨勢，表明缺血時間越長，脊髓損傷越重。再灌注48 h較24 h評分有升高趨勢，顯示再灌注24 h 后脊髓損傷有逐漸恢復的趨勢。脊髓尼氏染色能較好地反映灰質的病理改變情況，神經損傷表現(xiàn)為神經元尼氏體淡染或消失。缺血90 min 組較缺血60 min同時間點神經元損傷數(shù)量明顯增多，提示神經損傷嚴重程度與缺血時間呈正相關。HE 染色結果同尼氏染色一致。有文獻報道，對主動脈阻斷的手術患者進行死亡率回顧分析，結果顯示神經功能受損的嚴重程度與主動脈阻斷時間呈正相關[13]。

綜合分析脊髓動脈三維CT 重建圖像、大鼠行為學評分、脊髓組織病理結果，該模型成功造成了脊髓T13以下節(jié)段缺血損傷，而且行為學及病理學改變穩(wěn)定，神經損傷程度與缺血時限有明顯相關性，即不同的缺血時間造成了不同程度的損傷。該模型也有不足之處：夾閉更高位置的腹主動脈造成了腹腔臟器更大范圍的缺血損傷，增大了大鼠術后死亡率。該模型也具有更多優(yōu)點：操作簡單、實驗動物易于獲得、易于管理、脊髓血管解剖接近人等。綜上，該改良模型簡易可控，具有推廣價值。