王婷婷,陳鴿,包悅琳,金東淳

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133000)

鐵是植物必需的微量營養(yǎng)素,在植物生長發(fā)育過程中參與光合作用、呼吸作用、葉綠素合成、氧化還原反應(yīng)、氮固定等多種生理生化反應(yīng)[1-2]。鐵缺乏將會(huì)導(dǎo)致植物生理生化發(fā)生不利改變,輕度缺鐵時(shí)植物光合速率降低,葉綠素合成減少,嚴(yán)重時(shí)葉片會(huì)出現(xiàn)黃化現(xiàn)象[3-4]。重度缺鐵時(shí),植物新生葉片變黃,葉綠素合成停止,生物量大幅度下降,導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低[5-6]。鐵在地殼中含量很高,但其主要以生物有效性低的三價(jià)鐵形式存在,特別是在堿性土壤中,堿性和高碳酸鹽嚴(yán)重降低了有效鐵的溶解度。由于缺鐵導(dǎo)致葉綠素生物合成受阻造成的植物缺鐵黃化癥(IDC),是一種功能性缺鐵,葉片失綠變黃[7]。缺鐵植物吸收土壤中鐵通常分為2種機(jī)制:非禾本科單子葉植物和雙子葉植物通常采用還原吸收機(jī)制,即缺鐵時(shí),通過鐵螯合還原酶(FCR)將土壤中溶解度較低的Fe3+還原成易被植物吸收的Fe2+[8];禾本科植物主要采用螯合吸收機(jī)制,缺鐵時(shí),植物會(huì)通過合成與分泌麥根酸(mugineic acid,MA)類物質(zhì)并螯合鐵來滿足對(duì)鐵元素的需求[9]。依靠Fe3+還原系統(tǒng)吸收鐵的植物,如雙子葉植物大豆,往往比使用螯合吸收機(jī)制的禾本科植物對(duì)缺鐵更敏感[10]。在缺鐵條件下,大豆地上部幼葉脈間均勻失綠,葉脈正常,無斑、無畸形,隨著時(shí)間推移,病葉最后干枯;地下部根系發(fā)育較差,根短而細(xì)少,根瘤數(shù)量較少,嚴(yán)重時(shí)植株早期枯萎和死亡[11-12]。

近幾年,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于大豆對(duì)缺鐵脅迫響應(yīng)的研究[13-17]。O’Rourke等[13]通過轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)鐵高效大豆品種‘Clark’在響應(yīng)長期(14 d)缺鐵脅迫時(shí),根系中與鐵吸收和穩(wěn)態(tài)、防御以及DNA復(fù)制、甲基化作用相關(guān)的基因表達(dá)有差異。Atwood等[14]進(jìn)一步的研究表明,‘Clark’對(duì)缺鐵脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中DNA復(fù)制基因的沉默導(dǎo)致與防御、免疫、衰老、死亡、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)合成、光合作用以及鐵攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的大量轉(zhuǎn)錄重編程。Lauter等[15]通過轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)‘Clark’在響應(yīng)早期(1和 6 h)缺鐵脅迫時(shí),在根系中參與防御、激素信號(hào)、鐵吸收的基因差異表達(dá),在葉片中參與DNA復(fù)制和糖信號(hào)傳導(dǎo)的基因差異表達(dá)。Lauter等[16]通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),‘Clark’在缺鐵脅迫30 min時(shí)就能檢測到參與鐵吸收和穩(wěn)態(tài)、防御以及DNA復(fù)制、甲基化作用的差異表達(dá)基因。這些研究表明,在長期和短期缺鐵脅迫下,鐵穩(wěn)態(tài)、防御和DNA復(fù)制、甲基化相關(guān)基因均參與了‘Clark’的缺鐵應(yīng)激反應(yīng),說明大豆可能存在新的機(jī)制來響應(yīng)缺鐵脅迫。目前,我國對(duì)大豆缺鐵脅迫的響應(yīng)差異研究較少[17]。本研究對(duì)不同鐵效率大豆品種進(jìn)行早期缺鐵脅迫處理,從分子水平解析我國大豆品種根系早期對(duì)缺鐵脅迫的響應(yīng)差異,為了解我國大豆品種鐵吸收機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水培試驗(yàn)于2020年在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院人工氣候室進(jìn)行,供試材料為已鑒定的鐵高效大豆品種‘吉育99’和鐵低效大豆品種‘吉育93’[6]。在鐵缺乏(1 μmol·L-1Fe)營養(yǎng)液中培養(yǎng)20 d的2個(gè)品種植株表型見圖1。

圖1 在鐵缺乏(1 μmol·L-1 Fe)營養(yǎng)液中培養(yǎng)20 d時(shí)鐵高效品種‘吉育99’(A)和鐵低效品種‘吉育93’(B)V2期葉片顏色對(duì)比

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為模擬堿性石灰性土壤,本試驗(yàn)建立了一套水培體系。將常規(guī)發(fā)芽(芽長2～3 cm)且發(fā)育良好的大豆幼苗移至1 L含正常鐵含量(25 μmol·L-1Fe)的營養(yǎng)液中。營養(yǎng)液由1.5 mmol·L-1KNO3、0.8 mmol·L-1Ca(NO3)2、0.3 mmol·L-1(NH4)H2PO4、0.2 mmol·L-1MgSO4、25 μmol·L-1CaCl2、25 μmol·L-1H3BO3、2 μmol·L-1MnCl2、2 μmol·L-1ZnSO4、0.5 μmol·L-1Na2MoO4、0.1 μmol·L-1CuSO4、1 mmol·L-1MES緩沖液(pH5.5)和25 μmol·L-1Fe(Ⅲ)EDDHA構(gòu)成,每4 d換1次營養(yǎng)液。水培16 d后即植株長出第1片三出復(fù)葉時(shí),將所有幼苗的根系在蒸餾水中沖洗6次,然后分別轉(zhuǎn)入鐵正常(25 μmol·L-1Fe)和鐵缺乏(1 μmol·L-1Fe)營養(yǎng)液中,處理1 和6 h后取植株的完整根系,裝袋標(biāo)記并在液氮中快速冷凍后置于-80 ℃保存,每個(gè)樣品3次重復(fù)。RNA提取、建庫和轉(zhuǎn)錄組測序均委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

將‘吉育99’和‘吉育93’分別命名為T、S,各時(shí)間的處理組合如表1所示。

表1 試驗(yàn)材料的處理組合

1.3 文庫構(gòu)建

樣品檢測合格后,進(jìn)行文庫構(gòu)建:用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA,加入Fragmentation Buffer將mRNA隨機(jī)打斷,以mRNA為模板,用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第1條cDNA鏈,加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成第2條cDNA鏈,利用AMPure XP beads純化 cDNA;純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭,然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇;通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫構(gòu)建完成后,使用Q-PCR方法對(duì)文庫的有效濃度(>2 nmol·L-1)進(jìn)行準(zhǔn)確定量,以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后,不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行pooling,用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

采用如下過濾方式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制:去除含有接頭的Reads,去除低質(zhì)量的Reads(包括去除N的比例大于10%的Reads、去除質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Read的50%以上的Reads),對(duì)高質(zhì)量的Clean Data進(jìn)行分析。

1.5 基因表達(dá)量與差異基因的篩選

抽取自一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的片段數(shù)與測序數(shù)據(jù)(或Mapped Data)量、轉(zhuǎn)錄本長度、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平都有關(guān),為了讓片段數(shù)能真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平,需要對(duì)樣品中的Mapped Reads數(shù)和轉(zhuǎn)錄本長度進(jìn)行歸一化。StringTie通過最大流量算法,采用FPKM[18](fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo),FPKM計(jì)算公式如下:

式中:cDNA Fragments表示比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的片段數(shù),即雙端Reads數(shù);Mapped Fragments(Millions)表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)(106);Transcript Length(kb)表示轉(zhuǎn)錄本長度(103個(gè)堿基)。

將數(shù)據(jù)庫與大豆基因組數(shù)據(jù)庫(Wm82.a2.v1)進(jìn)行對(duì)比,利用edgeR軟件[19]進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析,在差異表達(dá)基因檢測過程中,將差異表達(dá)倍數(shù)(fold change)≥ 2且差異顯著性P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異表達(dá)倍數(shù)表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值。

1.6 差異表達(dá)基因GO分類

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果,使用Blast2GO軟件[20]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋,再用WEGO軟件進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)并繪圖。

1.7 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG注釋,并利用KOBAS軟件[21]對(duì)檢測到的差異基因進(jìn)行KEGG通路分類以及富集分析,本試驗(yàn)以Q<0.05為閾值,將滿足該閾值的代謝通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路。

1.8 差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄因子分析

對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析,將差異表達(dá)基因比對(duì)到植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫4.0(plant transcription factor database,PlantTFDB 4.0)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/),所設(shè)閾值為E=1×10-5,獲得差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子分類與數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

本試驗(yàn)分別對(duì)鐵高效、鐵低效大豆24個(gè)根系樣本進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組測序(表2),共獲得236.33 Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達(dá)到5.81 Gb,GC含量均在44.53%及以上,Q20堿基比例在96.74%及以上,Q30堿基比例在91.60%及以上。以上數(shù)據(jù)說明全部樣品轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高,可為后續(xù)的差異表達(dá)基因分析提供科學(xué)的依據(jù)。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估統(tǒng)計(jì)表

2.2 大豆根系響應(yīng)早期缺鐵脅迫差異表達(dá)基因(DEG)數(shù)分析

從圖2可見:與對(duì)照(CK)相比,1 h鐵高效組共篩選出2 309個(gè)DEG,其中上調(diào)1 051個(gè),下調(diào)1 258個(gè);1 h鐵低效組共篩選出1 512個(gè)DEG,其中上調(diào)597個(gè),下調(diào)915個(gè);6 h鐵高效組共篩選出2 320個(gè)DEG,其中上調(diào)1 346個(gè),下調(diào)974個(gè);6 h鐵低效組共篩選出1 307個(gè)DEG,其中上調(diào)637個(gè),下調(diào)670個(gè)。結(jié)果表明,缺鐵脅迫1 h時(shí),鐵高效和低效大豆品種根系中差異表達(dá)基因多數(shù)為下調(diào)基因;缺鐵脅迫6 h時(shí),鐵高效大豆品種的差異表達(dá)基因多數(shù)為上調(diào),鐵低效大豆品種下調(diào)基因仍占多數(shù)。綜上,鐵高效大豆品種差異基因的數(shù)量和表達(dá)量隨著缺鐵脅迫時(shí)間的延長而增加,而鐵低效品種差異基因數(shù)量和表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長而降低。

圖2 缺鐵脅迫下不同鐵效率大豆品種差異表達(dá)基因數(shù)

2.3 大豆根系響應(yīng)早期缺鐵脅迫DEG的GO功能分析

缺鐵脅迫處理1 h的鐵高效大豆品種在生物學(xué)過程中的細(xì)胞進(jìn)程富集的DEG數(shù)為739個(gè),代謝過程富集的DEG數(shù)為677個(gè);細(xì)胞組分中的細(xì)胞和細(xì)胞成分富集的DEG數(shù)均為839個(gè);分子功能中的結(jié)合富集的DEG數(shù)為841個(gè),催化活性富集的DEG數(shù)為804個(gè)(圖3-A)。鐵低效大豆品種在生物學(xué)過程中的細(xì)胞進(jìn)程富集的DEG數(shù)為449個(gè),代謝過程富集的DEG數(shù)為410個(gè);細(xì)胞組分中的細(xì)胞和細(xì)胞成分富集的DEG數(shù)均為506個(gè);分子功能中的結(jié)合富集的DEG數(shù)為570個(gè),催化活性富集的DEG數(shù)為513個(gè)(圖3-B)。

圖3 GO功能分類統(tǒng)計(jì)

缺鐵脅迫處理6 h的鐵高效大豆品種在生物學(xué)過程中的細(xì)胞進(jìn)程富集的DEG數(shù)為734個(gè),代謝過程富集的DEG數(shù)為676個(gè);細(xì)胞組分中的細(xì)胞和細(xì)胞成分富集的DEG數(shù)均為802個(gè);分子功能中的催化活性富集的DEG數(shù)為868個(gè),結(jié)合富集的DEG數(shù)為857個(gè)(圖3-C)。鐵低效大豆品種在生物學(xué)過程中的細(xì)胞進(jìn)程富集的DEG數(shù)為430個(gè),代謝過程富集的DEG數(shù)為388個(gè);細(xì)胞組分中的細(xì)胞和細(xì)胞成分富集的DEG數(shù)均為494個(gè);分子功能中的結(jié)合富集的DEG數(shù)為521個(gè),催化活性富集的DEG數(shù)為466個(gè)(圖3-D)。

差異表達(dá)基因的GO功能分析結(jié)果表明,不同鐵效率大豆品種根系在響應(yīng)早期(1和6 h)缺鐵脅迫時(shí),產(chǎn)生的差異表達(dá)基因均顯著富集在細(xì)胞進(jìn)程、代謝過程、細(xì)胞和細(xì)胞成分以及分子結(jié)合和催化活性相關(guān)功能基因中,表明缺鐵脅迫對(duì)大豆的細(xì)胞及生理代謝過程存在較大的影響。

2.4 大豆根系響應(yīng)早期缺鐵脅迫DEG的KEGG富集分析

由圖4-A可見:與對(duì)照相比,缺鐵脅迫處理1 h的鐵高效大豆品種共有774個(gè)DEG富集于117條通路中,鐵低效大豆共有522個(gè)DEG富集于113條通路中;缺鐵脅迫處理6 h的鐵高效大豆品種共有807個(gè)DEG富集于125條通路中,鐵低效品種共有472個(gè)DEG富集于115條通路中。在富集顯著性(Q<0.05)最可靠的前20條代謝通路中,缺鐵脅迫處理1 h的鐵高效大豆品種差異表達(dá)基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(63個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(16個(gè))、植物病原體相互作用(111個(gè))、植物MAPK信號(hào)通路(60個(gè))、類黃酮生物合成(18個(gè))、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(95個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(53個(gè))等。缺鐵脅迫處理1 h的鐵低效大豆品種差異表達(dá)基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(36個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(9個(gè))、植物病原體相互作用(92個(gè))、植物MAPK信號(hào)通路(51個(gè))、類黃酮生物合成(17個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(42個(gè))、植物晝夜節(jié)律(19個(gè))等(圖4-B)。

圖4 缺鐵脅迫處理1 h差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

缺鐵脅迫處理6 h的鐵高效大豆品種差異表達(dá)基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(72個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(10個(gè))、類黃酮生物合成(24個(gè))、植物晝夜節(jié)律(23個(gè))、糖酵解/糖異生(34個(gè))、角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟的生物合成(13個(gè))、半乳糖代謝(27個(gè))等(圖5-A)。缺鐵脅迫處理6 h的鐵低效大豆品種差異表達(dá)基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(34個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(6個(gè))、植物MAPK信號(hào)通路(36個(gè))、類黃酮生物合成(10個(gè))、亞油酸代謝(9個(gè))、抗壞血酸和醛酸代謝(12)、谷胱甘肽代謝(14)等(圖5-B)。

圖5 缺鐵脅迫處理6 h差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

綜上可知,不同鐵效率大豆品種在響應(yīng)早期(1和6 h)缺鐵脅迫時(shí),產(chǎn)生的差異表達(dá)基因均富集于苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成等代謝通路。

2.5 大豆根系響應(yīng)早期缺鐵脅迫的轉(zhuǎn)錄因子分析

缺鐵脅迫處理1 h,鐵高效大豆品種存在轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因總共有273個(gè),這些轉(zhuǎn)錄因子共劃分到41個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中,其中,差異表達(dá)基因最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是AP2/ERF-ERF(38個(gè)),其次為C2H2(27個(gè))、MYB(26個(gè))、WRKY(23個(gè))、bHLH(23個(gè))、NAC(12個(gè))等(圖6-A);鐵低效大豆品種存在轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因總共有197個(gè),共劃分到39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中,其中,差異表達(dá)基因最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是AP2/ERF-ERF(26個(gè)),其次為MYB(20個(gè))、WRKY(19個(gè))、C2H2(15個(gè))、bHLH(14個(gè))、NAC(10個(gè))等(圖6-B)。缺鐵脅迫處理6 h,鐵高效大豆品種存在轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因總共有217個(gè),這些轉(zhuǎn)錄因子共劃分到42個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中,其中,差異表達(dá)基因最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是bHLH(25個(gè)),其次為WRKY(20個(gè))、AP2/ERF-ERF(16個(gè))、NAC(14個(gè))、MYB(13個(gè))、C2H2(12個(gè))等(圖6-C);鐵低效大豆品種存在轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因總共有134個(gè),共劃分到39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中,其中,差異表達(dá)基因最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是bHLH(18個(gè)),其次為AP2/ERF-ERF(12個(gè))、MYB(12個(gè))、NAC(10個(gè))、WRKY(9個(gè))等(圖6-D)。結(jié)果表明,鐵高效大豆品種在響應(yīng)缺鐵脅迫時(shí),在1和6 h的差異表達(dá)基因所涉及的轉(zhuǎn)錄因子家族具有高度相似性,受缺鐵脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、C2H2、MYB、WRKY、bHLH、NAC等。同樣,鐵低效大豆品種也具有高度相似性,受缺鐵脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、bHLH、NAC等。

圖6 差異表達(dá)基因所屬轉(zhuǎn)錄因子家族分類

3 討論

不同鐵效率大豆品種對(duì)缺鐵黃化癥的耐受性存在顯著差異[22],為了解不同鐵效率大豆品種根系對(duì)早期缺鐵脅迫的響應(yīng)差異,本研究對(duì)缺鐵脅迫下的鐵高效品種(吉育99)和鐵低效品種(吉育93)根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對(duì)不同鐵效率大豆品種在缺鐵脅迫條件下產(chǎn)生的差異基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明,與對(duì)照(CK)相比,缺鐵脅迫處理1 h時(shí),2個(gè)大豆品種根系中多數(shù)基因表達(dá)量降低,少數(shù)升高;缺鐵脅迫處理6 h時(shí),鐵高效大豆品種大部分差異基因表達(dá)量顯著上升,多數(shù)為上調(diào)基因,而鐵低效大豆品種下調(diào)基因仍占多數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn),鐵高效大豆品種差異基因數(shù)和表達(dá)量隨著缺鐵脅迫時(shí)間的延長而增加,而鐵低效品種差異基因數(shù)和表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長而降低。差異基因在2個(gè)大豆品種中表達(dá)情況不一致,說明早期缺鐵脅迫對(duì)大豆相關(guān)基因表達(dá)量存在一定影響,且對(duì)不同鐵效率大豆品種的影響存在顯著差異。

脅迫可以引發(fā)植物的一系列反應(yīng)。脅迫反應(yīng)始于植物在細(xì)胞水平上對(duì)脅迫的識(shí)別,這種識(shí)別可以激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而在個(gè)體細(xì)胞內(nèi)及整株植物中傳遞。在差異表達(dá)基因的GO功能分析中,主要涵蓋了生物學(xué)過程,細(xì)胞組分和分子功能三大類。本研究結(jié)果表明,不同鐵效率大豆品種受早期缺鐵脅迫影響產(chǎn)生的差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程中的細(xì)胞進(jìn)程、代謝過程,細(xì)胞組分中的細(xì)胞和細(xì)胞成分以及分子功能中的分子結(jié)合和催化活性比例較高。缺鐵脅迫處理1和6 h的不同鐵效率大豆品種差異表達(dá)基因富集情況一致,說明缺鐵脅迫對(duì)大豆的細(xì)胞及生理代謝過程存在一定的影響。翟麗紅[17]研究發(fā)現(xiàn),在長期(12 d)缺鐵脅迫下,大豆差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞功能、分子結(jié)合、催化活性、細(xì)胞過程、代謝過程。這與本研究中短期(1和6 h)缺鐵脅迫差異基因功能注釋結(jié)果一致,說明該類功能基因在缺鐵脅迫1 h后就能對(duì)缺鐵脅迫作出響應(yīng)。Lauter等[15]研究發(fā)現(xiàn)鐵高效大豆品種體內(nèi)典型鐵吸收相關(guān)基因在缺鐵1 h后就能對(duì)缺鐵脅迫作出響應(yīng),本研究結(jié)果與之相一致。

通過差異表達(dá)基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),缺鐵脅迫處理1 h,不同鐵效率大豆品種富集的差異表達(dá)基因數(shù)在苯丙烷生物合成(T1:63個(gè),S1:36個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(T1:16個(gè),S1:9個(gè))、植物病原體相互作用(T1:111個(gè),S1:92個(gè))、植物MAPK信號(hào)通路(T1:60個(gè),S1:51個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(T1:53個(gè),S1:42個(gè))等代謝通路中有顯著差異(P<0.05)。缺鐵脅迫處理6 h,不同鐵效率大豆品種富集的差異表達(dá)基因數(shù)在苯丙烷生物合成(T6:72個(gè),S6:34個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(T6:10個(gè),S6:6個(gè))、類黃酮生物合成(T6:24個(gè),S6:10個(gè))、谷胱甘肽代謝(T6:21個(gè),S6:14個(gè))等代謝通路中有顯著差異(P<0.05)。綜上,不同鐵效率大豆品種差異表達(dá)基因富集的代謝通路中苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成等代謝通路在1和6 h富集的差異表達(dá)基因數(shù)均存在顯著差異。說明早期缺鐵脅迫對(duì)大豆苯丙烷類和萜類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑有影響,且對(duì)不同鐵效率大豆品種的影響存在差異。Piotrowska-Niczyporuk等[23]研究發(fā)現(xiàn)植物處于鉛重金屬脅迫時(shí),其生長發(fā)育會(huì)受到抑制,而植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量會(huì)有顯著變化。Waters等[10]研究發(fā)現(xiàn)大豆在堿性和低鐵條件下,苯丙素合成途徑中的基因會(huì)顯著上調(diào)。Schmid等[24]研究發(fā)現(xiàn)缺鐵條件下擬南芥中苯丙素合成途徑的基因表達(dá)會(huì)增加。本研究發(fā)現(xiàn),苯丙烷生物合成途徑是富集差異基因數(shù)較多且差異最顯著的一條代謝通路,說明不同鐵效率大豆品種在響應(yīng)早期缺鐵脅迫時(shí),苯丙烷生物合成途徑存在顯著差異。

轉(zhuǎn)錄因子是植物應(yīng)答非生物脅迫過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,研究表明植物體內(nèi)某些特定的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化能提高其適應(yīng)逆境的能力[25]。當(dāng)植物鐵供應(yīng)不足或過量時(shí),植物中的轉(zhuǎn)錄因子能誘導(dǎo)或抑制許多鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析,結(jié)果表明鐵高效大豆品種受早期缺鐵脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、C2H2、MYB、WRKY、bHLH、NAC等,鐵低效大豆品種的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、bHLH、NAC等。Li 等[26]通過對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GmbHLH57和GmbHLH300的研究發(fā)現(xiàn),2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)上調(diào)了下游Fe攝取基因,增加了轉(zhuǎn)基因植物中的鐵含量;與野生型相比,這些雙過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)缺鐵脅迫的耐受性更強(qiáng),并發(fā)現(xiàn)這 2種轉(zhuǎn)錄因子在根和結(jié)節(jié)中表達(dá),并由鐵缺乏誘導(dǎo)。Yuan等[27]研究發(fā)現(xiàn)bHLH38蛋白與FIT蛋白相互作用來控制擬南芥中大部分鐵攝取反應(yīng)。bHLH38/39/100/101與 FIT同屬于bHLHIb亞家族,bHLH38、bHLH39 在葉和根中都表達(dá),且都被缺鐵強(qiáng)烈誘導(dǎo)[28]。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)bHLH104和bHLH105通過直接激活bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄,正向調(diào)控Fe穩(wěn)態(tài)。Stein等[30]發(fā)現(xiàn)MYB72基因因擬南芥根部缺鐵而上調(diào)。Scully等[31]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥MYB58和MYB63以及高粱MYB60轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥和高粱的苯丙烷途徑的表達(dá)和木質(zhì)素的合成增加。Waters等[10]研究發(fā)現(xiàn)大豆中有些MYB轉(zhuǎn)錄因子在缺鐵或堿性脅迫下上調(diào),并與苯丙烷類合成基因上調(diào)一致。本研究發(fā)現(xiàn)缺鐵脅迫處理1 h的不同鐵效率大豆品種的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量在AP2/ERF-ERF(T1:38個(gè),S1:26個(gè))、C2H2(T1:27個(gè),S1:15個(gè))、bHLH(T1:23個(gè),S1:14個(gè))等轉(zhuǎn)錄因子家族中存在顯著差異,缺鐵脅迫處理6 h的不同鐵效率大豆品種的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量在WRKY(T6:20個(gè),S6:9個(gè))、C2H2(T6:12個(gè),S6:5個(gè))、bHLH(T6:25個(gè),S6:18個(gè))等轉(zhuǎn)錄因子家族中存在顯著差異。說明在缺鐵脅迫下,不同鐵效率大豆品種對(duì)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控存在顯著差異。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了不同鐵效率大豆品種根系響應(yīng)早期缺鐵脅迫的差異表達(dá)基因,通過GO功能注釋、KEGG代謝通路富集分析、轉(zhuǎn)錄因子分析,發(fā)現(xiàn)缺鐵脅迫1 h后大豆就能對(duì)缺鐵脅迫作出響應(yīng),且不同鐵效率大豆品種在苯丙烷生物合成、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著差異。