裴丹,劉眾杰,葛孟清,董天宇,任艷華,房經(jīng)貴

(南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院,江蘇 南京 210095)

葡萄(Vitisvinifera)是一種具有重要經(jīng)濟價值的果樹作物,也是加工深度最高、加工產(chǎn)品最豐富的水果之一[1]。從世界范圍來看,葡萄育種水平的高低決定著產(chǎn)業(yè)發(fā)展的走向和市場競爭力的強弱。由于葡萄世代周期長,從種子萌發(fā)到實生苗第1次開花結(jié)果需要3～5年的時間,一個葡萄品種的選育往往需要12～20年;同時,長期的自然選擇和人工馴化育種使葡萄中積累了大量變異,且遺傳背景復(fù)雜,傳統(tǒng)雜交育種通常耗時長、效率低。因此,開展基因定位并利用分子生物學技術(shù)對葡萄進行分子輔助育種尤為重要。

1995年研究人員開始對葡萄連鎖圖譜進行繪制,主要用于定位目標性狀的遺傳決定因素并鑒定輔助育種的分子標記。Dalbó等[2]于2000年構(gòu)建‘Horizon’和‘Illinois 547-1’群體的遺傳圖譜并檢測出與葡萄性別相關(guān)的數(shù)量性狀位點(QTL),之后許多學者利用“雙假測交”F1群體定位了葡萄的品質(zhì)性狀、脅迫抗性和物候期等大量的QTL。本文對近20年來葡萄遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的研究進展進行綜述,較為全面地列舉了國內(nèi)外已定位的QTL,以期為葡萄分子輔助育種提供指導(dǎo)依據(jù),并為后續(xù)更多數(shù)量性狀位點的挖掘和分子標記輔助育種(MAS)在葡萄育種上的推廣提供參考。

1 葡萄QTL定位材料與標記類型

1.1 定位群體類型

由于葡萄具有童期長、遺傳雜合度高的特點,因此難以獲得高代群體。常見的用于QTL基因定位研究的群體類型主要為雜交F1代,少數(shù)以雜交F2代、回交群體、自交群體和自然群體作為試驗材料。同時,在確定群體結(jié)構(gòu)時應(yīng)包含具有極端表型的葡萄品種,以獲得目標性狀分離的子代群體。截至目前,用于QTL定位研究的群體共72個,各類雜交/自交群體共涉及108個品種,自然群體共620個品種,多數(shù)是以‘Cabernet Sauvignon’(法國)、‘Regent’(德國)、‘Lemberg’(奧地利)等釀酒品種作為親本進行試驗。

1.2 DNA分子標記類型

最早用于葡萄遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位的分子標記主要有隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)和擴增片段長度多態(tài)性標記(AFLP),它們可以快速構(gòu)建連鎖群(linkage group,LG),但不易進行比較。隨著基因組測序的開展,在重疊序列中鑒定到了更多的簡單重復(fù)序列(SSR)[3],它們具有共顯性、高度多態(tài)性以及易在相關(guān)葡萄品種間轉(zhuǎn)移的特征。第一套SSR標記共371個,是由葡萄微衛(wèi)星聯(lián)盟(VMC)開發(fā)的。1996年,Bowers等[4]開發(fā)了4個VVMD引物標記。di Gaspero等[5]開發(fā)了另外2套基于微衛(wèi)星的標記(169個VVI標記,108個UDV標記)。目前用于QTL定位的標記中,SSR的使用頻率最高。

Troggio等[6]、Vezzulli等[7]利用釀酒葡萄的雜交群體開發(fā)了基于單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記的葡萄遺傳連鎖圖譜。由于SNP具有分布廣、多態(tài)性高、易于檢測統(tǒng)計等優(yōu)點,因此也被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、單倍型鑒定、連鎖不平衡和親子關(guān)系分析等研究中[8-10]。同時,SNP標記也可與SSR一起用于評估群體遺傳結(jié)構(gòu)和高分辨率作圖,也有研究利用鑒定SNP的方法分析葡萄系統(tǒng)發(fā)育的路線、解釋葡萄進化關(guān)系[11-13]。近年來,隨著測序技術(shù)的日漸成熟,基于SNP技術(shù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association analysis,GWAS)技術(shù)在葡萄基因定位研究中得到了廣泛的應(yīng)用,目前已進行了大量關(guān)于作物基因型和表型之間關(guān)系的研究[14-15]。GWAS被認為是多年生果樹中QTL定位研究的理想替代方法。目前,Sapkota等[16]和Smith等[17-18]利用GWAS鑒定了葡萄霜霉病、根結(jié)線蟲和黃褐變線蟲抗性相關(guān)的QTL;Guo等[19]和Liang等[20]利用GWAS鑒定了葡萄單果重、果實形狀、芳香化合物等表型相關(guān)的QTL。

2 葡萄重要QTL定位研究進展

2.1 定位染色體分布

目前在葡萄的所有連鎖群中均已鑒定到QTL,但不同連鎖群之間的基因數(shù)目有較大差異。其中定位在LG18的位點最多(18個),其次LG14為10個,LG9、LG12、LG15均為6個,LG5、LG7、LG16均為5個,LG2均為4個,LG3、LG4、LG6、LG10、LG13均為3個,LG1、LG8、LG19均為2個,最少的LG11和LG17均為1個。

以LG18為例,VMC7f2標記與Ren4、Run2.1、Run2.2、Rpv3、果實大小、Sd1、RDA位點連鎖[21-23];VVIn16標記與Run2.1、Rpv3、果實硬度位點連鎖[21-23];VMC6f11標記與Sd1、果實硬度位點連鎖[24];SCC8標記與果實大小、Sd1位點連鎖[25];UDV-737標記與Rpv3、Rpv27位點連鎖[23];其余標記僅與1個位點連鎖。由此可知基因位點在基因組及連鎖群上是呈不均勻分布的。

2.2 葡萄重要性狀基因的QTL定位

迄今為止,共定位了超過100個葡萄重要性狀基因位點[26-70],其中主要是抗病相關(guān)位點,又以霜霉病(downy mildew)抗性位點最多(表1)。Merdinoglu等[43-44]采用SSR等分子標記方式,利用‘Syrah’×28-8-78等F1雜交群體構(gòu)建遺傳圖譜,分別將Rpv1、Rpv2基因定位于12和18號連鎖群上;隨后,Welter等[22]利用SSR、RGA、SCAR標記構(gòu)建了‘Regent’בLemberger’的圖譜,并在LG4和LG18上定位了Rpv3和Rpv4兩個位點;隨著研究的不斷深入,Rpv5-Rpv31也被定位在5、7等多個不同的連鎖群上[45-56]。2008年,Hoffmann等[31]利用SSR標記構(gòu)建遺傳圖譜,并將Ren1抗性位點定位于‘Nimrang’的LG13上的VMC9H4-2、VMCNG4E10-1和UDV-020附近;隨后,研究人員在2、9、12、14、15、18和19號染色體上定位了其余10個白粉病(Ren2—Ren10,Run1、Run2)抗性相關(guān)位點[21,32];此外,Barba等[40]對沙地葡萄(Vitisrupestris)B38בChardonnay’進行遺傳作圖,鑒定了位于‘Chardonnay’上的1個易感白粉病的基因座(Sen1),是第1個有關(guān)葡萄易感白粉病基因的研究。Zhang等[27]通過構(gòu)建V3125和‘B?rner’的遺傳圖譜,發(fā)現(xiàn)在連鎖群13上有1個葡萄根瘤蚜(phylloxera)Rdv1的抗性相關(guān)位點;此外,在小葉葡萄(V.cinerea)、MN1264等抗性材料上還發(fā)現(xiàn)了Rdv2-8的QTL位點,為MAS在葡萄砧木育種的發(fā)展開辟了道路[18,28-29]。對皮爾斯病(Pierce’s disease)的研究較少,僅發(fā)現(xiàn)了1個位于LG14與VMCNg3h8等3個標記位點連鎖的Pdr1位點[42];另外,Kuczmog等[26]也發(fā)現(xiàn)了1個與冠癭病(crown gall)抗性相關(guān)位點Rgc1位于LG15;Rubio等[29]和Xu等[57]發(fā)現(xiàn)了4個葡萄劍線蟲病(nematoda)相關(guān)基因(XiR1—XiR4)位點,分別位于LG9、LG10、LG18、LG19上;Rex等[41]定位了2個葡萄黑腐病(black rot)抗性位點Rgb1和Rgb2,分別位于LG14和LG16;還有1個根結(jié)線蟲(root-knot nematodes)抗性位點MjR1,位于LG18[18];Fu等[58]在自育品種‘雙紅’中發(fā)現(xiàn)了抗炭疽病(anthracnose)基因位點Cgr1,將其與np19345的SNP標記進行了密切連鎖。

表1 葡萄遺傳育種相關(guān)性狀基因位點

續(xù)表1 Table 1 continued

在葡萄果實品質(zhì)方面,無核性狀受到了廣泛關(guān)注。同時,種子的有無也對葡萄漿果大小、質(zhì)量產(chǎn)生了影響。目前,共定位了3個與果實大小相關(guān)的性狀位點,其中無核性狀主要由Sd1和VvAGL11控制,這 2個基因位于LG18上;無肉漿果性狀由LG18上的Flb基因控制[59]。通過SSR等標記共識別了3類與葡萄香氣相關(guān)的基因位點,異丁基甲氧基吡嗪(IBMP)基因位于LG3;3種單萜類化合物(芳樟醇、橙花醇和香葉醇)的QTL定位于LG5上;在LG13上發(fā)現(xiàn)了橙花醇和香葉醇的QTL位點,LG2和LG10上存在芳樟醇QTL相關(guān)位點,其中LG10為主效基因位點[67-68,71-72]。在‘Ruby Seedless’בSultanina’和‘Muscat Hamburg’בSugraone’2個群體中定位了果實硬度相關(guān)基因[23]。此外,Chen等[69]還定位了2個與糖、酸相關(guān)的性狀位點,分別位于LG1與LG6,同時Yang等[70]通過基因分型測序技術(shù)(GBS)也在LG6上定位了1個與蘋果酸相關(guān)的QTL位點。

Costantini等[73]和 Zyprian等[36]分別在不同的遺傳背景下鑒定了與轉(zhuǎn)色期相關(guān)的QTL,分別位于LG16和LG18上。在LG17和LG18上分別鑒定了2個與成熟期相關(guān)的QTL位點[36,66]。

2.3 色澤性狀相關(guān)的Myb基因定位及其在分子標記輔助育種(MAS)中的應(yīng)用

花青苷能夠決定葡萄色澤,它的生物合成需要一系列的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子共同作用。其中,著色有無是由寡基因控制的質(zhì)量性狀,而著色深淺則是由多基因控制的數(shù)量性狀。目前發(fā)現(xiàn)果皮顏色主要與花青苷合成通路中的3-O-類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UFGT)、類黃酮5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(5-GT)、苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、查爾酮合酶基因(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶基因(F3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶基因(DFR)、無色花青素雙加氧酶基因(LDOX)這7個基因相關(guān)。Kobayashi等[74]研究發(fā)現(xiàn),UFGT是花青素合成的關(guān)鍵基因,其只能在具有花青素的漿果表皮中檢測到。5-GT能夠催化UDP葡萄糖,使花色素苷化生成花色苷,在某些葡萄品種中,被短截的5-GT可能是造成3,5-O-二糖苷缺乏從而使葡萄果皮表現(xiàn)為無色的原因[63]。

花色苷生物合成除了與上述7個基因相關(guān)外還受2號染色體上Myb相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如VlmybA1-1、VlmybA1-2和VlmybA2(歐美種‘巨峰’),這些轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控花色苷生物合成的關(guān)鍵基因UFGT[74]。在許多歐亞種葡萄中發(fā)現(xiàn)了VlmybA1-1的同源物VvmybA1(VvMybA1a、VvMybA1b、VvMybA1c和VlMybA1-3)。經(jīng)過對‘Pinot Blanc’‘Roditis’等不同葡萄群體的研究發(fā)現(xiàn),如VvmybA1位點上的插入、缺失會導(dǎo)致漿果顏色的變化,該位點是花青苷生物合成中的主效基因,其序列變異能夠解釋研究群體中95%以上的漿果顏色變化[75]。此外,還發(fā)現(xiàn)了與VvmybA1序列相似的VvMybA2基因(VvMybA2r、VvMybA2w和VlMybA1-2),二者構(gòu)成1個基因簇,共同調(diào)節(jié)花色苷的生物合成[76]。

Myb轉(zhuǎn)錄因子的活性與Myb基因位點上的基因類型及其組成的單倍型相關(guān),目前已發(fā)現(xiàn)了9種Myb單倍型組合[77]。本實驗室利用成熟的技術(shù)對213個重要葡萄品種的VvMybA1和VvMybA2位點及其特征性DNA片段的序列進行了研究分析,鑒定其單倍型組合,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Myb位點基因型與果皮著色存在不吻合的情況,如單倍型HapA(無色)的葡萄品種中有‘Brazil’(紫紅色)、‘Purple Damascus’(紫紅色)和‘Fuefuki’(粉紅色);HapAB、HapAC-Rs等有色單倍型中也有‘Khoussaine Khelim Barmak’‘驢奶’‘馬奶’‘早金香’等呈黃綠色的品種[64]。此外,葡萄果皮中類黃酮的生物合成也受到溫度和光照的調(diào)控,高溫或黑暗處理會嚴重抑制花色苷積聚[78]。因此,還需進一步對影響花色苷生物合成的基因及轉(zhuǎn)錄因子進行研究。

由于Myb基因位點是由多基因控制的數(shù)量性狀,其育種程序較為復(fù)雜。前人根據(jù)雜交F1代群體果皮色澤分離的規(guī)律分別提出了該性狀的“單基因模型”和“雙基因模型”理論,能夠解釋在不同有色親本組合雜交時,其后代在果皮色澤上出現(xiàn)有色群體∶無色群體=1∶0或3∶1的分離現(xiàn)象。我們可以通過檢測備選雜交親本著色相關(guān)Myb的單倍型預(yù)判后代群體中果實有色與無色單株的比例,借此開展葡萄分子輔助育種,并按照色澤性狀的要求選擇雜交親本,而獲得高比例滿足育種目標需求的色澤性狀的群體。同時還可以利用Myb單倍型的鑒定對雜交后代群體進行色澤性狀的早期鑒定與目標單株的篩選。因此,我們提出了“基于色澤性狀的葡萄多性狀分子設(shè)計育種技術(shù)”,該技術(shù)可實現(xiàn)高效、準確、定向聚合更多性狀的優(yōu)異位點,可以更好地根據(jù)育種目標性狀的要求選擇優(yōu)勢親本組合并對后代單株進行精準判斷[77]。同時,我們也提出在選擇育種親本時,同時考慮包括色澤性狀在內(nèi)的全部育種目標性狀的基因定位信息,開展分子定向設(shè)計育種的措施。

3 葡萄其他重要基因定位在MAS中的應(yīng)用

DNA分子標記和重要的農(nóng)藝性狀基因有緊密的聯(lián)系,因此可以作為MAS的分子工具。與傳統(tǒng)的植物育種方法相比,MAS是一種更有效、可靠、經(jīng)濟的育種方法,該方法可以通過對雜交前的親本選擇和子代的早期鑒定加速新品種的培育[79]。

目前MAS在葡萄育種中的應(yīng)用主要集中在無核葡萄后代選擇上。如傳統(tǒng)葡萄育種中,無核葡萄的鑒定只能通過結(jié)果后種子的有無進行判斷,耗時長而且效率低,而利用MAS技術(shù)可以實現(xiàn)在幼苗期對目標性狀的鑒定,極大地縮短了品種選育的時間。目前已獲得可用于無核性狀檢測的分子標記有SSC8、SCF27、VMC6f11、VMC7f2和p3-VvAGL11,其中使用較廣的為SCF27標記,Li等[80]對5個雜交組合中的354個胚珠進行了測試。李志瑛等[81]也利用無核標記GLSP-569和SCF27-2000對‘昆香無核’‘紅寶石無核’等4個雜交組合的326個雜交后代進行了早期鑒定。趙偉等[82]利用田間自然鑒定結(jié)果與分子標記輔助育種技術(shù)相結(jié)合的方法,篩選出可用于鑒定‘秋紅寶’‘早黑寶’‘河津-1’和‘北冰紅’等品種的分子標記OPW02和SCO11,為葡萄白粉病育種和苗期鑒定提供了理論基礎(chǔ)。

4 前景與展望

培育具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的葡萄新品種是促進我國葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵之一。目前已在玉米、小麥、大豆等大田作物和葡萄、中藥、茶樹等園藝作物中開展了大量DNA分子標記相關(guān)研究,建立了物理遺傳圖譜,鑒定了許多與抗病、品質(zhì)等重要性狀相關(guān)的分子標記,并通過對定位群體的分析,將重要農(nóng)藝性狀的基因或QTL定位到染色體或遺傳連鎖群上。但是其中僅有很少一部分標記能夠被應(yīng)用在MAS中,可能是由于現(xiàn)存的DNA分子標記普遍依賴于SSR標記系統(tǒng),使得QTL定位受到特定雜交群體的限制。此外,實際應(yīng)用時還需要考慮目標性狀基因及其與標記間遺傳距離、遺傳背景和基因型數(shù)目、QTL之間具有相互作用等重要因素。因此,MAS僅能篩選已知的QTL,由此育成的新品種也相對較少。

隨著三代測序技術(shù)的日漸成熟,獲得全基因組范圍內(nèi)高密度SNP的成本已大幅度降低,我們能夠獲得更加完整的葡萄遺傳變異信息,能夠提高MAS的效率并將其推廣到更多重要性狀基因的育種工作中去。同時,利用GWAS技術(shù)能夠不依靠雜交群體,在數(shù)量龐大的自然群體當中對葡萄的重要性狀位點進行更加快速地鑒定和精確定位,找到能夠在絕大多數(shù)品種中通用的DNA分子標記。利用GWAS得到的性狀對應(yīng)的每個位點的估計育種值(estimated breeding value,EBV),及全基因組育種值(genomic estimated breeding value,GEBV)進行親本的選擇與優(yōu)異后代的選育。同時,綜合表型性狀與顯著性SNP位點,建立基因調(diào)控性狀的網(wǎng)絡(luò),進一步分析顯著性SNP的多效性,構(gòu)建性狀間耦合的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò),探究葡萄性狀連鎖的現(xiàn)象及其遺傳機制。

通過利用最新的測序技術(shù),我們能夠構(gòu)建更加精密的遺傳圖譜,對上述性狀基因的主效QTL進行挖掘,開發(fā)與其緊密連鎖的分子標記。同時,許多尚未被研究的重要性狀相關(guān)位點也能夠得到解析,如在中國南方雨季多發(fā)的黑痘病、灰霉病和北方冬季易發(fā)生的凍害等各種病害。在未來的葡萄育種工作中,高密度遺傳圖譜和基因精細定位能夠進一步助推我國葡萄新品種的選育與育種技術(shù)水平的快速提高。