何 靈，那皮沙·居熱提，劉祥冉，白 杰

旋毛蟲是一種可引起人獸共患病的組織線蟲，是最大的細(xì)胞內(nèi)寄生線蟲[1]。旋毛蟲病的臨床癥狀復(fù)雜多樣，表現(xiàn)為：惡心、嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等，病原診斷比較困難。宿主被感染的過程中蟲體可產(chǎn)生各類抗原，其中排泄分泌(Excretory-secretory，ES)抗原，直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要靶抗原[2]。而簇細(xì)胞作為一種占比較小的腸上皮細(xì)胞，在識別和響應(yīng)寄生蟲感染的過程中起著重要作用[3]。研究表明簇細(xì)胞能接收寄生蟲感染信號，并釋放細(xì)胞因子 IL-25 觸發(fā) II 型天然免疫反應(yīng)，最終促進(jìn)寄生蟲驅(qū)逐出體內(nèi)，將不利于寄生蟲感染。

本實(shí)驗(yàn)通過旋毛蟲肌幼蟲 ES 抗原作用于健康小鼠小腸，觀察IL-25對旋毛蟲ES抗原刺激小鼠小腸一些相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。應(yīng)用HE染色觀察小鼠小腸病理變化，阿爾新藍(lán)-核固紅染色觀察小鼠小腸杯狀細(xì)胞表達(dá)情況以及用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測小腸組織勻漿中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33的含量變化。探究旋毛蟲與宿主天然免疫系統(tǒng)相互作用的機(jī)制，為臨床旋毛蟲病的防治和了解旋毛蟲對宿主的感染機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 蟲種 本研究中所用的旋毛蟲從黑龍江省動物源性人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所獲得[4]，保種在昆明小鼠體內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠，體重為18～22 g，共30只。均由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2016-0003，使用許可證：SYXK(新)2016-0002。

1.3 主要試劑和儀器 小鼠IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33檢測試劑盒均購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自索萊寶公司。切片機(jī)(德國徠卡公司)，包埋機(jī)(常州中威電子儀器有限公司)，組織脫水機(jī)(武漢天之瑞醫(yī)療科技有限公司)，攤片烤片機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.4 旋毛蟲ES抗原的制備[5]取本實(shí)驗(yàn)室保種的旋毛蟲小鼠，經(jīng)口感染400條肌幼蟲的昆明小鼠，45 d后剖殺，經(jīng)人工胃液消化法獲得旋毛蟲肌幼蟲，貝爾曼氏裝置收集肌幼蟲。收集的蟲體用含雙抗的滅菌生理鹽水清洗 5 次，加入到 1640 培養(yǎng)基中，密度為 5 000條/mL，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng) 48 h。收集培養(yǎng)液離心后將上清液裝入透析袋中透析，然后用 PEG 20000 濃縮，所得 ES 抗原經(jīng) 0.22 μm 濾器過濾后應(yīng)用 SDS-PAGE 進(jìn)行檢測，并測定蛋白含量，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動物實(shí)驗(yàn)分組[6]及取材 30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：空白對照組、旋毛蟲排泄-分泌(ES)抗原刺激組與IL-25阻斷組。空白對照組小鼠腹腔注射PBS；ES抗原刺激組小鼠腹腔注射旋毛蟲ES抗原；IL-25阻斷組小鼠腹腔注射抗鼠的IL-25單克隆抗體，3 d后，給予腹腔注射旋毛蟲ES抗原，每天1次，連續(xù)7 d。各組小鼠于末次注射后禁食12 h(自由飲水)后處死小鼠，沿腹中線切開，暴露小鼠小腸，取小腸清洗，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分凍存于-80 ℃。

1.6 HE染色及阿爾新藍(lán)-核固紅染色[7]觀察 分離小腸，采集標(biāo)本，取約2 cm的小腸組織，4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水，包埋切片后，分別進(jìn)行 HE 染色和阿爾新藍(lán)-核固紅染色，在顯微鏡下觀察小腸組織變化情況。

1.7 ES抗原對小鼠小腸組織勻漿細(xì)胞因子的影響 取小鼠小腸凍存組織1 g左右，用液氮研磨，再低溫3 000 r/min、10 min離心，取上清分裝凍存于-20 ℃冰箱。按試劑盒要求檢測小腸組織中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33含量。

2 結(jié) 果

2.1 旋毛蟲ES抗原的制備 將收集的肌幼蟲在1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲取旋毛蟲 ES 抗原，所得培養(yǎng)液經(jīng)透析、濃縮、過濾并測定蛋白含量后，應(yīng)用SDS-PAGE 檢測 ES 抗原的制備和收集情況，結(jié)果顯示目的蛋白條帶主要位于35～53 kD (圖1)，表明制備的 ES 抗原質(zhì)量較好。

注：M為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為ES抗原。圖1 旋毛蟲ES抗原的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of ES antigen

2.2 小鼠小腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果 顯微鏡下觀察，對照組小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)清晰正常，小腸絨毛無腫脹排列整齊；與空白對照組相比，ES抗原刺激組小腸絨毛出現(xiàn)明顯水腫現(xiàn)象，固有層水腫較輕；與空白對照組比較，IL-25阻斷組小腸絨毛有輕微的水腫現(xiàn)象，排列較整齊(圖2)。

注：A為空白對照組；B為ES抗原刺激組；C為IL-25阻斷組。圖2 小鼠小腸HE染色(HE，×200)Fig.2 HE staining of mouse small intestine (HE,×200)

2.3 旋毛蟲ES抗原刺激小腸杯狀細(xì)胞的變化 小鼠小腸經(jīng)阿爾新藍(lán)染色顯微鏡下觀察，與空白對照組相比，ES抗原刺激組中酸性粘液較多，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，且細(xì)胞體積變大；與ES抗原刺激組相比，IL-25阻斷組中酸性粘液較少，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，且細(xì)胞體積相對變小(圖3、圖4)。

注：A為空白對照組；B為ES抗原刺激組；C為IL-25阻斷組。圖3 小鼠小腸阿爾新藍(lán)-核固紅染色，小腸杯狀細(xì)胞呈藍(lán)色(×400)Fig.3 Mouse small intestine Alcian blue-nuclear fast red staining;small intestinal goblet cells are blue (×400)

注：A為各組小鼠小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的對比；B為各組小鼠小腸杯狀細(xì)胞肥大的量化。①與空白對照組比較，P<0.05；②與ES抗原刺激組相比，P<0.05。圖4 各組小鼠小腸杯狀細(xì)胞表達(dá)情況Fig.4 Expression of goblet cells in the small intestine in mice in each group

2.4 ES抗原對小鼠小腸組織細(xì)胞因子水平的影響 與空白對照組比較，ES抗原刺激組小鼠小腸組織勻漿IL-25(t=4.675，P<0.05)、IL-13(t=5.392，P<0.05)、IL-4(t=4.275，P<0.05)、IL-5(t=4.675，P<0.05)、IL-33(t=4.644，P<0.05)含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與ES抗原刺激組比較，IL-25阻斷組小鼠小腸組織IL-25(t=2.821，P<0.05)、IL-13(t=2.344，P<0.05)、IL-4(t=2.647，P<0.05)、IL-5(t=3.268，P<0.05)、IL-33(t=2.780，P<0.05)含量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5和表1。

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與ES抗原刺激組相比，P<0.05。圖5 各組小鼠小腸組織細(xì)胞因子含量表達(dá)情況Fig.5 Expression of cytokines in the small intestine tissue in each group of mice

表1 ES抗原對小鼠小腸組織細(xì)胞因子的影響Tab.1 Effects of ES antigen on cytokines in mouse small intestine tissue 單位：pg/mL

3 討 論

旋毛蟲在宿主體內(nèi)的不同發(fā)育時期，均可以通過ES抗原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用[8]。由于肌幼蟲期是旋毛蟲主要的致病時期，并且肌幼蟲排泄分泌抗原較易制備，因此本實(shí)驗(yàn)選擇旋毛蟲肌幼蟲 ES 抗原來探究IL-25對旋毛蟲ES抗原刺激宿主小腸的影響。

2型固有淋巴細(xì)胞(group 2 innate lymphoid cell，ILC2s)是一類不表達(dá)普通譜系標(biāo)記物的表面標(biāo)記物并分泌2型細(xì)胞因子(包括IL-4,IL-5和IL-13)的天然淋巴細(xì)胞[9]。本實(shí)驗(yàn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測小鼠小腸組織勻漿中的IL-4、IL-5和IL-13，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，用旋毛蟲ES抗原刺激組中IL-4、IL-5和IL-13含量升高，說明在旋毛蟲ES抗原刺激小鼠小腸中可能激活了部分ILC2。其實(shí)ILC2 作為固有免疫細(xì)胞的一員，激活后在腸道免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，通過表達(dá)IL-5來調(diào)節(jié)其他免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮功能，如嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[10]，還可產(chǎn)生IL-13來刺激杯狀細(xì)胞分泌粘液，有助于宿主腸道排出寄生蟲，防止腸道被寄生蟲感染。

ILC2s作為2型淋巴反應(yīng)的重要參與細(xì)胞，其與簇細(xì)胞之間的信號通路調(diào)節(jié)在寄生蟲腸道感染中備受關(guān)注。例如，Christoph等人發(fā)現(xiàn)巴西日圓線蟲和螺旋線蟲感染后均能觸發(fā)腸道中II型天然免疫反應(yīng)：簇細(xì)胞被寄生蟲信號激活，釋放IL-25，作用到ILC2上，使得ILC2細(xì)胞數(shù)量增加并且釋放IL-13，IL-13作用于干細(xì)胞，促使其分化成更多的簇細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，從而使免疫反應(yīng)逐級增強(qiáng)，最終達(dá)到清除寄生蟲的目的[11]。本實(shí)驗(yàn)用旋毛蟲ES抗原刺激小鼠小腸，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠小腸中IL-25和IL-13的含量升高，提示旋毛蟲ES抗原可能激活簇狀細(xì)胞上旋毛蟲的信號源，從而使其釋放IL-25和IL-13。而且，我們用阿爾新藍(lán)-核固紅染色觀察到經(jīng)旋毛蟲ES抗原刺激的小鼠小腸切片，酸性粘液較多，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞體積變大；當(dāng)IL-25阻斷組的小鼠小腸杯狀細(xì)胞無明顯變化，說明抑制IL-25可能會抑制ILC2，導(dǎo)致IL-25和IL-13的含量相對較低。

IL-33是一種組織來源的核細(xì)胞因子，在過敏和蠕蟲感染時可促進(jìn)2型免疫反應(yīng)。暴露于遷徙的寄生線蟲或鼻腔內(nèi)應(yīng)用甲殼素(寄生蟲表皮的主要物質(zhì))，會觸發(fā)腸道中IL-33的轉(zhuǎn)錄或釋放[12]。研究表明，缺乏IL-33或IL-33受體ST2的小鼠在松材線蟲(Strongyloidesvenezuelensis)、巴西日圓線蟲(Nippostrongylusbrasiliensis)和多形螺旋線蟲(Heligmosomoidespolygyrus)中表現(xiàn)出更高的腸道寄生蟲負(fù)荷，從而確立了IL-33在宿主防御中的中心作用。在任何擾動情況下，ILC2的激活都會響應(yīng)從環(huán)境組織中釋放的特定細(xì)胞因子，ILC2對細(xì)胞因子IL-25和IL-33作出反應(yīng)[13]。有研究表明IL-33誘導(dǎo)ILC2中的GATA3受體，再表達(dá)IL-5和IL-13刺激Th2的相關(guān)免疫。本實(shí)驗(yàn)研究的旋毛蟲ES抗原刺激的小鼠小腸組織中IL-33表達(dá)含量較高，說明旋毛蟲ES抗原刺激小鼠小腸可能會作用于ILC2中，從而誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子和酸性粘液增加，使旋毛蟲排出宿主腸道組織。本實(shí)驗(yàn)中ES抗原刺激組、IL-25阻斷組數(shù)據(jù)顯示，IL-25可影響小腸組織中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33含量，提示旋毛蟲ES抗原可能激活簇狀細(xì)胞，從而釋放IL-25作用到ILC2細(xì)胞，分泌IL-13和酸性粘液及杯狀細(xì)胞，產(chǎn)生免疫反應(yīng)達(dá)到寄生蟲排除宿主體內(nèi)的目的。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)旋毛蟲ES抗原刺激小鼠小腸黏膜可能經(jīng)IL-25/ILC2途徑產(chǎn)生免疫作用，從而促使旋毛蟲排出宿主體內(nèi)。這可能與小腸組織中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33含量升高和小腸杯狀細(xì)胞的增加有關(guān)。