毛劍鋒，張傳領(lǐng)，楚 旭

殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)是一種雙組分成孔毒素，能導(dǎo)致白細(xì)胞溶解和組織壞死[1-2]，常與嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌皮膚軟組織感染和壞死性肺炎相關(guān)[3]。PVL編碼基因(包括LukS-PV和LukF-PV)內(nèi)部會(huì)發(fā)生變異，由于其527位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性(A→G)導(dǎo)致176位的組氨酸(His176)被精氨酸(Arg176)所取代，根據(jù)這種氨基酸不同可將PVL分為H和R變異型[4]。除527位核苷酸變異外，其他位點(diǎn)變異情況也多有報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)至少22個(gè)核苷酸位點(diǎn)的突變[5-6]。

盡管PVL對(duì)金黃色葡萄球菌疾病嚴(yán)重程度的作用已被公認(rèn)[13]，但PVL亞型對(duì)蛋白質(zhì)毒性和疾病結(jié)局的影響仍不清楚。分子模型研究表明，R亞型可能改變PVL編碼基因孔隙的形成，增加PVL的白細(xì)胞毒性[4]。更重要的是毒力相關(guān)基因突變除了增加細(xì)菌的分子多樣性外，還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的獲得或喪失。由于PVL在金黃色葡萄球菌疾病轉(zhuǎn)歸中的重要性[7]，了解PVL基因的結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)于理解金黃色葡萄球菌的致病性和改進(jìn)特異性治療藥物的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)至關(guān)重要。因此，本研究旨在確定本地區(qū)臨床分離的金黃色葡萄球菌PVL基因亞型的分布，并了解其分子特性。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 287株MRSA來(lái)自于我院各臨床科室送檢的血液、尿液、痰液、膿液、傷口分泌物、耳道分泌物、無(wú)菌體液等標(biāo)本，已剔除同一患者相同部位來(lái)源菌株。所有菌株經(jīng)VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的方法，采用頭孢西丁紙片法，若抑菌圈直徑≤21 mm初步判斷為MRSA，再以PCR擴(kuò)增mecA基因進(jìn)行分子確認(rèn)，引物序列參照文獻(xiàn)[8]。上述菌株保存于30%甘油肉湯，-70 ℃冰箱備用。ATCC 49775(陽(yáng)性質(zhì)控)和MRSA N315(陰性質(zhì)控)為上海市第一人民醫(yī)院劉慶中博士饋贈(zèng)。

1.2 主要儀器和試劑 VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀為法國(guó)Bio-Merieux公司產(chǎn)品，EPS-100電泳儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品，GeneAmp PCR System 9600為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品(Applied Biosystems)，Lysostaphin為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，UV-3B紫外成像儀為珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，Premix Taq Version 2.0及DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序委托上海生物工程有限公司完成。

1.3 研究方法

1.3.1 感染類型判斷 按照美國(guó)CDC的CA-MRSA定義：患者在社區(qū)或入院48 h內(nèi)分離到MRSA菌株；1年內(nèi)無(wú)住院或與醫(yī)療機(jī)構(gòu)接觸史；沒(méi)有留置各種導(dǎo)管及其他穿刺皮膚的醫(yī)用裝置[9]，同時(shí)具有以上條件者可做出CA-MRSA感染的臨床診斷。根據(jù)此定義將臨床分離的MRSA菌株分為CA-MRSA和HA-MRSA。

1.3.2 MRSA基因組DNA制備 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(美國(guó) Axygen)提取MRSA菌株的基因組DNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度[10]。

1.3.3pvl基因檢測(cè)與序列分析 采用文獻(xiàn)報(bào)道的pvl基因PCR引物，上游引物序列：5′-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3′(luk-PV-1)，下游引物序列:5′-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC3′ (luk-PV-2)[11]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR總體積25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min (GeneAmp PCR System 9600,美國(guó)ABI)。采用溴化乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳、UV-3B紫外成像儀和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析PCR產(chǎn)物,目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為433 bp。經(jīng)上述檢測(cè)符合要求的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序,采用在線BLAST軟件分析測(cè)序結(jié)果并確定其基因型。

1.3.4pvl基因亞型確認(rèn) 根據(jù)Boakes等[5]方法，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，分別擴(kuò)增出3個(gè)片段(核苷酸長(zhǎng)度分別為654、718和680)。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果參照O’Hara等[4]方法判斷亞型。

1.3.5 CC克隆分型 參考Enright等[12]方法分型，PCR擴(kuò)增7個(gè)管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpiand、yqiL)，產(chǎn)物雙向測(cè)序，根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mlst.net)分析確定其類型(STs)；MLST克隆型別(MLST-CCs)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)eBURST (enhanced based upon related sequence types)程序進(jìn)行(http://eburst.mlst.net/)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分析相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析，兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1pvl+MRSA檢出率 287株MRSA中，51株為pvl+菌株(17.8%，51/287)，其中29株為CA-MRSA(56.9%，29/51)，22株為HA-MRSA(43.1%，22/51)。

2.2pvl亞型分型 對(duì)51株MRSA的pvl基因擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)位點(diǎn)(lukS序列的527和663位點(diǎn)，lukF序列的1 396和1 729位點(diǎn))存在核苷酸的變異(圖1)，核苷酸527位的突變導(dǎo)致176位的組氨酸(His)被精氨酸(Arg)取代，根據(jù)氨基酸的變化將pvl分為R和H亞型。除527位點(diǎn)發(fā)生變異外，再根據(jù)1 396和663位點(diǎn)是否發(fā)生變異細(xì)分為H1(GenBank：EF571669)和H2(GenBank：EF571668)；USA300屬于R亞型，根據(jù)1 729位點(diǎn)是否發(fā)生變異分為R1(GenBank：EF571829)和R2亞型(GenBank：EF571830)(表1)。本資料51株pvl+MRSA中，90.2% (46/51)的菌株屬于H亞型(6株H1、40株H2)，而R型僅占9.8% (5/51)(1株R1、4株R2)(圖1)。

圖1 51株臨床分離MRSA pvl基因序列變異分布Fig.1 Sequence variants of lukSF-PV observed in 51 MRSA clinical isolates

2.3 MLST分子分型 51株pvl+MRSA共分成11種STs，經(jīng)eBURST軟件分析11種STs型屬于7種CCs。最主要的流行株為CC59 (ST59/338)，占68.6%(35/51)，其次為CC22(ST22/217)(9.8%,5/51)、CC88(ST88)(5.9%,3/51)、CC5(ST25/149)、CC1(ST1/188)(5.9%,3/51)、CC9 (ST9)、CC30 (ST30)(2.0%,1/51)。46株H型菌株的主要克隆型為CC59，占69.6%(32/46)，其次為CC22和CC1，占10.9%和6.5%；5株R型菌株的主要克隆型為CC59，占60%(3/5)，其余為CC88和CC5(表2)。

表1 pvl基因亞型核苷酸位點(diǎn)突變及相關(guān)氨基酸的非同義替換Tab.1 Nucleotide site mutations of PVL gene subtypes and nonsynonymous substitution of related amino acids

2.4 MRSA感染類型 51株pvl+MRSA菌株中，29株CA獲得株 (56.9%，29/51)和22株HA獲得株 (43.1%，22/51);CA獲得株中H亞型25株 (86.2%,25/29)，R亞型4株 (13.8%,4/29)；HA獲得株中H亞型21株 (95.5%,21/22)，R亞型1株 (4.5%,1/22)，CA株和HA株攜帶的pvl均以H亞型為主，分別占86.2%(25/29)和95.5%(21/22)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.390，P>0.05)(表2)。

表2 pvl亞型的感染類型及CCs克隆型別Tab.2 Infection types of PVL subtypes and clonal types of CCS

3 討 論

自1932年P(guān)VL從金黃色葡萄球菌中首次分離以來(lái)，關(guān)于PVL的研究遍及全球。MRSA的pvl基因攜帶率在不同地區(qū)的報(bào)道有所差異[13-14]：阿富汗高達(dá)59.2%，加拿大亦有30.1%，而日本僅13.5%。我們的檢測(cè)結(jié)果顯示，本地區(qū)MRSA的pvl基因攜帶率為17.8%(51/287)，低于北京地區(qū)和福建地區(qū)的報(bào)道[15-16]，但明顯高于本省其他城市，如紹興地區(qū)為15.5%，溫州地區(qū)僅7.4%[17-18]。究其原因，可能與省會(huì)城市杭州人口密度高、旅游業(yè)發(fā)達(dá)帶來(lái)的人口流動(dòng)幅度大，環(huán)境衛(wèi)生易處于高污染水平有關(guān)。

pvl基因在金黃色葡萄球菌中的作用已明確[7]。然而，不同亞型對(duì)PVL毒性的影響尚不清楚。O’Hara FP等[4]提出176位核苷酸的非同義替換而導(dǎo)致的R亞型可能會(huì)增加PVL的白細(xì)胞毒性。而另外一些學(xué)者認(rèn)為，R和H亞型可能具有相同的誘導(dǎo)孔形成和白細(xì)胞毒性的能力[19]。近期，巴西學(xué)者[20]發(fā)現(xiàn)分離自新生兒血液的H2b亞型pvl+USA1100/ST30/CC30菌株表達(dá)的PVL毒素量是其他譜系的5倍，這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了進(jìn)一步研究PVL亞型的分布及其克隆譜系的重要性。目前，世界范圍內(nèi)已有PVL亞型分布的報(bào)道,不同地區(qū)的作者已經(jīng)證明了PVL之間的相關(guān)性亞型、金黃色葡萄球菌譜系及其在全球的地理分布[4-6]。一般來(lái)說(shuō)，R亞型主要與USA300有關(guān)，金黃色葡萄球菌譜系廣泛分布于美國(guó)[21]，而H亞型與來(lái)自亞洲等非美國(guó)地區(qū)的其他克隆型別的金黃色葡萄球菌有關(guān)，如CCs 1、5、6、22、25、30、59、88和121[4,6,19]。在來(lái)自四大洲的52株金黃色葡萄球菌CC30PVL分離株中分離出H1、H2/H2a、H2b、H2c、H2d、R1、R2和R3 PVL亞型。巴西學(xué)者[20]分析了39株金黃色葡萄球菌的四個(gè)不同克隆譜系(STs/CC1、5、8和30)中的LukSF-PVL基因，發(fā)現(xiàn)了一種新的H亞型并命名為H2e。然而，到目前為止，關(guān)于我國(guó)金黃色葡萄球菌PVL基因亞型的情況還少見報(bào)道。筆者首次在杭州地區(qū)收集pvl+MRSA進(jìn)行亞型分析，共發(fā)現(xiàn)有4個(gè)位點(diǎn)(lukS序列的527和663位點(diǎn)，lukF序列的1 396和1 729位點(diǎn))存在核苷酸變異，根據(jù)其中氨基酸的變化將pvl分為R和H亞型，再根據(jù)變異位點(diǎn)不同將亞型進(jìn)一步細(xì)分。研究結(jié)果顯示，51株pvl+MRSA中，90.2%(46/51)的菌株屬于H亞型，其中又以H2亞型為主(6株H1、40株H2)，而R亞型僅占9.8% (5/51)(1株R1、4株R2)，說(shuō)明本地區(qū)臨床分離MRSA攜帶的pvl基因以亞洲流行的H亞型(H2)為主。這一結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相似。

分子生物學(xué)分型對(duì)分析菌株的同源性和遺傳背景，明確暴發(fā)流行菌株的基因型并推斷擴(kuò)散趨勢(shì)具有十分重要的意義。在世界不同地區(qū)，攜帶pvl的優(yōu)勢(shì)克隆譜系有所不同[22]：亞洲以ST59(CC59)克隆為主，非洲以ST88(CC88)克隆為主，ST80(CC80)主要在歐洲流行，大洋洲常見ST30(CC30)克隆，ST22(CC22)克隆主要流行于印度，而美國(guó)以ST8(USA300)克隆為主。本資料顯示，pvl陽(yáng)性的克隆型別以ST59(CC59)為主(68.6%，35/51)，與亞洲流行型別克隆一致。并且由表2可見，無(wú)論是H亞型還是R亞型，其在pvl+MRSA的分離株均以CC59為主，分別占69.6%(32/46)和60.0%(3/5)。因本研究中R亞型的數(shù)量較少，而要明確pvl亞型分子型別的流行特征，有必要分離更多的菌株進(jìn)一步深入研究。

有研究認(rèn)為[23]，pvl基因是CA-MRSA的特征性分子，而在HA-MRSA中少見。但越來(lái)越多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，pvl+MRSA在社區(qū)感染患者和醫(yī)院感染患者中均有檢出[14，24]。本資料51株pvl+MRSA菌株中，29株為CA獲得株(56.9%，29/51)，22株為HA獲得株(43.1%，22/51)，提示CA-MRSA克隆已經(jīng)播散到醫(yī)院環(huán)境并引起醫(yī)院獲得性相關(guān)感染。然而，關(guān)于CA-MRSA和HA-MRSA兩者間pvl亞型分布差異的報(bào)道較少，我們的資料中，CA獲得株中H亞型25株 (86.2%,25/29)，HA獲得株中H亞型21株 (95.5%,21/22)，表明本地區(qū)CA-MRSA和HA-MRSA攜帶的pvl均以H亞型為主，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于金黃色葡萄球菌pvl基因的亞型分布還鮮有報(bào)道。本研究首次明確杭州地區(qū)臨床分離MRSA攜帶的pvl以H亞型(H2)為主，主要克隆型別為CC59，CA-MRSA和HA-MRSA攜帶的pvl亞型沒(méi)有明顯差異，這有助于更好地了解本地區(qū)pvl+金黃色葡萄球菌菌株的分子流行病學(xué)和進(jìn)化特征，為該類菌株的防控提供臨床數(shù)據(jù)。