劉慧婷，袁如意，陳獻(xiàn)雄，劉曉宇

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，越來(lái)越多的人遭受過(guò)敏性疾病的困擾。過(guò)敏性疾病發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，是重要的世界衛(wèi)生問(wèn)題。而塵螨是引起許多過(guò)敏性疾病的重要過(guò)敏原之一，現(xiàn)研究證明與塵螨過(guò)敏原相關(guān)的過(guò)敏性疾病有許多，如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎和過(guò)敏性皮炎等[1-3]。居室內(nèi)的優(yōu)勢(shì)螨類(lèi)主要有屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus,Derp)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarina,Derf)，研究表明屋塵螨在溫帶以及熱帶的沿海、濕潤(rùn)地區(qū)有較多的分布，是室內(nèi)塵螨過(guò)敏原中多種過(guò)敏原的主要來(lái)源[4]。目前臨床上治療過(guò)敏主要應(yīng)用過(guò)敏原特異性免疫治療(Allergen-specific immunotherapy,ASIT)，以改變疾病的進(jìn)程，然而ASIT制劑多是過(guò)敏原、非過(guò)敏原和其他蛋白質(zhì)的混合物，且大部分過(guò)敏患者對(duì)于不同塵螨過(guò)敏原呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，難以完全標(biāo)準(zhǔn)化，可能引起嚴(yán)重的副作用[5-6]。目前研究者致力于開(kāi)發(fā)重組過(guò)敏原，重組或純化的天然變應(yīng)原代替天然提取物，能有效還原原有的免疫原性，使得過(guò)敏治療更加安全有效[7-8]。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是一類(lèi)生物廣泛存在的解毒酶家族，其作用是催化谷胱甘肽(GSH)與多種親電子化合物的結(jié)合，保護(hù)生物大分子免受親電試劑的氧化破壞攻擊[9]。因其可能與宿主的免疫反應(yīng)以及寄生蟲(chóng)對(duì)藥物的耐藥性有關(guān)，已在許多寄生蟲(chóng)中進(jìn)行了研究[10-12]。此前已有研究克隆表達(dá)了與GSTs具有很大同源序列的過(guò)敏原Der p 8，并鑒定了它的過(guò)敏原性[10]，但國(guó)內(nèi)未見(jiàn)對(duì)GSTs基因及其蛋白特征的相關(guān)報(bào)道?？紤]到不同地域的過(guò)敏原之間可能存在差異性，有必要對(duì)其變化性和差異性進(jìn)行研究。因此，本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)對(duì)屋塵螨Der p 8蛋白的克隆、表達(dá)及純化，并鑒定重組蛋白的免疫原性，分析其同源性，為臨床上塵螨過(guò)敏性疾病的特異性診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 螨、載體和菌株 屋塵螨為本實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，表達(dá)載體為pET-32a，表達(dá)菌株為大腸埃希菌BL21(DE3)。

1.1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)材料 RNA提取試劑盒和核酸膠回收試劑盒(QIAGEN，奧格生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(生工生物工程股份有限公司)，質(zhì)粒DNA 提取試劑盒和 DNA 膠純化試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)；T載體、T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ(Takara，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；鎳離子親和層析柱，Mouse anti human IgE-HRP(美國(guó)Southem Biotech公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 血清 Western blotting所用血清取自廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科Der p IgE陽(yáng)性患者。

1.2 方 法

1.2.1 塵螨飼養(yǎng) 收集室內(nèi)塵樣本，根據(jù)屋塵螨形態(tài)學(xué)特征，顯微鏡下挑取雌雄各半的屋塵螨，放在裝有塵螨飼料的培養(yǎng)瓶中濕度(70±2)%、溫度(25±2)℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)3個(gè)月，再進(jìn)行收集純屋塵螨。

1.2.2 塵螨鑒定 稱(chēng)取1 g塵螨用液氮研磨，研磨好的粉末PBS溶解冰上搖2 h，8 000 r/min離心30 min。上清取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.3 設(shè)計(jì)引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Der p 8的核酸序列信息，利用GeneTool軟件設(shè)計(jì)合適引物，引物交由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 提取屋塵螨總RNA和RT-PCR擴(kuò)增 按照說(shuō)明書(shū)，將凍存的屋塵螨于液氮中研磨至粉狀后按RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)說(shuō)明書(shū)提取屋塵螨總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄引物，以提取出的總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min)，得到屋塵螨的cDNA。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及其克隆產(chǎn)物的鑒定 以合成的cDNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共 31 個(gè)循環(huán)，再以72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳鑒定，膠回收并連接至T載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(E.coliTop10)，涂板培養(yǎng)15 h，挑選合適的菌落37 ℃搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，取樣送至公司測(cè)序。

1.2.6 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和重組表達(dá)菌 將測(cè)序正確的菌液于37 ℃搖菌過(guò)夜培養(yǎng)(LB培養(yǎng)液)，提取質(zhì)粒用BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切，核酸電泳后膠回收。連接產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-32a得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(E.coliTop 10)中，培養(yǎng)后取樣重復(fù)測(cè)序一次，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.7 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Der p 8 鑒定正確后的序列轉(zhuǎn)入表達(dá)菌大腸埃希菌BL21(DE3)中，涂板培養(yǎng)，挑選合適的菌落接種于LB50 mL+AMP50 μL(LB∶AMP=1 000∶1)液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖(150 r/min)過(guò)夜培養(yǎng)。第2 d于新鮮液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(OD600=0.6～0.8)，應(yīng)用1 mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。4～5 h后離心棄上清，菌體用平衡液重懸。菌液冰上超聲破碎、4 ℃離心后，收集上清及沉淀，取部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以檢測(cè)Der p 8的表達(dá)情況。

1.2.8 親和層析法純化重組蛋白Der p 8 將收集到的沉淀于6 mol/L鹽酸胍中混勻，超聲破碎15 min，于4 ℃放置過(guò)夜，離心(10 000 r/min)20 min后棄沉淀取上清。將上清上樣至用平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl)預(yù)平衡好的鎳-氨三乙酸親和層析柱(Ni-NTA)上，上樣速度為2 mL/min。上樣后，用平衡緩沖液平衡10倍柱體積，然后分別用低濃度咪唑(40 mmol/L)和高濃度咪唑(300 mmol/L)的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)蛋白和目的蛋白Der p 8，取部分高濃度咪唑的洗脫液用于SDS-PAGE電泳。純化后的重組蛋白保存于-20 ℃冰箱。

1.2.9 Western blotting鑒定重組蛋白Der p 8免疫原性 SDS-PAGE電泳將純化后的Der p 8重組蛋白分離，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫下將膜于5% BSA+TBS中孵育2 h，以Der p IgE陽(yáng)性患者的血清作為一抗，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgE(Mouse anti human IgE-HRP)作為二抗孵育，TBST 將膜清洗5次后，加入化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，根據(jù)顯色結(jié)果鑒定Der p 8重組蛋白的免疫原性。

1.2.10 生物信息學(xué)分析Derp8基因 將本實(shí)驗(yàn)得到的Derp8基因(圖5)與NCBI中公布的Derp8序列進(jìn)行比對(duì)，比較兩者的同源性。

2 結(jié) 果

2.1 Der p 8重組表達(dá)載體的鑒定 將測(cè)序正確的Der p 8重組質(zhì)粒用BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切，進(jìn)行核酸電泳。結(jié)果顯示目的基因的分子量約為700 bp，與Der p 8 的cDNA片段大體一致，證明Der p 8重組表達(dá)載體成功構(gòu)建(圖1)。

注：M為DNA marker：1為PET-32a-Der p 8重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果。圖1 重組Der p 8質(zhì)粒酶切后瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 Identification of Der p 8 cDNA

2.2 Der p 8的大量表達(dá) 用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白Der p 8的表達(dá)，誘導(dǎo)前后Der p 8重組蛋白產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE電泳(圖2)。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的菌液中，在分子量約 38 kDa 處可見(jiàn)明顯的條帶，與 Der p 8預(yù)期分子量相近。根據(jù)誘導(dǎo)后的上清液和沉淀電泳結(jié)果，誘導(dǎo)后沉淀有較明顯條帶而上清未見(jiàn)明顯條帶，且樣品未做鹽酸胍溶解處理，因此可知Der p 8重組蛋白為包涵體。

注：M為蛋白marker；1為誘導(dǎo)前菌液；2為誘導(dǎo)后菌液；3為誘導(dǎo)后上清液；4為誘導(dǎo)后沉淀。圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間Der p 8基因產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of Der p 8 gene products

2.3 Der p 8重組蛋白的純化鑒定 用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白Der p 8的表達(dá)，經(jīng)親和層析法純化后，取部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示分子量約38 kD處可見(jiàn)一清晰蛋白條帶，而其余分子量處未見(jiàn)條帶，純化純度較高。該蛋白條帶的分子量與Der p 8重組蛋白預(yù)計(jì)分子量相符(圖3)。

注：M為蛋白marker；1為純化后的Der p 8蛋白。圖3 純化的Der p 8蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of purified Der p 8 protein

2.4 Der p 8重組蛋白的免疫原性鑒定 以Der p IgE陽(yáng)性患者血清為一抗，以Mouse anti human IgE-HRP為二抗進(jìn)行Western blotting。結(jié)果顯示在38 kD處可見(jiàn)一明顯條帶，提示Der p 8重組蛋白能與Der p IgE陽(yáng)性患者血清中IgE特異性結(jié)合，證明其具有免疫原性(圖4)。

注：M為蛋白marker；1為純化后的 Der p 8蛋白。圖4 Western blotting檢測(cè) Der p 8蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blotting detection of the expression of Der p 8 protein

2.5Derp8基因的同源性分析 將酶切鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒測(cè)序，得到的基因序列如圖5所示。將序列與NCBI基因庫(kù)中的塵螨Derp8基因序列(GenBank:S75286.1)進(jìn)行比對(duì)，兩者相似性為76.97%(圖6)。

2.6Derp8的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將得到的Derp8基因序列與NCBI基因庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，將相似序列以Fasta格式輸出，用MEGA 7.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)；分析可知，其基因序列與屋塵螨的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因序列最相近(Dermatophagoidespteronyssinus,GenBank:S75286.1)，推測(cè)其功能相似；此外，通過(guò)分子進(jìn)化樹(shù)可知，屋塵螨與粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae,KC305499.1)、綿羊癢螨(Psoroptesovis,GenBank:AF078684.2)的親緣關(guān)系較近(圖7)。

3 討 論

塵螨是引起多種過(guò)敏性疾病的重要過(guò)敏原之一，而屋塵螨在亞熱帶和熱帶國(guó)家具有重要臨床意義，哮喘或其他過(guò)敏患者對(duì)屋塵螨過(guò)敏原的致敏率可高達(dá)80%～90%[4]。因而對(duì)其重要變應(yīng)原成分的免疫學(xué)、分子生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，有助于臨床診療。目前臨床采用ASIT療法，通過(guò)反復(fù)給過(guò)敏患者注射特定的過(guò)敏原，形成對(duì)過(guò)敏原的免疫耐受，從而減少過(guò)敏原暴露后的癥狀[13]。隨著重組技術(shù)的發(fā)展，重組過(guò)敏原替代粗提取物進(jìn)行脫敏治療成為可能，如治療白楊花粉和草花粉過(guò)敏的重組低過(guò)敏原以及野生型重組過(guò)敏原[14-15]。此外，重組過(guò)敏原還廣泛應(yīng)用于基于分子的過(guò)敏診斷，如蛋白質(zhì)微陣列或懸浮陣列[16]。

塵螨過(guò)敏原重組疫苗的研究也取得了新的進(jìn)展。Chen等設(shè)計(jì)的Der p 1-Der p 2融合蛋白在動(dòng)物體內(nèi)能有效降低過(guò)敏原性，并誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG抗體，抑制1組和2組過(guò)敏原過(guò)敏患者的IgE活性[17]。Hesse等的研究顯示在小鼠體內(nèi)應(yīng)用純化的屋塵螨過(guò)敏原Der p 1和Der p 2進(jìn)行皮下免疫治療，在抑制Th2細(xì)胞和塵螨誘導(dǎo)的肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞激活相較粗塵螨提取物具有明顯的優(yōu)越性。這顯示純化后的塵螨過(guò)敏原有可能提高皮下免疫治療的臨床療效[18]。

圖5 Der p 8的cDNA序列Fig.5 cDNA sequence of Der p 8

圖6 Der p 8基因的同源性分析Fig.6 Homology analysis of the Der p 8 gene

圖7 Der p 8的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of Der p 8

O’Neill等的研究發(fā)現(xiàn)塵螨表達(dá)的與GSTs具有很大同源序列的過(guò)敏原Der p 8能與40%的塵螨過(guò)敏患者血清中特異性IgE結(jié)合，40%中有一半以上的反應(yīng)是正常對(duì)照組的10倍[19]。本實(shí)驗(yàn)克隆的Derp8序列與GenBank上的基因序列進(jìn)行比對(duì)，具有76.97%的同源性，表明國(guó)外所報(bào)道的屋塵螨過(guò)敏原Derp8基因序列與中國(guó)地區(qū)屋塵螨過(guò)敏原Derp8基因序列存在一定的地區(qū)差異性?；诓煌貐^(qū)變應(yīng)原的基因多樣性，建立高效表達(dá)重組過(guò)敏原Der p 8的表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行大量表達(dá)和純化，對(duì)研制純度較高的重組變應(yīng)原疫苗以及分子免疫診斷仍有一定意義。

本研究提取了屋塵螨總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后將其連接至表達(dá)載體PET-32a，經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序后，顯示所克隆序列為目的基因片段，導(dǎo)入到表達(dá)菌大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)表達(dá)及鎳柱親和層析法的純化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)的重組蛋白Der p 8成功地大量表達(dá)，Western blotting分析顯示重組蛋白Der p 8具有良好的免疫原性。隨著過(guò)敏性疾病發(fā)病率的上升，人們對(duì)其診斷和治療的需要程度也越來(lái)越高，因此過(guò)敏性疾病的特異性診斷和治療需要作出更多改變和突破。本實(shí)驗(yàn)所克隆的Der p 8重組蛋白經(jīng)檢驗(yàn)具有較強(qiáng)的免疫原性，一方面可應(yīng)用于塵螨過(guò)敏性疾病的特異性診斷，另一方面應(yīng)用于塵螨過(guò)敏的特異性免疫治療，為制作重組的過(guò)敏原疫苗奠定基礎(chǔ)。