李軍麗，趙愛(ài)華

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的以呼吸道為主的人獸共患傳染性疾病，可累及全身多個(gè)臟器，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1-2]。隨著醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，人類(lèi)在對(duì)抗TB方面已取得了一定的成果，包括有效的治療性藥物及預(yù)防性疫苗的研發(fā)。但由于耐多藥(Multidrug resistance，MDR)和廣泛耐藥(Extensive drug resistant，XDR)結(jié)核菌株的出現(xiàn)、人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)合并M.tb的雙重感染、高危人群流動(dòng)的日益增多、COVID-19全球大流行以及部分國(guó)家對(duì)TB的忽視等諸多因素，TB發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈回升趨勢(shì)[3-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計(jì)，2020年全球結(jié)核潛伏感染(Latent tuberculosis infection，LTBI)人群接近20億，新發(fā)TB患者987萬(wàn)例。我國(guó)2020年估算的TB新發(fā)患者數(shù)為84.2萬(wàn)例，較2019年的83.3萬(wàn)例略有回升，在30個(gè)TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家中我國(guó)估算TB發(fā)病人數(shù)排第2位，僅低于印度的259萬(wàn)例[5]。受COVID-19全球大流行的影響，TB診斷和治療服務(wù)受到中斷，致使全球HIV陰性人群的TB死亡人數(shù)由2019年的121萬(wàn)例上升至128萬(wàn)例，出現(xiàn)了自2005年以來(lái)TB死亡人數(shù)首次增加的現(xiàn)象[5]。TB不僅給患者本人的身心帶來(lái)極大的痛苦和危害，也給患者親友和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)和影響。

至今，卡介苗(BacilleCalmette-Guérin，BCG)仍是唯一被批準(zhǔn)使用以預(yù)防TB的疫苗[6]，雖然其可大大降低小兒粟粒性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎的發(fā)病率，但其保護(hù)力不穩(wěn)定，差異較大，對(duì)保護(hù)成年人免患肺結(jié)核(Pulmonary tuberculosis，PTB)的效率并不十分理想，且無(wú)法應(yīng)用于免疫缺陷患者[7-10]。究其原因可能與BCG菌株差異、感染M.tb菌株毒力的差異、M.tb的內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染、接種人群遺傳背景、免疫狀態(tài)與營(yíng)養(yǎng)水平以及臨床試驗(yàn)方法的差異性等有關(guān)。隨著疫苗學(xué)的迅速發(fā)展，新型TB疫苗已得到廣泛研究[11]，如進(jìn)入II和III期臨床的第1代減毒或重組活疫苗MTBVAC(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03536117)和VPM1002(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03152903)，進(jìn)入IIa和IIb期臨床的第2代亞單位疫苗ID93+GLA-SE(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02465216)和M72/AS01E(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT04556981)等，第3代腺病毒載體疫苗如Ad5 Ag85A(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02337270)及ChAdOx1 85A-MVA85A(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03681860)等也進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。同樣作為第3代疫苗的核酸疫苗以其多價(jià)、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)成為近年來(lái)TB疫苗研究的熱點(diǎn)之一，備受疫苗研究工作者的關(guān)注。因此，本文就TB DNA疫苗的免疫學(xué)機(jī)制、研究現(xiàn)狀、免疫增強(qiáng)策略、存在的問(wèn)題及應(yīng)用前景作一綜述，以期為T(mén)B DNA疫苗研究提供新的思路和視角。

1 TB DNA疫苗免疫學(xué)機(jī)制

自1990年Wolff JA等[12]首次報(bào)道小鼠經(jīng)肌肉直接注射純化的RNA或DNA重組表達(dá)載體可使其基因在局部肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)數(shù)月，甚至持續(xù)終生，且未出現(xiàn)外源核酸與宿主染色體整合等現(xiàn)象以來(lái)，核酸疫苗成為世界矚目的傳染病防治新工具，被稱(chēng)為疫苗學(xué)的“新紀(jì)元”。核酸疫苗又稱(chēng)基因疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗，其中DNA疫苗是指將能誘導(dǎo)機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原編碼基因和真核表達(dá)載體相連接，采用某種方法將重組DNA質(zhì)粒導(dǎo)入接種者機(jī)體，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯并合成目標(biāo)抗原蛋白。目標(biāo)抗原加工形成抗原多肽后與宿主細(xì)胞MHC I類(lèi)和MHC II類(lèi)分子結(jié)合并被呈遞給宿主免疫識(shí)別系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防或治療相應(yīng)疾病的目的[13-15]。針對(duì)TB DNA疫苗誘導(dǎo)的各種免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1型免疫應(yīng)答，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的Th2型免疫及IFN-γ反應(yīng)等[16]。目前，提出了TB DNA疫苗刺激宿主免疫系統(tǒng)的兩種主要機(jī)制：1)內(nèi)源性抗原誘導(dǎo)機(jī)制：即注射部位組織細(xì)胞(如肌細(xì)胞或上皮細(xì)胞等)、專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cells，APCs)或其他炎性細(xì)胞內(nèi)化重組質(zhì)粒DNA并在胞內(nèi)表達(dá)目標(biāo)抗原。內(nèi)源性目標(biāo)抗原經(jīng)抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(Transporter associated with antigen processing，TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)加工修飾成為具有免疫原性的抗原肽；抗原肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC I類(lèi)分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC I類(lèi)分子復(fù)合物；后者轉(zhuǎn)入高爾基體再通過(guò)分泌小泡將其運(yùn)至組織細(xì)胞或APCs表面，供相應(yīng)CD8+T細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合(圖1-①和1-②)。2)外源性抗原誘導(dǎo)機(jī)制：被分泌至胞外的目標(biāo)抗原經(jīng)注射部位APCs吞噬或吞胞飲后形成吞噬體，隨后與胞內(nèi)溶酶體融合形成吞噬溶酶體；外源性目標(biāo)抗原在吞噬溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境中被蛋白水解酶降解為小分子多肽；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC Ⅱ類(lèi)分子進(jìn)入高爾基體后，由分泌小泡攜帶，通過(guò)與吞噬溶酶體融合，使抗原肽與小泡內(nèi)MHC Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合形成抗原肽-MHC Ⅱ類(lèi)分子復(fù)合物；該復(fù)合物表達(dá)于APCs表面后被相應(yīng)CD4+T細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合。此外，部分外源性非胸腺依賴(lài)性抗原(Thymus-independent antigen，TI-Ag)可直接激活初始B細(xì)胞而無(wú)需輔助性T細(xì)胞的參與，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體形成體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗原特異性抗體(圖1-③)。

2 TB DNA疫苗研究現(xiàn)狀

隨著對(duì)M.tb致病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，TB DNA疫苗的研制不僅局限于針對(duì)未感染人群抗M.tb感染的預(yù)防，研發(fā)針對(duì)LTBI的疫苗，達(dá)到抑制、清除宿主體內(nèi)潛伏感染的細(xì)菌，防止TB復(fù)發(fā)也是其重要的目標(biāo)之一?；赥B亞單位疫苗研發(fā)中積累的大量經(jīng)驗(yàn)，已有超過(guò)60種M.tb抗原被確定為候選優(yōu)勢(shì)抗原，并在臨床前動(dòng)物模型中用作抗TB疫苗進(jìn)行研究。M.tb培養(yǎng)濾液蛋白10(Culture filtrate protein，10 kDa，CFP-10)、早期分泌6 kDa蛋白(Early secretory antigenic target，6 kDa，ESAT-6)、Ag85復(fù)合物及熱休克蛋白65(Heat shock protein 65，Hsp65)等被廣泛研究的抗M.tb保護(hù)性抗原同樣成為了TB DNA疫苗的候選目標(biāo)。針對(duì)這些優(yōu)勢(shì)候選抗原基因，研究者們進(jìn)行了大量的臨床前研究。目前，已有多種TB DNA疫苗在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了比較理想的效果。

注：①為注射部位肌細(xì)胞內(nèi)化重組DNA質(zhì)粒，表達(dá)目標(biāo)抗原蛋白(內(nèi)源性)并遞呈抗原肽以激活CD8+ T細(xì)胞。②為注射部位APCs內(nèi)化重組DNA質(zhì)粒，表達(dá)目標(biāo)抗原蛋白(內(nèi)源性)并遞呈抗原肽以激活CD8+ T細(xì)胞。③為被分泌的外源性目標(biāo)抗原蛋白直接激活B細(xì)胞或經(jīng)MHC II類(lèi)分子激活CD4+T細(xì)胞。圖1 TB DNA疫苗經(jīng)肌肉注射免疫后誘導(dǎo)機(jī)體形成免疫應(yīng)答的可能機(jī)制Fig.1 Mechanism of immune response induced by intramuscular immunization with TB DNA vaccine

2.1 CFP-10和ESAT-6 CFP-10和ESAT-6是BCG中丟失的RD1(region of difference，RD)區(qū)編碼的關(guān)鍵毒力蛋白分子，分別由Rv3874和Rv3875基因編碼。兩者以完全折疊的結(jié)構(gòu)按1∶1形成緊密的復(fù)合物，具有較好的抗原特異性和免疫活性[17-18]，其作為新型疫苗的候選抗原除用于TB預(yù)防外，亦可作為診斷用特異性抗原用于鑒別M.tb感染和BCG接種[19-20]。

1999年，Kamath AT等[21]就曾嘗試用M.tb分泌蛋白MPT64、Ag85B和ESAT-6作為候選基因制備DNA疫苗并在小鼠模型中測(cè)試其免疫原性和保護(hù)功效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗免疫后4周，小鼠IFN-γ CD4+T細(xì)胞活化增強(qiáng)，同時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生高滴度抗原特異性IgG抗體。這3種DNA載體均顯示出一定的保護(hù)作用，且其中Ag85B效果最佳，其他依次為ESAT-6和MPT64，但遺憾的是上述三種DNA疫苗均未達(dá)到用BCG免疫后形成的保護(hù)水平。國(guó)內(nèi)學(xué)者王雪梅等[22]構(gòu)建pVAX1/ESAT-6疫苗，并經(jīng)電轉(zhuǎn)染免疫小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠血清中抗ESAT-6特異性抗體IgG水平明顯升高，血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平及分泌IFN-γ淋巴細(xì)胞數(shù)明顯均高于空質(zhì)粒組和生理鹽水對(duì)照組。

除單獨(dú)采用包括ESAT-6在內(nèi)的M.tb蛋白基因構(gòu)建成TB DNA疫苗外，與細(xì)胞因子或其他蛋白因子構(gòu)建成多順?lè)醋覦NA質(zhì)粒也被廣泛研究。其中Maue AC及其團(tuán)隊(duì)[23]發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒編碼的GM-CSF和CD80/CD86新型ESAT-6:CFP10 DNA疫苗共同給藥可增強(qiáng)抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。與單獨(dú)ESAT-6 DNA疫苗接種相比，ESAT-6:CFP10+GM-CSF+CD80/CD86 DNA 疫苗接種動(dòng)物表現(xiàn)出外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)CD25表達(dá)上調(diào)，ESAT-6:CFP10特異性IFN-γ分泌細(xì)胞增加以及抗原特異性細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)等。同時(shí)，在一項(xiàng)低劑量毒性牛結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊試驗(yàn)中，出生時(shí)接種BCG或ESAT-6:CFP10+GM-CSF+CD80/CD86 DNA的小牛在感染后表現(xiàn)出肺和肺相關(guān)淋巴結(jié)的病變嚴(yán)重程度降低。此外，抗菌肽β-防御素-2與ESAT-6構(gòu)建的融合DNA疫苗pDE同樣顯示出與BCG相似的保護(hù)功效。pDE免疫小鼠對(duì)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株及高毒力臨床分離株LAM 5186的攻擊形成有效抵抗，感染后的小鼠存活率、肺細(xì)菌負(fù)荷和組織損傷均得到有效改善。而B(niǎo)CG初免，然后用pDE進(jìn)行加強(qiáng)的動(dòng)物則顯示出更高的存活率和更少的肺組織損傷[24]。國(guó)內(nèi)學(xué)者王慶敏等[25]評(píng)估了針對(duì)M.tb的泛素(UbGr)融合ESAT-6 DNA疫苗后發(fā)現(xiàn)，UbGR-ESAT-6融合DNA疫苗接種改善了抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，與非融合DNA疫苗相比，UbGR-ESAT-6融合DNA疫苗免疫的小鼠中，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IgG2a與IgGl相對(duì)比率以及增殖性T細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生顯著增強(qiáng)。同樣，Xu J等[26]構(gòu)建了一種編碼ESAT-6和樹(shù)突細(xì)胞生長(zhǎng)因子Flt3配體的重組DNA疫苗pIRES-ESAT-6-FL，該疫苗免疫的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的Th1型免疫反應(yīng)，伴隨著更高水平的脾臟淋巴細(xì)胞增殖，Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-2)以及血清特異性抗體的增加，較低水平Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)分泌等。隨后，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步構(gòu)建編碼ESAT-6 3個(gè)T細(xì)胞表位和Flt3配體的新型重組質(zhì)粒，并采用肌肉注射該DNA疫苗和鼻內(nèi)施用表位肽的策略來(lái)誘導(dǎo)小鼠更高的免疫反應(yīng)。最后得到了前期研究相一致的結(jié)果，而且還顯著增強(qiáng)了其對(duì)M.tb攻擊的保護(hù)作用[27]。

針對(duì)ESAT-6 DNA疫苗的治療作用，Lowrie等[28]曾報(bào)道，經(jīng)ESAT-6 DNA疫苗治療后，小鼠肺和脾臟中的M.tb荷菌量減少，T細(xì)胞譜向Th1型免疫應(yīng)答方向改變。Yuan W等[29]也同樣發(fā)現(xiàn)，小鼠接種由ESAT-6與Ag85B及HspX構(gòu)建的多順?lè)醋淤|(zhì)粒DNA疫苗pAEH后，其外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞比例，分泌ESAT-6、Ag85B和HspX特異性IFN-γ T細(xì)胞頻率上升，同時(shí)伴隨著體外IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生水平顯著增加。此外，被治療小鼠肺部和脾臟結(jié)核樣炎癥減輕，M.tb的復(fù)制被明顯抑制等。但值得注意的是吳雪瓊團(tuán)隊(duì)等則發(fā)現(xiàn)相比于單一Ag85A DNA疫苗，含有一個(gè)ESAT-6基因拷貝的Ag85A/ESAT-6嵌合DNA疫苗在MDR-TB感染小鼠中的免疫治療效果被降低[30]，而插入兩個(gè)ESAT-6基因拷貝的嵌合DNA疫苗，則進(jìn)一步加速M(fèi)DR-TB臨床分離株和藥物敏感株感染小鼠的死亡率速度[31]。這也與國(guó)外學(xué)者Dey B等[32]早期報(bào)道新型TB DNA疫苗DNAE-6加強(qiáng)針消除ESAT-6重組卡介苗(rBCG)對(duì)豚鼠抗M.tb感染的保護(hù)作用相一致。

2.2 Ag85復(fù)合物 Ag85復(fù)合物是M.tb主要的分泌性蛋白，可從早期培養(yǎng)物中分離，作為重要的毒力因子，其主要通過(guò)纖維連接蛋白和彈性蛋白結(jié)合并介導(dǎo)M.tb的黏附、侵襲及細(xì)胞壁的合成[33-35]。復(fù)合物由在氨基酸和基因水平上具有廣泛交叉反應(yīng)性和同源性的Ag85A、Ag85B和Ag85C 3個(gè)組分構(gòu)成，分別由fbpA(Rv3804c)、fbpB(Rvl886c)和fbpCl(Rv3803c)基因編碼[36]。Ag85分子能刺激Th1細(xì)胞活化并誘導(dǎo)其分泌TNF-α、IFN-γ等多種細(xì)胞因子，活動(dòng)性TB患者血清中也存在大量Ag85特異性抗體[37-38]。正由于這個(gè)特性，Ag85復(fù)合物在TB診斷和疫苗研發(fā)[39]、免疫治療[40]等方面有著重要的應(yīng)用潛力。

1996年，Huygen K及其團(tuán)隊(duì)[41]對(duì)編碼Ag85的DNA疫苗免疫原性進(jìn)行了評(píng)估，其發(fā)現(xiàn)這些構(gòu)建體能很好的誘導(dǎo)小鼠體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并在接下來(lái)的抗M.tb保護(hù)效果研究中發(fā)現(xiàn)Ag85C基因重組DNA疫苗效果不及Ag85A和Ag85B。隨后，D’Souza S等[42]也同樣證明，Ag85 DNA疫苗經(jīng)肌肉注射免疫C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)小鼠后，M.tb感染的C57BL/6小鼠對(duì)Ag85A和Ag85B來(lái)源的抗原肽反應(yīng)強(qiáng)烈，但對(duì)來(lái)自Ag85C的抗原肽沒(méi)有反應(yīng)；而M.tb感染的BALB/c小鼠僅對(duì)來(lái)自Ag85A的抗原肽反應(yīng)。

針對(duì)Ag85復(fù)合物DNA疫苗不同的免疫方案，Tanghe A等[43]用Ag85質(zhì)粒DNA、Ag85蛋白以及Ag85質(zhì)粒DNA初免-Ag85蛋白加強(qiáng)方案免疫C57BL/6小鼠后發(fā)現(xiàn)，相比于單獨(dú)的Ag85蛋白佐劑疫苗，DNA疫苗免疫誘導(dǎo)了更強(qiáng)大的Th1型細(xì)胞因子反應(yīng)，且Ag85質(zhì)粒DNA初免-Ag85蛋白加強(qiáng)免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-2和IFN-γ反應(yīng)增加了兩到四倍。上述3種免疫方案均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗Ag85抗體，但Ag85蛋白佐劑疫苗主要誘導(dǎo)IgG1，而Ag85質(zhì)粒DNA和DNA初免-蛋白質(zhì)加強(qiáng)疫苗接種則優(yōu)先誘導(dǎo)IgG2a抗體的分泌。同時(shí)，攻毒實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，外源性Ag85蛋白強(qiáng)化了Th1型CD4+輔助性T細(xì)胞在介導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答中的主導(dǎo)作用，加強(qiáng)了DNA疫苗對(duì)M.tb攻擊感染的保護(hù)功效。同樣，基于表達(dá)Ag85B和Rv3425抗原的DNA疫苗和慢病毒載體疫苗在增強(qiáng)BCG免疫效果和保護(hù)C57BL/6小鼠抗M.tb感染方面的研究中發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體和DNA疫苗極大地提高了BCG對(duì)M.tb的保護(hù)功效，表現(xiàn)為免疫小鼠體重下降變緩、肺部細(xì)菌負(fù)荷和組織學(xué)損傷顯著減輕等[44]。而在另一項(xiàng)以編碼堪薩斯分枝桿菌Ag85B蛋白的rBCG-Mkan85B初免，表達(dá)Ag85B基因的質(zhì)粒DNA(DNA-Mkan85B)進(jìn)行加強(qiáng)免疫的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，DNA-Mkan85B能顯著增強(qiáng)小鼠CD8+T細(xì)胞抗M.tb免疫應(yīng)答，并有助于克服當(dāng)前BCG在抗M.tb保護(hù)性免疫方面有限的有效性[45]。

與其他分枝桿菌或非分枝桿菌抗原結(jié)合構(gòu)建編碼Ag85A多順?lè)醋覦NA疫苗也逐漸被證明是預(yù)防TB的有效方法。Zhang X等[46]在研究Ag85A 共表達(dá)GM-CSF質(zhì)粒DNA疫苗中發(fā)現(xiàn)，GM-CSF單獨(dú)或組合共表達(dá)對(duì)BALB/c小鼠模型中CD4+和CD8+T細(xì)胞IFN-γ反應(yīng)、CTL細(xì)胞活性和M.tb攻擊的免疫保護(hù)作用顯著增強(qiáng)。IL-15融合表達(dá)構(gòu)建pcDNA3.1-Ag85A-IL-15質(zhì)粒肌內(nèi)免疫C57BL/6小鼠3次后，接種pcDNA3.1-Ag85A-IL-15的小鼠在肺中產(chǎn)生了更多的分泌性IgA (sIgA)，并獲得了對(duì)Ag85A增強(qiáng)的血清IgG反應(yīng)。免疫小鼠IgG2a/IgG1比率上調(diào)，自然殺傷細(xì)胞活性及Ag85A特異性脾臟T細(xì)胞增殖增強(qiáng)。CD4+T細(xì)胞向Th1型極化，并顯著上調(diào)血清中IFN-γ的水平[47]。Mir FA等[48]利用來(lái)自口蹄疫病毒的自裂解肽2A與Rv3407、Ag85A及HspX構(gòu)建新型TB DNA疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種V-2A疫苗的小鼠對(duì)所有3種抗原都產(chǎn)生了抗原特異性細(xì)胞和體液反應(yīng)，對(duì)M.tb氣溶膠攻擊的保護(hù)作用與BCG相當(dāng)。同樣，國(guó)內(nèi)學(xué)者Yao W等[49]將牛皰疹病毒1 VP22 (BVP22)編碼基因與Ag85B編碼基因整合到DNA載體中，并與單獨(dú)編碼Ag85B的質(zhì)粒DNA比較其在C57BL/6小鼠中的免疫反應(yīng)和保護(hù)功效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠免疫后，除了IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量增加外，共表達(dá)BVP22和Ag85B的DNA誘導(dǎo)的Ag85B特異性抗體和脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)也顯著高于僅接種編碼Ag85B的DNA免疫的小鼠。此外，根據(jù)肺和脾臟的組織病理學(xué)檢查和細(xì)菌載量測(cè)定，BVP22-Ag85B DNA免疫引起的對(duì)靜脈內(nèi)M.tb攻擊的保護(hù)超過(guò)了單獨(dú)由Ag85B DNA引起的反應(yīng)，且與BCG疫苗無(wú)顯著性差異。

2.3 熱休克蛋白65 Hsp65是Hsp家族中被研究最多、最有希望成為T(mén)B疫苗有效抗原的成員之一[50]。Hsp65蛋白細(xì)胞表位較多，結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于真核Hsp70蛋白，在基質(zhì)金屬肽酶9的水解下，產(chǎn)生大量可刺激宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答的免疫原性肽[51]。

早期研究表明，小鼠注射編碼M.tb單一抗原Hsp65的質(zhì)粒DNA后，機(jī)體被誘導(dǎo)產(chǎn)生特定的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，并對(duì)隨后的M.tb攻擊產(chǎn)生抵抗，其保護(hù)作用與BCG疫苗相當(dāng)，且顯著優(yōu)于Hsp65蛋白抗原的免疫效果[52]。國(guó)內(nèi)學(xué)者Dai W等[53]也發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)肌肉注射100 μg Hsp65或Hsp70 DNA疫苗后，其脾淋巴細(xì)胞增殖能力較生理鹽水對(duì)照組、空載體組顯著增強(qiáng)，腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO水平、血清IL-2和IFN-γ含量也顯著上升。Hsp70 DNA疫苗可明顯增強(qiáng)小鼠免疫應(yīng)答，但其強(qiáng)度似乎不如Hsp65 DNA疫苗。BALB/c和C57BL/6小鼠經(jīng)Hsp65和Hsp70 DNA疫苗初免，BCG加免后發(fā)現(xiàn)，這種異源初免-加強(qiáng)免疫方法顯著提高了BCG對(duì)小鼠抗M.tb感染的疫苗接種效果[54]。進(jìn)行鼻內(nèi)或皮下BCG初免，DNA-Hsp65加強(qiáng)的免疫策略也得到了類(lèi)似的結(jié)果[55]。然而，另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)新生期接種BCG疫苗的小鼠，成年期再接種pVAXhsp65 DNA疫苗加強(qiáng)劑的保護(hù)功效發(fā)生明顯改變。免疫小鼠雖能檢測(cè)到高水平的血清抗hsp65抗體、IFN-γ和IL-5等細(xì)胞因子，且肺勻漿中也均能檢測(cè)到這些細(xì)胞因子的存在，但該疫苗未能顯著降低感染小鼠肺組織荷菌量以及減輕肺實(shí)質(zhì)的結(jié)核樣炎癥。這表明BCG疫苗的預(yù)致敏增強(qiáng)了pVAXhsp65 DNA疫苗的免疫原性，但未能增強(qiáng)成年小鼠抗M.tb攻擊的保護(hù)力[56]。

除單獨(dú)表達(dá)Hsp家族抗原外，融合其他因子以增強(qiáng)疫苗免疫效果也是構(gòu)建TB DNA常用方法。日本學(xué)者M(jìn)asaji Okada研究團(tuán)隊(duì)等用日本血凝病毒(Hemagglutinating virus of Japan，HVJ)遞送表達(dá)Hsp65和IL-12的DNA疫苗用于TB預(yù)防和治療[57]。小鼠和食蟹猴TB疫苗預(yù)防評(píng)價(jià)模型中，HVJ-E/Hsp65 DNA+IL-12 DNA與BCG疫苗具有協(xié)同作用，該DNA疫苗表現(xiàn)出較強(qiáng)的預(yù)防功效，M.tb感染小鼠存活率為100%[58-59]。治療效果評(píng)價(jià)模型中，MDR-TB和XDR-TB 感染DBA/1小鼠模型經(jīng)3次HVJ-E/Hsp65 DNA+IL-12 DNA疫苗治療后，小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)且體內(nèi)肝臟、脾臟和肺組織等M.tb荷菌量均顯著減少。非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，HVJ-E/Hsp65 DNA+IL-12 DNA疫苗能顯著增加TB感染猴子的體重，改善紅細(xì)胞沉降率，并促進(jìn)機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞(Peripheral blood lymphocyte，PBL)增殖和IL-2的產(chǎn)生；感染猴治療后16周的存活率為100%，顯著高于生理鹽水對(duì)照組的60%[60]。同樣，國(guó)內(nèi)學(xué)者師長(zhǎng)宏等[61]構(gòu)建的Hsp65-IL-2-DNA疫苗也可通過(guò)改善小鼠Th1型反應(yīng)以增強(qiáng)Hsp65-DNA疫苗對(duì)小鼠TB的免疫原性及治療效果。胡方靖等[62]構(gòu)建Hsp65和hGMCSF雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)質(zhì)粒pIHsp65GM并研究其作為T(mén)B DNA疫苗的免疫原性及其對(duì)M.tb感染小鼠的保護(hù)效果。結(jié)果表明，pIHsp65GM DNA疫苗能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ分泌，且免疫小鼠脾臟和肺組織荷菌量均低于對(duì)照組。王慶敏等[63]也發(fā)現(xiàn)Hsp65融合UbGr同樣可以增強(qiáng)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，與單獨(dú)使用Hsp65 DNA疫苗組相比，UbGr-Hsp65 DNA疫苗更能顯著誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)Th1免疫反應(yīng)的極化，改善脾臟T細(xì)胞的增殖以及IFN-γ等的產(chǎn)生。

3 增強(qiáng)TB DNA疫苗免疫效果的策略

臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，單一或多種TB DNA疫苗聯(lián)合使用均獲得了一定的保護(hù)效果，但很難達(dá)到或超過(guò)經(jīng)典疫苗BCG的保護(hù)效率。此外，相同DNA疫苗免疫效果在不同動(dòng)物個(gè)體中差異較大，有些疫苗在小型嚙齒類(lèi)動(dòng)物中免疫保護(hù)效果較好，但在如豚鼠、非人靈長(zhǎng)類(lèi)等中大型動(dòng)物中的保護(hù)效果卻表現(xiàn)不佳。影響TB DNA疫苗免疫效果的因素有多種，而只有針對(duì)性的提出解決策略，各個(gè)擊破，才能從根本上提升TB DNA疫苗的免疫效率。

3.1 選擇合適的保護(hù)性抗原基因 保護(hù)性抗原基因即DNA疫苗表達(dá)的目標(biāo)蛋白基因，M.tb大約有4 000個(gè)基因，各種各樣的蛋白質(zhì)有數(shù)千種。TB DNA疫苗要求表達(dá)出的蛋白分子可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗M.tb的保護(hù)性免疫應(yīng)答，同時(shí)考慮該基因是否需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化，有無(wú)內(nèi)含子以及是否能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被正確剪切、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。此外，目標(biāo)抗原是否為單一抗原、多抗原重組或與其他細(xì)胞因子嵌合表達(dá)，以及被表達(dá)抗原為分泌型或非分泌型等。

3.2 選擇合適的表達(dá)載體與啟動(dòng)子 TB DNA疫苗能否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高水平地表達(dá)出保護(hù)性抗原，表達(dá)載體和啟動(dòng)子的選擇尤為重要。載體滿(mǎn)足在原核宿主細(xì)胞，如大腸桿菌中拷貝復(fù)制，而在真核細(xì)胞內(nèi)不復(fù)制、不整合至宿主染色體外，不同載體所含的酶切位點(diǎn)也與其進(jìn)入機(jī)體后的穩(wěn)定程度有關(guān)。目前，用于構(gòu)建DNA疫苗的載體質(zhì)粒有多種，如pcDNA3.0、pcDNA3.1、pcDNA4.0、PC1、pSV2、pGFP、VR1320和pBK 等，但多數(shù)疫苗主要以PUC或pBR322為基本骨架。此外，作為控制外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子也存在組織特異性，其來(lái)源和強(qiáng)弱也有明顯差異，如猿猴空泡病毒40(Simian virus 40，SV40)、人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，CMV)以及人延長(zhǎng)因子1α(Elongation factor-1α，EF-1α)啟動(dòng)子等，強(qiáng)啟動(dòng)子可短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，而弱啟動(dòng)子則可能誘導(dǎo)長(zhǎng)期的持續(xù)性免疫應(yīng)答。其中以CMV啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)功能最佳，因此應(yīng)用也最多。載體除具有增強(qiáng)子-啟動(dòng)子、選擇標(biāo)記(Ampr、Kanr)、PolyA尾、翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止序列等元件外。有些載體還具有內(nèi)含子序列，以起到顯著提升外源基因表達(dá)水平的作用。

3.3 選擇合適的疫苗遞送方式 鑒于TB DNA疫苗轉(zhuǎn)染效率較低的特性，有必要將質(zhì)粒疫苗有效地遞送至目標(biāo)組織或細(xì)胞。不同遞送途徑下接種部位參與的免疫應(yīng)答細(xì)胞不同，所誘發(fā)的保護(hù)性免疫效果也存在有一定的差異。TB DNA疫苗可以通過(guò)不同遞送方式進(jìn)行給藥，包括化學(xué)法(如，納米顆粒和脂質(zhì)體包裹)、物理法(如，電穿孔、基因槍和微針貼)、生物法(如，細(xì)菌和病毒載體)及常規(guī)注射器注射(如，肌內(nèi)、皮內(nèi)和靜脈接種)等[64-66]。安全有效的遞送載體和遞送方式，一方面促進(jìn)組織細(xì)胞對(duì)DNA疫苗的攝取，同時(shí)保護(hù)DNA疫苗免受血清或胞質(zhì)核酸酶的破壞[67]；另一方面，高效新穎的遞送方式大大節(jié)約了DNA疫苗的用量，減輕接種部位的組織損傷。

3.4 選擇合適的基因疫苗佐劑 與傳統(tǒng)的TB亞單位疫苗佐劑不同，TB DNA疫苗佐劑主要為蛋白分子類(lèi)佐劑，它們的功能是通過(guò)靶向先天免疫受體或調(diào)節(jié)分子信號(hào)通路的介導(dǎo)來(lái)激活機(jī)體體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑因子既可構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒與目的基因質(zhì)粒聯(lián)合接種，也可將佐劑因子基因與保護(hù)性抗原基因連接成融合基因后插入表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共表達(dá)，其主要包括細(xì)胞因子、趨化因子、協(xié)同刺激分子、補(bǔ)體分子、PRR激動(dòng)劑和免疫靶向基因等[68-71]。

3.5 選擇合適的疫苗接種劑量與免疫程序 盡管DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)之一是較長(zhǎng)的免疫持久性，單針接種即可獲得長(zhǎng)期免疫力，但加強(qiáng)免疫亦可明顯增強(qiáng)其應(yīng)答水平。同時(shí)，適宜的接種劑量、間隔時(shí)間和接種針次才能確保機(jī)體獲得滿(mǎn)意的免疫應(yīng)答水平。接種高劑量DNA疫苗，一方面，質(zhì)粒DNA可能在體內(nèi)長(zhǎng)期過(guò)高水平地表達(dá)外源性抗原，最終導(dǎo)致機(jī)體對(duì)該抗原出現(xiàn)免疫耐受；另一方面，質(zhì)粒DNA可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，接種后出現(xiàn)抗DNA抗體，影響TB DNA疫苗的免疫效果。

4 TB DNA疫苗研究存在的問(wèn)題

DNA疫苗的研究是近20年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，它已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一，特別是其研究方向與WHO兒童疫苗計(jì)劃中關(guān)于利用一種疫苗預(yù)防多種疾病的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)相吻合，現(xiàn)在已獲得了迅速的發(fā)展。TB DNA疫苗也正基于一種疫苗用于包括LTBI在內(nèi)的不同類(lèi)型TB的防治目標(biāo)，研發(fā)了不少預(yù)防性或治療性疫苗，被認(rèn)為在TB防治中占有很大的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，盡管TB DNA疫苗取得了可喜的進(jìn)展，但同時(shí)也存在著一些“瓶頸問(wèn)題”制約著此類(lèi)疫苗的研發(fā)步伐。

4.1 疫苗的安全性仍存在一定爭(zhēng)議 雖然DNA疫苗接種后整合入宿主細(xì)胞基因組、引起宿主細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化或免疫系統(tǒng)功能紊亂的可能性很少，且目前所有臨床前動(dòng)物模型研究均已證明該類(lèi)疫苗安全可靠，但沒(méi)有足夠的臨床依據(jù)能排除這種理論上的可能危險(xiǎn)。WHO在《關(guān)于DNA疫苗質(zhì)量保證指南》中也要求DNA疫苗的研制必須考慮其特殊的安全性等問(wèn)題。此外，由于用于一般化學(xué)藥物的傳統(tǒng)安全性或毒性試驗(yàn)對(duì)重組DNA產(chǎn)品不一定適用，用傳統(tǒng)毒性試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)重組DNA產(chǎn)品往往也存在一定的困難，并受到多種因素的影響。我國(guó)《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》也提出，對(duì)重組DNA產(chǎn)品的臨床前安全性試驗(yàn)要求，除了一般生物制品的毒性試驗(yàn)要求之外，應(yīng)采取較為靈活的處置方法。

4.2 疫苗的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步探討 DNA疫苗在宿主的注射組織部位表達(dá)保護(hù)性目標(biāo)抗原，從而激發(fā)免疫應(yīng)答，這個(gè)過(guò)程與胞內(nèi)感染的M.tb侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程相似，但作用機(jī)制卻有本質(zhì)的區(qū)別。DNA質(zhì)粒引入體內(nèi)后，其必須通過(guò)所有DNA遞送系統(tǒng)共有的屏障才能轉(zhuǎn)染至組織細(xì)胞或目標(biāo)APCs。然而，如樹(shù)突狀狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)等對(duì)外來(lái)DNA質(zhì)粒引入其細(xì)胞具有抗性，從而使編碼外來(lái)抗原的DNA載體難以進(jìn)行轉(zhuǎn)染[72-73]。因此，在研究TB DNA作用機(jī)制的同時(shí)，更需克服DNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中來(lái)自胞內(nèi)與胞外的其他屏障。

4.3 疫苗評(píng)價(jià)的內(nèi)容需進(jìn)一步完善 由于DNA疫苗的特殊性，使得其與傳統(tǒng)BCG疫苗或亞單位蛋白疫苗評(píng)價(jià)內(nèi)容有所不同，國(guó)際上包括我國(guó)在內(nèi)對(duì)DNA疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量及生產(chǎn)過(guò)程提出相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則[74]，但針對(duì)TB DNA疫苗包括其原材料、生產(chǎn)以及最終產(chǎn)品等質(zhì)量的控制尚需進(jìn)一步完善。如表達(dá)載體和宿主細(xì)胞、誘發(fā)機(jī)體病理性自身免疫的抗DNA“抗體”評(píng)價(jià)。DNA質(zhì)粒中殘留的內(nèi)毒素(≤ 10 E.U./mg pDNA)、細(xì)菌基因組gDNA(≤ 2 μg/mg pDNA)、RNA(≤ 0.2 μg/mg pDNA)和蛋白質(zhì)(≤ 3 μg/mg pDNA)等不同雜質(zhì)純度評(píng)價(jià)。DNA疫苗超螺旋(SC構(gòu)型)、開(kāi)口環(huán)狀(OC構(gòu)型)及線性(L構(gòu)型)等不同質(zhì)粒構(gòu)象比率評(píng)價(jià)。DNA疫苗抗生素、RNase酶殘留量評(píng)價(jià)以及DNA疫苗自身保護(hù)效力標(biāo)準(zhǔn)的制定等。

4.4 臨床前動(dòng)物模型需進(jìn)一步優(yōu)化 臨床前動(dòng)物試驗(yàn)是疫苗安全性和有效性的重要保證，是疫苗進(jìn)入臨床研究的最后一道關(guān)卡。TB DNA疫苗的有效性研究在小鼠、豚鼠或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中表現(xiàn)出不一致的現(xiàn)象。一方面，與TB動(dòng)物模型選用動(dòng)物品系及建模標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一有關(guān)；另一方面，不同年齡、不同品系及不同動(dòng)物個(gè)體肌間結(jié)締組織不同。大個(gè)體動(dòng)物的結(jié)締組織更為豐富，因而與肌肉注射后DNA載體的轉(zhuǎn)染效率較低等有關(guān)。

5 TB DNA疫苗的應(yīng)用前景

目前，人們對(duì)DNA疫苗的研究日益深入，其中艾滋病和T細(xì)胞淋巴瘤的DNA疫苗已進(jìn)入了臨床前研究，前列腺癌、肺癌、乳腺癌等DNA疫苗也正處于不同的研究階段。美國(guó)FAD已批準(zhǔn)了包括COVID-19(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT04591184)、單純皰疹病毒2型疫苗(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00274300)以及乙型肝炎疫苗(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00513968)在內(nèi)的多種DNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，這預(yù)示著DNA疫苗在21世紀(jì)將成為人類(lèi)與各種疾病抗?fàn)幍挠欣淦?，也顯示出DNA疫苗的巨大潛力和應(yīng)用前景。TB DNA除借助傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)抗原以外，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和免疫學(xué)等分子建模方法已被廣泛用于新型TB DNA疫苗設(shè)計(jì)和分析[75-80]。通過(guò)計(jì)算機(jī)方法預(yù)測(cè)M.tb蛋白潛在T細(xì)胞表位及其與MHC分子不同等位基因的結(jié)合能力，篩選出各種保護(hù)性抗原的優(yōu)勢(shì)表位用于新型TB DNA疫苗構(gòu)建。隨著研究的不斷深入，相信將來(lái)有一天，TB DNA疫苗可以突破其劣勢(shì)的一面，向著更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展，在TB疫苗中扮演舉足輕重的角色，為全球終止TB疫情提供力量。