蔣明霞，王兆芬，馬斌忠，晁秀珍，王 蓉，馬永成，張祖豪，王朝才，李爾琛，魏於家，李 斌

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染性疾病，是國(guó)家重大防控傳染病之一。據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬(wàn)例，其中有46.5萬(wàn)利福平耐藥患者，其中78%為耐多藥結(jié)核病。中國(guó)新發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)核病患者約72.8萬(wàn)例，在新發(fā)結(jié)核病中耐多藥和(或)耐利福平結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者占比7.1%，復(fù)治結(jié)核病中預(yù)計(jì)占比21%[1]。全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示我國(guó)結(jié)核病總耐藥率為36.8%，耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)為6.8%，我國(guó)結(jié)核病患病率呈現(xiàn)西部高于中部、中部高于東部的特征較高。青海省地處青藏高原東北部，平均海拔3 000 m以上，常年平均氣溫在-5.1～9.0 ℃，形成了獨(dú)特的高寒缺氧環(huán)境。為掌握青海省高寒缺氧環(huán)境結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)耐藥結(jié)核病的流性特征及耐藥譜，筆者對(duì)收集的青海省1 531株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了耐藥特征研究。

1 資料與方法

1.1 菌株收集 2014-2019年，青海省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室收集8個(gè)市/州級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株，進(jìn)行抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)和菌種鑒定的菌株，最終經(jīng)菌種鑒定的結(jié)核分枝桿菌(MTB)1 531株。其中2014年1 151株、2015年130株、2016年108株、2017年201株、2018年388株、2019年553株；西寧市497株、海東市458株、海北州44株、海南州172株、海西州206株、黃南州98株、玉樹(shù)州44株、果洛州12株；男性859株，女性672株，男女比例1.28∶1；年齡分布在10～92歲，平均年齡(48.67±19.36)歲。

1.2 菌株分離 依據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[3]，應(yīng)用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行痰分枝桿菌分離培養(yǎng)。痰標(biāo)本采用4% NaOH去污染處理后直接接種至酸性羅氏固體培養(yǎng)基上，接種后第3 d和第7 d觀察培養(yǎng)情況，然后每周觀察1次，直到第8周末。

1.3 藥敏試驗(yàn) 依據(jù)《分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]比例法，對(duì)異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、鏈霉素(streptomycin，SM)、卡那霉素(kanamycin，KM)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)6種常用抗結(jié)核藥物進(jìn)行敏感性測(cè)定。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：含藥培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基表面菌落數(shù)之比≥0.01判斷為耐藥。

1.4 菌株鑒定 分離株在進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定的同時(shí)，利用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌，排除非結(jié)核分枝桿菌。

1.5 質(zhì)量控制 每批試驗(yàn)均以結(jié)核分枝桿菌H37Rv作為對(duì)照質(zhì)控。省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室人員和市"州級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室人員每年均參加國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的全國(guó)抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)熟練度測(cè)試并獲得優(yōu)秀和合格證書，保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)性和質(zhì)量。

1.6 耐藥結(jié)核(DR-TB)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 單耐藥結(jié)核病(mono-resistant tuberculosis,MR-TB)、多耐藥結(jié)核病(poly-resistant tuberculosis,PDR-TB)、耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)、準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病(pre-extensively drug-resistant Tuberculosis,Pre-XDRTB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)、利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB)6種耐藥類型,參考中國(guó)防癆協(xié)會(huì)《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2019年簡(jiǎn)版)》[5]的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有信息采用Excel2010軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用“率(%)”表示，以χ2檢驗(yàn)對(duì)組間差異進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥基本情況 1 531株菌中全敏感菌株1 026株，耐藥菌株505株，TDR(Total resistance，總耐藥)率32.98%(505/1 531)，MR(mono-resistant，單耐藥)率12.34%(189/1 531)，PDR(poly-resistant，多耐藥)率5.75%(88/1 531)，MDR(multiarug-resistant，耐多藥)率14.89%(228/1 531)，XDR(extensively drug-resistant，廣泛耐藥)率1.11%(17/1 531)，RR(rifampicin-resistant，利福平耐藥)率18.16%(278/1 531)。不同年份MR率2016年最高，PDR率2014年最高，MDR率2014年和2015年相近，RR率2015年最高，XDR率2016年最高，TDR率2014年最高，總體呈逐年下降趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

不同地區(qū)菌株不同耐藥類型的耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。MR率黃南州最高，PDR率海東市最高，MDR率、RR率和TDR率海北州最高，XDR率海東市最高。見(jiàn)表2。

表1 青海省2014-2019年1 531株MTB耐藥類型分布與耐藥率[n(%)]Tab.1 Distribution and drug resistance rate of 1 531 cases of M.tb in Qinghai Province from 2016 to 2019 [n(%)]

表2 1 531株MTB不同地區(qū)耐藥類型分布與耐藥率[n(%)]Tab.2 Distribution and drug resistance rate of 1 531 cases of M.tb in different areas [n(%)]

2.2 初治、復(fù)治患者與菌株耐藥類型分布 初治患者1 204株，耐藥297株。復(fù)治患者327株，耐藥208株。初、復(fù)治患者M(jìn)R率、PDR率、MDR率、XDR率、RR率、TDR率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。且MR率初治患者高于復(fù)治患者，PDR率、MDR率、XDR率、RR率、TDR率均復(fù)治患者明顯高于初治患者。見(jiàn)表3。

表3 初、復(fù)治患者1 531株MTB耐藥類型分布與耐藥率[n (%)]Tab.3 Distribution of drug resistance types and drug resistance rate of 1 531 MTB from primary and secondary treatment patients [n (%)]

2.3 對(duì)不同抗結(jié)核藥物的耐藥情況 分離的菌株對(duì)6種抗結(jié)核藥物的任何一種耐藥率由高到低依次為：INH 23.51%(360/1 531)>SM 20.12%(308/1 531)>RFP 18.16%(278/1 531)>EMB 9.54%(146/1 531)>OFX 7.38%(113/1 531)>KM 2.74%(42/1 531)。見(jiàn)表4。

表4 1 531株MTB患者分離株的耐藥率[n(%)]Tab.4 Any drug resistance rate of 1 531 isolated strains from TB patients [n(%)]

2.4 1 531株MTB耐藥譜 單耐藥譜構(gòu)成比結(jié)果顯示：SM 43.39%>INH 31.75%>RFP 21.69%>EMB 3.17%，見(jiàn)表5。多耐藥譜共7種類型，構(gòu)成比結(jié)果顯示同時(shí)耐INH、SM占比最高，見(jiàn)表6。耐多藥譜共16種類型，結(jié)果顯示同時(shí)耐INH、RFP、SM、EMB占比最高，MDR-TB >Pre-XDRTB >XDR-TB，見(jiàn)表7。

表5 189株MTB患者分離株單耐藥譜Tab.5 Mono Drug-resistant spectrum of 189 isolated strains from TB patients

表6 88株MTB患者分離株多耐藥譜Tab.6 Ploy Drug-resistant spectrum of 88 MTB isolated strains

表7 228株MTB患者分離株耐多藥譜Tab.7 MDR Drug-resistant spectrum of 228 MTB isolated strains

2.5 人群特征與菌株耐藥類型分布 6種抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示TDR率男性高于女性；青年組高于中、老年組；民族由高到低依次為漢族、回族、其他民族、藏族，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3 078.00，P<0.05)。見(jiàn)表8。

表8 人群特征與菌株耐藥類型分布[n(%)]Tab.8 Distribution of population characteristics and drug resistance types [n(%)]

3 討 論

結(jié)核病目前仍然是危害人類健康的重大傳染病之一,耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病的出現(xiàn),使全球結(jié)核病控制形勢(shì)變得更加嚴(yán)峻。在全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中,中國(guó)估算結(jié)核病發(fā)病率排第28位，高于俄羅斯(50/10萬(wàn))和巴西(46/10萬(wàn))。中國(guó)的結(jié)核病死亡數(shù)估算為3.1萬(wàn)，結(jié)核病死亡率為2.2/10萬(wàn)，結(jié)核病死亡率首次降至30個(gè)高負(fù)擔(dān)國(guó)家的末位[6]，耐藥結(jié)核病繼續(xù)成為公共衛(wèi)生重大威脅。因此，了解DR-TB的耐藥分布是控制結(jié)核病的基礎(chǔ)和有效手段。

研究結(jié)果顯示，1 531株MTB中 TDR率32.98%，MDR率14.89%、XDR率1.11%。初治患者TDR率24.67%、MDR率7.39%、XDR率0.75%；復(fù)治患者TDR率63.60%、MDR率42.51%、XDR率2.45%，高于2007-2008年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告結(jié)果總MDR率為8.32%、XDR率0.68%；初治患者總MDR率5.71%、XDR率0.47%，復(fù)治患者TDR率55.17%、總MDR率25.64%、XDR率2.06%[7]。據(jù)低海拔地區(qū)文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，TDR率、MDR率均低于青海省，湖南省2014-2018年耐藥監(jiān)測(cè)TDR率、MDR率為17.2%、5.1%，四川省2016-2017年耐藥監(jiān)測(cè)TDR率、MDR率為23.98%、8.14%，上海市2013-2017年TDR率、MDR率為21.03%、4.98%,海南省2011-2018年TDR率、MDR率為25.85%、11.97%?？赡茉蚺c海拔高度和地域生活習(xí)慣有關(guān)。同時(shí)，本次研究初治患者TDR率24.7%、復(fù)治患者TDR率63.6%均高于王蓉等[12]的研究結(jié)果(初治患者的TDR率12.09%、復(fù)治患者的TDR率21.31%)?？赡艿脑颍阂皇歉鶕?jù)國(guó)家和青海省“十三五”規(guī)劃要求實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)得以擴(kuò)展和提升，加強(qiáng)了對(duì)耐藥結(jié)核病的診斷，隨之耐藥病人發(fā)現(xiàn)增多。其次，農(nóng)牧民對(duì)結(jié)核防治認(rèn)識(shí)不足，梁軍等[13]對(duì)青海農(nóng)牧區(qū)居民的結(jié)核防治行為傾向調(diào)查顯示，如果有類似肺結(jié)核的癥狀，約40.00%的人選擇扛著或不就醫(yī)，高達(dá)10.00%的人表示不知道如何處理，農(nóng)牧民對(duì)結(jié)核防治認(rèn)識(shí)不足、就醫(yī)不及時(shí)、患者自行買藥或不按照抗結(jié)核治療規(guī)則服藥，這些因素都極易導(dǎo)致抗結(jié)核治療失敗，并有可能產(chǎn)生耐藥性。復(fù)治患者耐多藥率遠(yuǎn)高于初治患者，原因可能一方面與長(zhǎng)期服用以異煙肼和利福平為主要抗結(jié)核藥物有關(guān)，增加了MTB的耐藥性的產(chǎn)生;另一方面可能地處偏遠(yuǎn)，經(jīng)濟(jì)條件相對(duì)比較落后，很多農(nóng)牧民在發(fā)現(xiàn)得了結(jié)核病后在藥店自行購(gòu)買藥物，癥狀有所緩解后便停藥，服藥很不規(guī)范;當(dāng)知道結(jié)核病免費(fèi)的政策后到疾控中心(或定點(diǎn)醫(yī)院)就診，也不能按時(shí)服藥，造成大量耐藥患者的發(fā)生[12]。

研究結(jié)果顯示，初治患者分離菌株的RR率10.80%，復(fù)治患者RR率45.26%，高于國(guó)內(nèi)兩次基線調(diào)查和全球初、復(fù)治RR率。我國(guó)2007-2008年和2013年兩次全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示：2007-2008年初治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RR率6.7%，復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RR率29.4%；2013年初治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RR率7.1%，復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RR率24%，高于全球初治和復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RR率(3.6%、17.0%)[5]。RR-TB涵蓋所有對(duì)RFP耐藥的情況，包括單耐藥、耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥[14]。據(jù)WHO 2020年全球結(jié)核病報(bào)告，在全球30個(gè)耐多藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中，根據(jù)估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)計(jì)算的利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)最多的為印度(12.4萬(wàn),占全球27%)、中國(guó)(6.5萬(wàn)，占全球14%)和俄羅斯(3.9萬(wàn)，占全球8%)。中國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者中有7.1%的耐藥/耐多藥結(jié)核病患者，23%的復(fù)治耐藥/耐多藥結(jié)核病患者，耐多藥結(jié)核病占利福平耐藥結(jié)核病患者的74%[6]。因此，筆者認(rèn)為在今后的工作中更應(yīng)該重視MDR-TB/RR-TB的防控，保證政府承諾，加強(qiáng)耐藥結(jié)核病患者的歸口管理，規(guī)范合理臨床用藥，早發(fā)現(xiàn)、早診療，有效阻止MDR-TB/RR-TB的傳播，減少DR-TB的產(chǎn)生。

研究結(jié)果顯示，不同年份、不同耐藥類型耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2014-2016年明顯高于2017-2019年?？赡艿脑蚴?014-2016年間收集菌株多為達(dá)米恩耐多藥防治項(xiàng)目和全球基金耐多藥防治項(xiàng)目，且之前青海省未系統(tǒng)開(kāi)展全省結(jié)核病耐藥篩查工作。自2017年開(kāi)始常規(guī)開(kāi)展全省耐藥篩查工作，不同耐藥類型耐藥率呈下降趨勢(shì)，不同地區(qū)分離菌株的TDR率、RR率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。玉樹(shù)州、果洛州總耐藥率、利福平耐藥率均低于我省其它市、州，海北州高于我省其它市、州?？赡艿脑颍菏紫?，藏區(qū)多為游牧民族，交通不便，樣本收集較為困難，所以本次樣本量較小。其次，受藏區(qū)宗教文化的影響，牧民得病后會(huì)相信活佛能醫(yī)治疾病，不及時(shí)就醫(yī)，造成樣本收集量較小。所以，本次研究海北州、玉樹(shù)州、果洛州數(shù)據(jù)不能真正代表這3個(gè)州的真實(shí)耐藥情況。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青海省DR-TB耐藥譜較為復(fù)雜而廣泛，任何耐藥率和單耐藥譜、多耐藥譜、耐多藥譜構(gòu)成比高于2013年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果[15]。多耐藥組合模式6種，耐多藥組合模式14種與2013年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果基本相似。國(guó)內(nèi)外研究表明[16-17]，既往TB 治療是產(chǎn)生MDR-TB的危險(xiǎn)因素。臨床治療前應(yīng)該重視初治患者的耐藥檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)DR-TB，制定合理的化療方案，減少獲得性耐藥菌株的產(chǎn)生。

耐藥結(jié)核分枝桿菌流行因素多而復(fù)雜，居住地為農(nóng)村、文化程度為初中及以下、當(dāng)?shù)蒯t(yī)療水平、患者家庭收入、治療不規(guī)范、年齡、性別等均是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的危險(xiǎn)因素[18-20]。本次研究從人口學(xué)特征來(lái)看，不同性別、不同民族、不同年齡組間耐藥率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別、年齡組的總耐藥率男性高于女性，青年組高于中老年組。不同民族總耐藥率由高到低依次為漢族、回族、其他民族、藏族，這可能與患者個(gè)人經(jīng)濟(jì)水平及常住地醫(yī)療資源可及性有關(guān)，個(gè)人經(jīng)濟(jì)水平較高、醫(yī)療資源可及性較強(qiáng)，那么就容易購(gòu)買到抗結(jié)核病藥品，并且自行服藥、斷藥、反復(fù)治療，導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生。

本研究中XDR率可能比實(shí)際情況略低，因?yàn)槎€藥物在本次實(shí)驗(yàn)中只選擇OFX和KM兩種，MDR-TB還可能對(duì)其他未測(cè)二線藥物耐藥，而使XDR-TB未檢測(cè)出,造成其比率可能比實(shí)際低。

總之，青海省DR-TB高于全國(guó)水平，在今后的工作中應(yīng)加強(qiáng)政府承諾，加強(qiáng)DR-TB的發(fā)現(xiàn)和治療工作，尤其應(yīng)該重視初治患者的耐藥檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)DR-TB，制定合理的化療方案盡早治療，減少M(fèi)DR-TB的產(chǎn)生和傳播。