左廣鋒 謝浩 任曉敏 鄭亞國 金國珍 林松

急性冠脈綜合征(ACS)包括急性心肌梗死(AMI)和不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)，為心血管急危重癥，死亡率高[1]。高齡是發(fā)生心血管事件不可逆的危險因素，老年ACS 病人常具有冠脈病變復(fù)雜、 癥狀不典型、 臟器儲備差、病情進(jìn)展快、合并癥多等特點，不良事件發(fā)生率也較高，嚴(yán)重影響老年人生命健康和生活質(zhì)量[2]。炎癥反應(yīng)及冠脈內(nèi)皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是引起ACS發(fā)病的兩個重要的觸發(fā)機(jī)制[3]。已有研究顯示，隨著年齡增長，促炎因子如IL-1、IL-6、 TNF-α表達(dá)增加，內(nèi)皮受損，導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率及死亡率上升[4-5]。抑制促炎因子表達(dá)及改善內(nèi)皮功能是預(yù)防及治療老年ACS的重要策略。

α1抗胰糜蛋白酶(AACT)又被稱為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白A3(serpinA3)，在腦組織、骨骼肌、心肌、血管、腎臟、肺和脾臟等組織中廣泛表達(dá)，其作為促炎因子與炎癥反應(yīng)及多種疾病如糖尿病、心力衰竭、腫瘤等密切相關(guān)，已成為心血管領(lǐng)域的研究熱點[6-9]。Zhao等[10]報道了AMI后血漿中serpinA3水平升高，與主要不良心血管事件(MACE)密切相關(guān)，其可能作為預(yù)測AMI臨床預(yù)后的潛在血清標(biāo)志物。但AACT是否可以作為ACS診斷標(biāo)志物，以及是否促發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，目前未見報道。本研究旨在通過檢測ACS病人血清中AACT水平，以及AACT干預(yù)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)后的炎癥指標(biāo)水平，探討其在ACS診斷中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象及一般資料 從2020年1月1日至2021年6月30日，連續(xù)入選178例在我院心臟病中心進(jìn)行冠脈造影的老年病人。本研究包括4組：52例AMI 病人, 男28例, 女24例，年齡61～88歲，平均 (72.5±10.3)歲；56例 UAP 病人，男30例，女26例，年齡60～85歲，平均 (71.3±10.7 )歲； 40例穩(wěn)定型心絞痛(SAP)病人，男22例，女18例，年齡61～82歲，平均 (70.5±10.4)歲；對照組(C組)30例, 男16例，女14例，年齡60～80歲，平均 (70.2±9.5) 歲。AMI、UAP診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《急性冠脈綜合征急診快速診治指南 (2019年版)》[11]；SAP診斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲心臟病學(xué)會SAP診斷指南 (2013年版)[12];具有胸悶胸痛或不典型癥狀，心肌壞死標(biāo)志物正常，且接受診斷性冠脈造影證實冠狀動脈正常或幾乎正常的病人，被定義為C組。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：病人病例資料完整；年齡≥60歲；所有病人均完善冠脈造影檢查；病人自愿參與研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤；全身炎癥性疾??；嚴(yán)重肝、腎功能不全；嚴(yán)重室性心律失常；需要心臟手術(shù)的嚴(yán)重瓣膜性心臟病。4組年齡、性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床資料收集：收集年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常、肝腎功能是否異常等資料。

1.2.2 病例診斷：所有入選者均行冠脈造影檢查，結(jié)果由2位心臟介入?？漆t(yī)師閱讀分析，冠狀動脈中至少有1支血管狹窄≥50%，并結(jié)合臨床癥狀、心電圖表現(xiàn)及心肌壞死標(biāo)志物判定病人屬于AMI、UAP還是SAP。

1.2.3 標(biāo)本采集：入選者入院后首次化驗檢查時一并采集外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝，室溫靜置2 h，3000 r/min，離心15 min，小心吸取上清，將上清置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2.4 ELISA檢測：應(yīng)用武漢華美生物工程有限公司人種屬AACT試劑盒(貨號：CSB-E08957h)以及人種屬IL-6試劑盒(貨號：CSB-E04638h)分別檢測血清中AACT、IL-6的水平。酶標(biāo)儀型號為DENIEY DRAGON Wellscan MK 3 (芬蘭Thermo)，分析軟件為Ascent Software for Multiskan。

1.2.5 HCAEC培養(yǎng)及處理：購買武漢普諾賽生命科技有限公司HCAEC(貨號：CP-H087)及HCAEC完全培養(yǎng)基(貨號：CM-H087)。人重組AACT蛋白(武漢華美，貨號：CSB-YP021059HU)用PBS溶解配置成100μg/mL母液，然后分別應(yīng)用10 ng/mL、100 ng/mL處理HCAEC。選擇最佳處理濃度的AACT預(yù)處理1 h，然后再分別處理12 h、24 h及48 h，PBS處理用作對照組。

1.2.6 Western Blot檢測：提取AACT處理及未處理后的HCAEC蛋白，進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，然后分別應(yīng)用AACT抗體(1∶1000稀釋，美國Proteintech，66078-1-Ig)、IL-6抗體(1∶1000稀釋，美國Proteintech，66146-1-Ig)進(jìn)行孵育，再孵育二抗(1∶1000稀釋，美國Cell Signaling Technology，7074S，7076S)。成像設(shè)備型號為GeneGnome XRQ(英國Syngene)，分析軟件為Image J。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 AMI組、UAP組及SAP組病人吸煙、血脂異常及合并糖尿病的比例均顯著高于C組(P<0.01)，AMI組、UAP組血脂異常及合并糖尿病的比例高于SAP組(P<0.05)。見表1。

表1 4組一般資料比較(n，%)

2.2 血清中AACT及IL-6水平比較 AMI組、UAP組血清中AACT及IL-6的水平均顯著高于SAP組及C組(P<0.01)，且AMI組血清中AACT及IL-6的水平高于UAP組(P<0.05)，而SAP組與C組之間兩指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。見表2。

表2 4組血清AACT及IL-6水平比較

2.3 AACT對ACS的診斷價值 ROC曲線下面積為0.951(95%CI：0.909～0.978，P<0.01)，血清AACT診斷ACS的最佳界值為12.40 ng/mL，靈敏度為84.26%，特異度為84.29%。見圖1。

圖1 ROC曲線評價AACT對ACS的診斷價值

2.4 AACT促進(jìn)HCAEC中IL-6表達(dá)上調(diào) Western Blot顯示人AACT 重組蛋白處理HCAEC后，AACT蛋白表達(dá)明顯高于對照組及PBS處理組(圖2a)。且AACT(100 ng/mL)促進(jìn)HCAEC IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)(圖2b)。

注：a：Western Blot檢測AACT 或PBS處理HEAEC后AACT的蛋白表達(dá)(n=5)；b： Western Blot檢測AACT處理HEAEC不同時間后IL-6的蛋白表達(dá)(n=5)。與對照組(Control)或PBS組比較，*P<0.05, ** P <0.01; 與0 h組比較，#P<0.05, ## P <0.01圖2 人AACT 重組蛋白促進(jìn)HCAEC中IL-6 蛋白表達(dá)上調(diào)

3 討論

ACS是冠心病最嚴(yán)重的一種類型，其特征是冠狀動脈血流量顯著減少[3]。炎癥反應(yīng)和因其引起的內(nèi)皮受損，被認(rèn)為是觸發(fā)ACS的重要機(jī)制[13-14]。高齡是發(fā)生心血管事件不可逆的獨立危險因素。老年人會出現(xiàn)炎性衰老，即血液中有較高的炎性標(biāo)志物，其與心血管疾病、慢性腎病、糖尿病等多種疾病及衰弱、死亡密切相關(guān)[15]。因此，檢測血清中炎癥因子水平有助于診斷和預(yù)測老年ACS的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。

AACT是serpin家族成員，該家族一共包括36個亞型，起著抑制絲氨酸蛋白酶的作用[10]。AACT是一種急性相反應(yīng)蛋白，參與炎癥反應(yīng)及多種疾病，如心血管疾病、糖尿病、腫瘤等[6-9，16]。W?gs?ter等[17]發(fā)現(xiàn)，在人動脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞及中層平滑肌細(xì)胞中，AACT表達(dá)明顯上調(diào)；在ApoE敲除小鼠的動脈粥樣斑塊中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。Cheow等[18]報道了AACT參與不穩(wěn)定斑塊破裂誘導(dǎo)的心肌損傷。炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮受損參與動脈粥樣硬化形成及破裂，共同構(gòu)成了ACS發(fā)生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[19-20]。因此推測循環(huán)血中AACT水平增加可能與老年ACS發(fā)生密切相關(guān)。本文結(jié)果顯示，老年ACS病人血清中AACT水平顯著高于SAP組及對照組，且AMI病人高于UAP病人；ROC曲線分析顯示血清AACT水平對ACS有良好的診斷價值。這些結(jié)果表明，檢測血清中AACT的水平有助于老年ACS的臨床診斷。

ACS是一種復(fù)雜的炎癥綜合征，其特征是血液中炎性因子明顯增加，這些炎性因子可能與AACT協(xié)同作用并受其調(diào)控[10]。IL-6在ACS發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用，其介導(dǎo)白細(xì)胞黏附，削弱斑塊處纖維帽，增加并促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性，加速斑塊裂隙發(fā)生，最終導(dǎo)致斑塊破裂、血栓形成[21-22]。本研究結(jié)果顯示，老年ACS病人血清中IL-6水平較SAP組及對照組明顯升高；在體外，AACT處理HCAEC后，IL-6 蛋白水平以時間依賴性方式上調(diào)。據(jù)此，推測AACT誘導(dǎo)IL-6致炎，引起內(nèi)皮受損，觸發(fā)ACS。因此，檢測老年ACS病人血清中AACT水平，對老年ACS病人的診斷及預(yù)后評估具有重要的臨床意義。但本研究樣本量較少，仍需要進(jìn)一步的隨機(jī)對照研究去驗證。