路 露 徐 律 張 鑫 周小紅 余樂(lè)平

(1.無(wú)錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 汽車(chē)技術(shù)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214153；2.鹽城工學(xué)院 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

1 引 言

半胱氨酸(Cys)作為一種代表性的小分子生物硫醇，可參與細(xì)胞內(nèi)的許多氧化還原過(guò)程和肝臟內(nèi)的磷脂代謝。Cys 具有保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷、促進(jìn)肝功能恢復(fù)的藥理作用[1]。正常細(xì)胞間Cys 量在30～200 μmol/L 范圍內(nèi)[2]。生物體內(nèi)Cys 的含量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)增加疾病的發(fā)生幾率，包括肝損傷、胱氨酸病、心血管疾病甚至癌癥。同型半胱氨酸(Hcy)是另一種重要的含硫醇氨基酸，與Cys 相比，它多含一個(gè)亞甲基。Hcy 可直接或間接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起血管平滑肌細(xì)胞增殖，影響低密度脂蛋白氧化，增強(qiáng)血小板功能，引起血栓形成。血清中正常Hcy 含量約為5～12 μmol/L[3]。如果濃度超出這個(gè)平衡范圍，可能會(huì)發(fā)生動(dòng)脈損傷、激素問(wèn)題和血栓的形成[4]。由于Cys 和Hcy 不可或缺的作用，制備靈敏、簡(jiǎn)單且廉價(jià)的探針來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定生物系統(tǒng)中的Cys/Hcy 至關(guān)重要。

迄今為止，已有大量分析儀器，包括高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、比色熒光法等被報(bào)道用于Cys檢測(cè)[5-7]。其中，熒光法因其操作快捷、無(wú)創(chuàng)、靈敏度高而被廣泛選用。近年來(lái)，貴金屬納米團(tuán)簇、有機(jī)分子化合物和半導(dǎo)體量子點(diǎn)已被廣泛研究用于Cys 檢測(cè)[8-10]。但一些探針由于其生物毒性差、溶解度不理想以及對(duì)細(xì)胞膜的滲透性低等并不適用于細(xì)胞內(nèi)Cys 檢測(cè)。此外，有機(jī)探針通常涉及繁瑣的合成程序。而“信號(hào)關(guān)閉”型傳感器往往會(huì)限制靈敏度。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種用于Cys/Hcy 檢測(cè)的、具有可忽略不計(jì)細(xì)胞毒性的環(huán)保型傳感器。

光致發(fā)光碳基納米點(diǎn)(CDs)由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、超低細(xì)胞毒性、優(yōu)異的光穩(wěn)定性、綠色和簡(jiǎn)便的合成路線而受到廣泛關(guān)注[11-12]。但單一的碳納米點(diǎn)往往熒光量子產(chǎn)率不高，且在干擾離子共存過(guò)程中對(duì)特定目標(biāo)離子的選擇性較差，不利于實(shí)際應(yīng)用。眾所周知，用雜原子摻雜CDs 可能對(duì)物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生重大影響，例如，電子分布、表面懸鍵和化學(xué)反應(yīng)性[13]。CDs 骨架中豐富的N 含量與高熒光量子產(chǎn)率有關(guān)。N 和P 都具有5 個(gè)價(jià)電子和類(lèi)似的原子結(jié)構(gòu)，更容易與C 原子鍵合。因此，N、P摻雜的碳量子點(diǎn)具有更加優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)。通常用作N、P摻雜的前驅(qū)體主要有三溴化磷、磷酸一鈉、磷酸、檸檬酸、尿素、多巴胺和鄰苯二胺等，然而它們存在摻雜量低、合成工藝復(fù)雜、靈敏度低和光穩(wěn)定性低等問(wèn)題，限制了它們的實(shí)際應(yīng)用[14]。而葉酸(FA)和N-(膦?；谆?亞氨基二乙酸(PMIDA)無(wú)毒性，對(duì)環(huán)境友好，且FA 的富氮分子結(jié)構(gòu)為提高N 的摻雜量提供了更多機(jī)會(huì)，PMIDA 分子中的羧基和磷酸基團(tuán)很容易與FA 反應(yīng)，而且PMIDA 的支鏈結(jié)構(gòu)可能有利于碳化過(guò)程中碳骨架的形成。此外，F(xiàn)A 對(duì)癌細(xì)胞上的葉酸受體(FR)具有良好的親和力，具有很好的生物相容性。因此，F(xiàn)A 和PMIDA 作為N/P摻雜前驅(qū)體，可獲得高熒光量子產(chǎn)率、低細(xì)胞毒性和高細(xì)胞滲透性的N/P摻雜碳點(diǎn)，進(jìn)而在Cys/Hcy 的熒光檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。

鑒于此，本文采用葉酸(FA)和N-(膦酰基甲基)亞氨基二乙酸(PMIDA)，通過(guò)簡(jiǎn)便且環(huán)保的水熱法制備新型N、P 共摻雜碳納米點(diǎn)(N，PCDs)，詳細(xì)探討了該碳納米點(diǎn)的元素組成、表面官能團(tuán)和光學(xué)性質(zhì)，并在不同條件下進(jìn)行Cys 和Hcy 測(cè)定。此外，該體系已成功應(yīng)用于BEL7402細(xì)胞和尿液樣本中的Cys 識(shí)別，通過(guò)細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)探索了N，P-CDs 對(duì)于活細(xì)胞內(nèi)的Cys 的識(shí)別能力，獲得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并探討了可能的傳感機(jī)理。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 藥品和儀器

FA(≥99.0%)、PMIDA(≥98.5%)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldrich。Hg(NO3)2·H2O、Cys、Hcy 和其他氨基酸(Gly、Ser、Val、Glu、His、Lys、Tyr 等)購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。人肝癌細(xì)胞BEL 7402 來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。含有青霉素和鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)、生理PBS(pH ＝7.4)購(gòu)自KeyGEN生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購(gòu)自碧瑤生物科技有限公司。

樣品的透射電鏡(TEM)照片采用JEM-2100F型號(hào)設(shè)備測(cè)定；樣品的X 射線衍射光譜(XRD)采用Bruker D8 型號(hào)設(shè)備測(cè)定；樣品的傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)采用Nicolet 5700 型號(hào)設(shè)備測(cè)定；樣品的拉曼光譜采用賽默飛公司設(shè)備測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm；樣品的X 射線光電子能譜(XPS)采ESCALAB 250 型號(hào)設(shè)備測(cè)定；樣品的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)和熒光光譜(FL)采用UV-2450 和F-7000 型號(hào)設(shè)備測(cè)定；樣品的熒光壽命和絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率(PLQY)由FluoroLog3-TSCPC 型號(hào)設(shè)備測(cè)定；樣品的MTT 測(cè)定使用Multiskan GO 微孔板分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行；樣品的共聚焦熒光圖像由LSM 800(ZEISS)設(shè)備記錄。

2.2 樣品制備

將0.103 g FA 和0.075 g PMIDA 溶解在15 mL 水中以形成均勻的溶液。之后，將前體溶液移入25 mL 高壓反應(yīng)釜中，然后在180 ℃下加熱2 h。冷卻后，將上清液以8 000 r/min 的速度離心20 min，使用去離子水進(jìn)行透析(1000 u MWCO)24 h 以進(jìn)行純化。60 ℃下真空干燥得到表征用固體產(chǎn)物。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

在合成過(guò)程中，優(yōu)化了FA 和PMIDA 的質(zhì)量比(2∶1～2∶3)和反應(yīng)時(shí)間(1～6 h)以獲得最佳光致發(fā)光效率。在測(cè)定過(guò)程中，在定量檢測(cè)前優(yōu)化了激發(fā)波長(zhǎng)(330～420 nm)和pH(3～12)。N，P-CDs 溶液用水或相應(yīng)的緩沖液稀釋10 倍，然后加入微型比色皿中以測(cè)量熒光發(fā)射光譜。光電倍增管電壓為500 V，狹縫寬度為5 nm。

2.4 Hg2+和Cys/Hcy 測(cè)定

在測(cè)定過(guò)程中，將100 μL N，P-CDs 溶液(1.5 mg/mL)和50 μL 磷酸鹽緩沖液加入離心管中，然后吸取不同濃度的Hg2＋溶液，最終體積控制在500 μL。在370 nm 激發(fā)下測(cè)試溶液的熒光發(fā)射光譜。Cys/Hcy 檢測(cè):將100 μLN，P-CDs 溶液、50 μL 緩沖液和100 μL Hg2＋溶液(625 μmol/L)加入離心管中，然后加入不同濃度的Cys/Hcy 溶液，加入去離子水，最終體積控制在500 μL，進(jìn)行FL測(cè)定。在選擇性研究中，將100 μL N，P-CDs 溶液、50 μL 緩沖液、100 μL Hg2＋(625 μmol/L)、其他干擾氨基酸(5 mmol/L)和適當(dāng)?shù)乃旌暇鶆颉Ｍㄟ^(guò)計(jì)算F/F0值，評(píng)估了N，P-CDs 對(duì)Cys/Hcy的敏感性和選擇性。

2.5 真實(shí)樣品測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)添加方法，以自來(lái)水和尿液為真實(shí)樣品。將不同Hg2＋含量(2，10，50 μmol/L)添加到去離子水中，并且在添加前后測(cè)量FL，根據(jù)線性方程評(píng)估個(gè)體濃度。對(duì)尿樣中的Cys(100 nmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L)進(jìn)行了類(lèi)似的程序以評(píng)估回收率。

2.6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將BEL 7402 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96 孔板中。每個(gè)孔包含大約5×103個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基和10% FBS 培養(yǎng)24 h 以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后每個(gè)孔用PBS 沖洗3 次，并加入新制備的培養(yǎng)基，其中包含不同濃度(0～400 μg/mL)的N，P-CDs。孵育一天后，沖洗孔并單獨(dú)加入含有600 μg/mL MTT 的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h 后，用100 μL DMSO 代替原MTT 溶液，振蕩10 min，然后用微孔板分光光度計(jì)記錄570 nm 處的吸光度。細(xì)胞活力根據(jù)如下公式計(jì)算:

其中，V代表細(xì)胞活力，At為經(jīng)N，P-CDs 處理后細(xì)胞的吸光度，Ac為對(duì)照細(xì)胞的吸光度。

2.7 細(xì)胞成像

將BEL 7402 細(xì)胞加入共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 以實(shí)現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)。然后丟棄漂浮的細(xì)胞，用PBS 沖洗粘附的細(xì)胞。隨后，補(bǔ)充N(xiāo)，P-CDs (150 μg/mL)并再孵育30 min。去除多余的N，PCDs，再次沖洗培養(yǎng)皿，用共聚焦激光掃描顯微鏡記錄細(xì)胞圖像，再將N，P-CDs 處理的細(xì)胞加入Hg2＋(125 μmol/L)中10 min，沖洗并拍照。對(duì)于Cys 識(shí)別體系，將N，P-CDs/Hg2＋加載的細(xì)胞與外源性Cys(150 μmol/L)孵育30 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 材料選擇與實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

選擇FA 和PMIDA 作為前體主要基于以下因素:(1)FA 和PMIDA 都沒(méi)有毒性，這確保了合成過(guò)程對(duì)環(huán)境友好。(2)將N、P 雜原子摻雜到CDs 的骨架中可以帶來(lái)大量的活性位點(diǎn)，從而帶來(lái)更高的量子產(chǎn)率[15]。FA 的富氮分子結(jié)構(gòu)為提高N 的摻雜量提供了更多機(jī)會(huì)，無(wú)論是邊緣的氨基形式還是碳框架內(nèi)的雜芳環(huán)形式。(3)FA對(duì)癌細(xì)胞上的葉酸受體(FR)具有良好的親和力，可以被內(nèi)化到細(xì)胞中。CDs 骨架中的FA 片段可能有利于活細(xì)胞中的進(jìn)一步FL 檢測(cè)。(4)作為另一種電子供體，P 元素通常與N 結(jié)合制備CDs，以促進(jìn)電子離域用作傳感位點(diǎn)。此外，PMIDA 分子中的羧基和磷酸基團(tuán)很容易與FA 反應(yīng)，而且PMIDA 的支鏈結(jié)構(gòu)可能有利于碳化過(guò)程中碳骨架的形成。為了獲得最佳的熒光性能，我們對(duì)反應(yīng)前驅(qū)體的質(zhì)量比和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，如圖1 所示。結(jié)果表明，N，P-CDs 制備的最佳質(zhì)量比為4∶3，最佳反應(yīng)時(shí)間為2 h。

圖1 前驅(qū)體質(zhì)量比(a)和反應(yīng)時(shí)間(b)對(duì)N，P-CDs 熒光強(qiáng)度(λex ＝370 nm，λem ＝446 nm)的影響Fig.1 Influence of mass ratio of precursor(a) and reaction time(b) on the FL intensity of N，P-CDs(λex ＝370 nm， λem ＝446 nm)

3.2 N，P-CDs 表征

圖2(a)為樣品N，P-CDs 的TEM 照片，從圖中可以看出，碳點(diǎn)均勻地分散在支持膜上，形狀接近圓形，直徑約為5 nm。插圖為N，P-CDs 的粒徑分布圖，從圖中可知N，P-CDs 的粒徑呈現(xiàn)正態(tài)分布，其平均直徑為(4.3 ± 1.3) nm。從樣品的EDS 光譜(圖2(b))中可以看出，位于0.27，0.40，0.52，2.02 eV 的特征峰分別對(duì)應(yīng)于碳、氮、氧和磷元素。圖2(c)為元素含量結(jié)果圖，值得注意的是氮的原子百分比為10.0%，高于其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的CDs[16-17]，磷的原子百分比為1.12%。樣品的XRD 譜圖(圖2(d))顯示在22.8°處出現(xiàn)較寬衍射峰，表明碳點(diǎn)的形成[18]。

圖2 N，P-CDs 的TEM(a)、EDS(b)、元素含量(c)、XRD(d)、FT-IR(e)和拉曼光譜(f)。(a)中插圖為N，P-CDs 粒徑分布圖。Fig.2 TEM(a)，EDS(b)，elemental content(c)，XRD(d)，F(xiàn)T-IR(e) and Raman spectrum(f) of N，P-CD.The inset of Fig.2(a) is the size distribution of N，P-CDs.

為了進(jìn)一步研究樣品的化學(xué)鍵和官能團(tuán)，進(jìn)行了紅外和拉曼表征。如圖2(e)所示，位于3 433，3 362，3 056 cm－1處的3 個(gè)吸收峰分別對(duì)應(yīng)于O—H、N—H 和Ar—H 的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)；位于2 827 cm－1和2 792 cm－1處的相鄰峰與—CH2—和—CHO—(C—H)的振動(dòng)有關(guān)；位于1 701 cm－1和1 603 cm－1處的兩個(gè)尖銳而強(qiáng)烈的峰與—C==O 和C==N 的伸縮振動(dòng)一致；位于1 365，1 293，1 176，1126 cm－1的4 個(gè)峰與C—N、C—O、P==O和P—O 的振動(dòng)相關(guān)[19]。這些結(jié)果表明，除了如羥基、氨基和其他共軛基團(tuán)這些大多數(shù)CDs 中常見(jiàn)的化學(xué)基團(tuán)外，本文所制備樣品中有磷酸基團(tuán)的存在。拉曼光譜用于檢測(cè)分析N，P-CDs 的骨架結(jié)構(gòu)。如圖2(f)所示，位于1 346 cm－1和1 594 cm－1的兩個(gè)特征吸收帶，前者屬于D 帶，后者屬于G 帶，分別對(duì)應(yīng)于sp3雜化碳原子和面內(nèi)sp2雜化碳原子。另外，ID/IG比值為0.66，證實(shí)樣品中存在大量由碳化過(guò)程和氮、磷摻雜引起的懸空鍵。

XPS 表征用于分析N，P-CDs 化學(xué)組成與元素價(jià)態(tài)。圖3(a)為C 1s 的XPS 光譜，位于284.4，285.1，286.1，288.2 eV 處存在4 個(gè)擬合成峰，分別對(duì)應(yīng)于C—C/C==C、C—N/C—P、C—O 和C==O/C==N，這意味著主要的共軛結(jié)構(gòu)為芳環(huán)和雜原子環(huán)以及表面的不飽和基團(tuán)等[20]。圖3(b)為N 1s 的XPS 光譜，圖中顯示了三種氮組成:吡啶N、吡咯N 和N—H，進(jìn)一步證實(shí)了氨基和酰胺基團(tuán)分散在表面。圖3(c)為O 1s 的XPS 光譜，位于531.3，532.7，534.0，535.2 eV 處的特征吸收峰分別對(duì)應(yīng)于C==O、C—OH/P—OH、P==O 和C—O—C 中的O[21]。圖3(d)為P 2p 的XPS 光譜，兩個(gè)特征吸收峰對(duì)應(yīng)于P—C 和P—O，進(jìn)一步表明了磷、磷酸鹽和亞磷酸的摻雜形式[22]。

圖3 N，P-CDs 的C 1s(a)、N 1s(b)、O 1s(c)和P 2p(d)XPS 光譜。Fig.3 C 1s(a)，N 1s(b)，O 1s(c) and P 2p(d) XPS spectra of N，P-CDs.

3.3 N，P-CDs 光學(xué)性質(zhì)

圖4(a)為N，P-CDs 的UV-Vis 吸收光譜，最大吸收波長(zhǎng)位于370 nm 處，在日光下顯示淡黃色，在370 nm 紫外光激發(fā)下，溶液發(fā)出一束藍(lán)光(如圖4(a)插圖所示)，最大吸收波長(zhǎng)為446 nm，絕對(duì)FL 量子產(chǎn)率為23.64%。圖4(b)為330～420 nm 不同激發(fā)波長(zhǎng)下的FL 性能結(jié)果圖。如圖4(b)所示，當(dāng)溶液在370 nm 光源下激發(fā)時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)位于446 nm，該波長(zhǎng)被選為最佳測(cè)量波長(zhǎng)。這種依賴(lài)于激發(fā)的行為與之前報(bào)道的光致發(fā)光碳點(diǎn)相似[17]。圖4(c)～(e)為pH、鹽濃度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)最大發(fā)射波長(zhǎng)下FL強(qiáng)度的影響。如圖4(c)所示，F(xiàn)L 強(qiáng)度在pH 值為5～10 中保持穩(wěn)定。在極酸性和堿性環(huán)境下強(qiáng)度較低，主要是由于懸空鍵會(huì)受到質(zhì)子化/去質(zhì)子化過(guò)程的影響。從圖4(d)可知，即使NaCl濃度高達(dá)200 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)L 強(qiáng)度仍保持不變，表明樣品具有優(yōu)異的耐鹽性。圖4(e)表明樣品儲(chǔ)存30 d 后，F(xiàn)L 強(qiáng)度僅下降了5.8%，顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性。

圖4 (a)N，P-CDs 在370 nm 激發(fā)下的UV-Vis(曲線a)和熒光發(fā)射(曲線b)光譜，插圖為日光和370 nm 激發(fā)下的水溶液；(b)不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜；pH(c)、離子強(qiáng)度(d)和儲(chǔ)存時(shí)間(e)對(duì)N，P-CDs 在446 nm(λex ＝370 nm)的FL 強(qiáng)度的影響(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm)。Fig.4 (a)UV-Vis(curve a) and fluorescence emission(curve b) spectra of N，P-CDs under 370 nm excitation，insets:aqueous solution under daylight and excitation of 370 nm.(b)Fluorescence emission spectra under different excitation wavelengths.Effects of pH(c)，ionic strength(d) and storage time(e) on FL intensity of N，P-CDs at 446 nm(λex ＝370 nm).Both excitation and emission slit widths were set at 5 nm.

3.4 Cys 和Hcy 的FL 檢測(cè)

圖5(a)為N，P-CDs(曲線a)和添加Hg2＋(曲線b)、半胱氨酸(曲線c)或同型半胱氨酸(曲線d)的FL 光譜。在暴露于Hg2＋后FL 急劇下降，在加入Cys 或Hcy 后，F(xiàn)L 發(fā)射從6.2%分別恢復(fù)到90.2% 和80.4%，插圖為相應(yīng)的FL照片。隨后，通過(guò)添加不同濃度的Hg2＋來(lái)評(píng)估檢測(cè)性能。從圖5(b)可以看出，當(dāng)添加的Hg2＋濃度增加到125 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)L 逐漸猝滅，并且在很寬的范圍內(nèi)(0.05～125 μmol/L)建立了線性關(guān)系(圖5(b)的插圖)。根據(jù)3σ/k計(jì)算，檢測(cè)限為20 nmol/L。如表1 所示，與其他Hg2＋的FL 探針相比，該檢測(cè)性能具有較為明顯的競(jìng)爭(zhēng)力。如圖5(c)及其插圖所示，當(dāng)在N，P-CDs/Hg2＋復(fù)合溶液(0～200 μmol/L)中加入適量Cys 時(shí)，F(xiàn)L 相應(yīng)升高，Cys 濃度和F/F0在很寬的范圍內(nèi)也獲得了良好的線性關(guān)系(0.1～150 μmol/L，F(xiàn)0代表初始FL 強(qiáng)度)。經(jīng)計(jì)算，其檢測(cè)限為30 nmol/L，如表2 所示，與其他Cys 探針相比，顯示出相對(duì)出色的檢測(cè)能力。Hcy 具有與Cys 相似的分子結(jié)構(gòu)，僅亞甲基不同。如圖5(d)所示，該納米探針也具有很好的靈敏度識(shí)別該分子(線性范圍:0.1～100 μmol/L，檢測(cè)限:50 nmol/L)。

表1 各種Hg2+熒光探針的比較Tab.1 Comparison of various Hg2＋fluorescent probes

表2 不同Cys 探針的比較Tab.2 Comparison of different Cys probes

圖5 (a)N，P-CDs(曲線a)和添加Hg2＋(曲線b)、半胱氨酸(曲線c)或同型半胱氨酸(曲線d)的FL 光譜，插圖為對(duì)應(yīng)的FL 照片；(b)N，P-CDs 的FL 光譜；Hg2＋濃度增加時(shí)，N，P-CDs/Hg2＋與不同濃度的半胱氨酸(c)和同型半胱氨酸(d)。 λex ＝370 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為5 nm。Fig.5 (a)FL spectra of N，P-CDs(curve a) with successive addition of Hg2＋(curve b)，cysteine(curve c) or homocysteine(curve d).Insets:corresponding FL photographs.(b)FL spectra of N，P-CDs with increasing concentrations of Hg2＋.N，P-CDs/Hg2＋with different concentrations of cysteine(c) and homocysteine(d). λex ＝370 nm，excitation/emission slit width is 5 nm.

3.5 可能的傳感機(jī)理

為了進(jìn)一步探究傳感機(jī)理，針對(duì)Hg2＋加入和不加入的情況，探究了N，P-CDs 的FL 衰減和FL壽命，結(jié)果如圖6(a)～(b)所示。時(shí)間分辨譜使用雙指數(shù)函數(shù)擬合，N，P-CDs 的平均壽命為9.96 ns，而N，P-CDs/Hg2＋復(fù)合溶液的平均壽命為12.46 ns。兩個(gè)時(shí)間分辨衰變壽命τ1和τ2的貢獻(xiàn)分?jǐn)?shù)顯示在圖6(b)中。FL 壽命的差異意味著Hg2＋引發(fā)N，P-CDs 的熒光猝滅可能更傾向于遵循動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制[38-39]。鑒于此，我們推測(cè)了可能的傳感機(jī)理，圖6(c)為本文所制備N(xiāo)，P-CDs 的制備過(guò)程及傳感機(jī)理圖。本文以FA 和PMIDA 為原料制備了N，P-CDs。由于Hg2＋與N，P-CDs 表面的活性基團(tuán)結(jié)合，處于激發(fā)態(tài)的N，P-CDs 通過(guò)電荷轉(zhuǎn)移將電子給了Hg2＋，使N，P-CDs 的熒光猝滅[40-41]。而當(dāng)體系中加入半胱氨酸/同型半胱氨酸(Cys/Hcy)時(shí)，由于Hg2＋和硫醇基團(tuán)之間更強(qiáng)的相互作用，誘導(dǎo)了Hg2＋離子的釋放，因此熒光猝滅的N，P-CDs/Hg2＋體系顯示出off-on 趨勢(shì)。這種“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”過(guò)程中的形態(tài)變化可通過(guò)TEM來(lái)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7 所示。與N，P-CDs 的良好分散狀態(tài)(圖7(a))相比，N，P-CDs/Hg2＋系統(tǒng)表現(xiàn)出聚集狀態(tài)(圖7(b))。然而，當(dāng)將Cys 添加到該系統(tǒng)中時(shí)，形態(tài)又恢復(fù)到良好的分散狀態(tài)(圖7(c))，與上述推測(cè)的機(jī)理一致。

圖6 (a)FL 衰減(黑點(diǎn):N，P-CDs，紅點(diǎn):N，P-CDs/Hg2＋)；(b)N，P-CDs 中加入和沒(méi)加入Hg2＋的FL 壽命；(c)N，P-CDs制備過(guò)程及對(duì)Hg2＋和Cys/Hcy 的傳感特性示意圖。Fig.6 (a)FL decay(black dots:N，P-CDs，red dots:N，P-CDs/ Hg2＋).(b)FL lifetime of N，P-CDs with or without Hg2＋.(c)Schematic diagram of the preparation process of N，P-CDs and sensing property towards Hg2＋and Cys/Hcy.

圖7 N，P-CDs(a)、N，P-CDs/Hg2＋(b)和N，P-CDs/Hg2＋-Cys(c)的TEM 照片。Fig.7 TEM of N，P-CDs(a)，N，P-CDs/Hg2＋(b) and N，P-CDs/Hg2＋-Cys(c).

3.6 選擇性研究

Cys/Hcy 的選擇性是通過(guò)比較Cys/Hcy(100 μmol/L)與其他干擾氨基酸的FL 性能來(lái)評(píng)估的(5 mmol/L)。結(jié)果如圖8 所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)只有Cys 和Hcy 可以恢復(fù)N，P-CDs/Hg2＋的FL強(qiáng)度，其他氨基酸不會(huì)觸發(fā)FL 增強(qiáng)。主要是源于Cys/Hcy 具有—SH，與熒光猝滅的N，P-CDs/Hg2＋中的Hg2＋有更強(qiáng)的相互作用，進(jìn)而恢復(fù)熒光，因此可選擇性的實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys/Hcy 的靈敏測(cè)定，而對(duì)所述其他干擾氨基酸并不響應(yīng)。這些結(jié)果可滿足體外測(cè)定和實(shí)際應(yīng)用的選擇性要求。

圖8 N，P-CDs 對(duì)Cys/Hcy 及其他樣品選擇性研究結(jié)果圖Fig.8 Selectivity of N，P-CDs for Cys/Hcy over other species

3.7 真實(shí)樣品

鑒于實(shí)際應(yīng)用的需求，本文采用自來(lái)水和尿液驗(yàn)證實(shí)際樣品中N，P-CDs 檢測(cè)Hg2＋和Cys的可行性，并采用加標(biāo)法計(jì)算回收率。如表3 所示，Hg2＋測(cè)定的回收率在96.69%～104.50%范圍內(nèi)，測(cè)量RSD 低于4.36%。如表4 所示，尿液中Cys 的測(cè)定回收率在96.81%～104.61%之間，RSD 低于5.39%。這些結(jié)果表明基質(zhì)可能的干擾可以忽略不計(jì)，具有較為廣闊的實(shí)際應(yīng)用潛力。

表3 自來(lái)水中Hg2+的測(cè)定Tab.3 Determination of Hg2＋in tap water

表4 尿樣中Cys 的測(cè)定Tab.4 Determination of Cys in urine sample

3.8 N，P-CDs 的細(xì)胞毒性

由于細(xì)胞成像具有敏感的傳感特性，有望用于N，P-CDs 的Cys 測(cè)定。為此我們進(jìn)行了MTT 測(cè)試以分析不同劑量N，P-CDs 下BEL 7402 的存活率。如圖9 所示，隨著N，P-CDs 濃度的增加，細(xì)胞活力雖呈下降趨勢(shì)，但即使添加的N，P-CDs 濃度高達(dá)150 μg/mL 時(shí)，BEL 7402 的存活率仍保持在80.4%，因此，選擇該濃度用于隨后在BEL 7402 細(xì)胞中的FL 測(cè)定。

圖9 BEL 7402 細(xì)胞在不同濃度的N，P-CDs 下孵育24 h的存活率Fig.9 Viability of BEL 7402 cells after incubation with different concentrations of N，P-CDs for 24 h

3.9 細(xì)胞成像

如圖10 所示，在與N，P-CDs 孵育30 min 后，可以在明場(chǎng)中觀察到梭形細(xì)胞?；谏鲜觥凹ぐl(fā)依賴(lài)”行為，細(xì)胞在不同的激發(fā)下發(fā)出藍(lán)光、綠光和紅光。疊加圖像顯示，這些FL 發(fā)射位于細(xì)胞中，表明N，P-CDs 已內(nèi)化到細(xì)胞中。隨后，細(xì)胞用Hg2＋(125 μmol/L)處理，F(xiàn)L 在短時(shí)間內(nèi)(10 min)猝滅。與外源性Cys(150 μmol/L)再孵育30 min 后，F(xiàn)L 再次恢復(fù)。這些結(jié)果證實(shí)N，P-CDs 能夠感知活細(xì)胞中的Cys。

圖10 (a)～(e)N，P-CDs 處理的BEL 7402 細(xì)胞的共聚焦熒光圖像；BEL 7402 細(xì)胞與N，P-CDs 和Hg2＋(125 μmol/L，(f)～(j))一起孵育、細(xì)胞與N，P-CDs/Hg2＋和Cys 一起孵育((k)～(o))的共聚焦熒光圖像。Fig.10 Confocal fluorescence images of N，P-CDs-treated BEL 7402 cells((a)－(e))，BEL 7402 cells incubated with N，PCDs and Hg2＋(125 μmol/L，(f)－(j))，cells incubated with N，P-CDs/Hg2＋and Cys((k)－(o)).

4 結(jié) 論

本文以葉酸和N-(膦酰基甲基)亞氨基二乙酸為前驅(qū)體，成功制備了一種具有豐富氮含量(10.0%)和適當(dāng)磷摻雜的新型N，P-CDs。N，PCDs 對(duì)Hg2＋表現(xiàn)出熒光猝滅，可能是由于N，PCDs 和Hg2＋之間的電子轉(zhuǎn)移。更重要的是，基于N，P-CDs/Hg2＋的猝滅熒光，構(gòu)建了Cys/Hcy 增強(qiáng)型納米探針。利用Hg-SH 更強(qiáng)的親和力來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys/Hcy 的靈敏測(cè)定，檢測(cè)限低至30 nmol/L，優(yōu)于目前大多數(shù)用于Cys 分析的FL 探針。對(duì)于自來(lái)水和尿液等真實(shí)樣品檢測(cè)也獲得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明樣品抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。通過(guò)細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了N，P-CDs 能夠感知活細(xì)胞內(nèi)的Cys。本文所制備的N，P-CDs 因其超低的細(xì)胞毒性和出色的細(xì)胞滲透性，使得該探針在生物傳感和其他分析領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。本文專(zhuān)家審稿意見(jiàn)及作者回復(fù)內(nèi)容的下載地址:http://cjl.lightpublishing.cn/thesisDetails＃10.37188/CJL.20210389.