方曉彤，范盈盈，劉峰娟，薛 鵬，康 露，田維娜，王成

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(烏魯木齊)/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，烏魯木齊 830091；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550025；4. 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院食品技術(shù)系，北京 100176； 5.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】2019年新疆紅棗總產(chǎn)量超370×103t，比上年增長3.2%[1]。駿棗是新疆棗類的主栽品種，有和田玉棗、阿克蘇紅棗和喀什大棗[2]。駿棗中不僅富含糖類、有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，還有許多植物化學(xué)物質(zhì)如環(huán)磷酸腺苷、生物堿、皂苷、酚酸、多糖等[4]，其所含的膳食纖維和果糖有助于調(diào)節(jié)血糖水平[5]。苯甲酸又稱安息香酸、苯酸，用于制作防腐劑和定香劑[6-7]。食品中所檢出的苯甲酸來源通常分為2種，一種是常見的食品添加劑，如苯甲酸鈉等，用于高酸性水果、果汁的保鮮[8]，另一種是內(nèi)源苯甲酸，由植物自身次生代謝或微生物作用而產(chǎn)生，常見于紅棗、藍(lán)莓、蔓越莓、蜂蜜、牛乳等[9]。紅棗中的酚酸類物質(zhì)主要存在于棗皮中，以糖苷結(jié)合的形式存在[10]，棗核和棗肉中存在的多為不溶性結(jié)合型酚酸。紅棗中所檢出的苯甲酸并非人為添加，而是在生長期的次級代謝過程中苯丙烷代謝所產(chǎn)生[11]，苯丙烷代謝生成大量酚酸，其初始物苯丙氨酸由莽草酸途徑中的莽草酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用所生成[12]，苯丙氨酸再生成反式肉桂酸、香豆酸、苯甲酸和水楊酸等酚酸[13]。紅棗中生成苯甲酸的代謝途徑十分重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】牟艷莉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蜂蜜中的內(nèi)源苯甲酸來源于花朵，其肉桂酸側(cè)鏈裂解或芐醇被氧化生成苯甲醛，再經(jīng)苯甲醛轉(zhuǎn)化為苯甲酸。馬景友等[15]研究發(fā)現(xiàn)，奶酪和酸奶中的內(nèi)源苯甲酸大多是由苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而成，而牛乳中的苯甲酸是由馬尿酸轉(zhuǎn)化而成。周曉明等[16]研究表明，產(chǎn)地和紅棗品種都會影響其苯甲酸含量。苯甲酸是水楊酸的前體物質(zhì)，水楊酸是調(diào)節(jié)植物抵抗環(huán)境脅迫的重要物質(zhì)之一[17]?！颈狙芯壳腥朦c】關(guān)于紅棗中苯甲酸合成途徑機(jī)理的研究較少。亟需研究3個產(chǎn)地不同生長期駿棗中苯甲酸及其代謝途徑中相鄰3種酚酸(反式肉桂酸、水楊酸、對香豆酸)的含量?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，測定新疆3個產(chǎn)地8個生長階段駿棗中與苯甲酸及3種酚酸的含量，研究駿棗中與苯甲酸合成途徑相關(guān)的酚酸變化規(guī)律，構(gòu)建不同產(chǎn)地駿棗生長期苯甲酸合成動態(tài)變化模型，為研究紅棗中內(nèi)源苯甲酸合成途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樣品分別采摘于新疆和田地區(qū)和田縣、喀什地區(qū)葉城縣、阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣3個棗園，分別在駿棗坐果期、幼果期、膨大期、白熟期、全熟期等不同生長時期，每14 d采1次樣品進(jìn)行測定，每個果園取3個重復(fù)樣品。不同時期的樣品取樣后置于-80℃冰箱保存，后期一起測定。

試劑：苯甲酸、反式肉桂酸、對香豆酸、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.9%：Sigma公司；甲醇、乙酸、乙腈，色譜純≥99.9%：Fisher公司；氯化鈉，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂，分析純：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm有機(jī)濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

設(shè)備與儀器：1290Infinity II型高效液相色譜(Agilent公司)-TSQ Quantum Ultra型三重四極桿液質(zhì)(Thermo公司)聯(lián)用；XSE204型分析天平(METTLER TOLEDO公司)；ST-16 gR型高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品配置

準(zhǔn)確稱取定量的苯甲酸、反式肉桂酸、對香豆酸、水楊酸，配置成50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成10 mg/L的混標(biāo)，分析前過0.22 μm濾膜。

1.2.2 樣品前處理

將新鮮紅棗擦凈去核后，切分，稱取5.00 g，依次加入15 mL含1%乙酸的乙腈溶液(v/v)、1.5 g氯化鈉和6 g無水硫酸鎂，震蕩5 min，5 000 r/min條件下離心1 min。取6 mL上清液，加入450 mg無水硫酸鎂，75 mg PSA，震蕩1 min，5 000 r/min條件下離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜。

1.2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜條件：色譜柱為C18柱，規(guī)格為100×2.1(mm)，1.9 μm；流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；流動相：甲醇(A)-水(B)。離子源電壓：-3002 v，+3800 v；離子源溫度：350℃；鞘氣：35 arb；輔助氣：10 arb；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300℃；離子源類型：電噴霧離子源。表1，表2

表1 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用梯度洗脫程序Table 1 Elution by HPLC-MS/MS

表2 4種酚酸的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Optimized MS/MS instrumental parameters for the four phenolic acids

注：a:對香豆酸b:水楊酸c:苯甲酸d:反式肉桂酸

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件作圖，SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行鄧肯氏差異顯著性分析，當(dāng)P<0.05時，表示差異顯著，當(dāng)P<0.01時，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個產(chǎn)地駿棗中苯甲酸含量

研究表明，在0～28 d 3個地區(qū)的駿棗中苯甲酸含量較低，均低于3.00 mg/kg，其中喀什地區(qū)在第28 d苯甲酸含量最高，為2.65 mg/kg，是阿克蘇地區(qū)的7.11倍，是和田地區(qū)的5.41倍。阿克蘇地區(qū)和和田地區(qū)苯甲酸含量在28～42 d上升趨勢較為平緩，喀什地區(qū)駿棗苯甲酸含量在28～84 d迅速增長，顯著高于其他2個地區(qū)(P<0.05)。和田地區(qū)苯甲酸含量在第56 d是阿克蘇地區(qū)的2.86倍，差異顯著(P<0.05)。在第98 d喀什地區(qū)的苯甲酸含量為69.25 mg/kg，阿克蘇地區(qū)苯甲酸含量為63.75 mg/kg，和田地區(qū)的苯甲酸含量為58.88 mg/kg，差異顯著(P<0.05)，不同產(chǎn)地對駿棗中苯甲酸含量有顯著差異。圖2

圖2 3個產(chǎn)地駿棗中苯甲酸含量Fig.2 Benzoic acid content of jujube from three producing areas

2.2 3個產(chǎn)地駿棗中反式肉桂酸含量

研究表明，反式肉桂酸變化趨勢與苯甲酸含量相似，3個產(chǎn)地駿棗中反式肉桂酸含量在0～14 d持續(xù)保持較低的水平，在第28 d，喀什地區(qū)駿棗較其他2個地區(qū)呈現(xiàn)迅速增長趨勢，3個地區(qū)顯著差異(P<0.05)。和田地區(qū)駿棗反式肉桂酸含量在28～56 d呈現(xiàn)直線增長趨勢，喀什地區(qū)含量較為平緩，但在第56 d后，喀什地區(qū)和和田地區(qū)駿棗顯著下降至2.18和1.36 ng/kg。70 d后，3個地區(qū)駿棗中反式肉桂酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢，喀什地區(qū)駿棗增長最為迅速，阿克蘇地區(qū)駿棗次之，第98 d喀什地區(qū)駿棗含量為5.34 ng/kg，阿克蘇地區(qū)含量為4.83 ng/kg，和田地區(qū)駿棗含量為2.56 ng/kg，3個地區(qū)反式肉桂酸差異顯著(P<0.05)。圖3

圖3 3個產(chǎn)地駿棗中反式肉桂酸含量Fig.3 Trans-Cinnamic acid content of jujube from three producing areas

2.3 3個產(chǎn)地駿棗中水楊酸含量

研究表明，在第14 d，和田地區(qū)駿棗的水楊酸含量為151.67 ng/kg，阿克蘇地區(qū)駿棗為73.93 ng/kg，喀什地區(qū)駿棗為83.67 ng/kg，3個地區(qū)水楊酸含量差異顯著(P<0.05)。在28～56 d期間3個地區(qū)水楊酸含量較為接近，變化范圍不大，56 d后阿克蘇地區(qū)駿棗水楊酸含量呈現(xiàn)迅速上升趨勢，增加了12.8倍，由56 d的43.36 ng/kg增長到98 d的554.54 ng/kg，顯著高于其他2個地區(qū)，3個產(chǎn)地水楊酸含量差異顯著(P<0.05)。圖4

圖4 3個產(chǎn)地駿棗中水楊酸含量Fig.4 Salicylic acid content of jujube from three producing areas

2.4 3個產(chǎn)地駿棗中對香豆酸含量

研究表明，和田地區(qū)駿棗第0 d的對香豆酸含量為88.91 ng/kg，顯著高于其他2地區(qū)(P<0.05)，在0～28 d迅速下降。第28 d 3個地區(qū)對香豆酸含量較為接近，28～56 d，喀什地區(qū)和阿克蘇地區(qū)駿棗呈現(xiàn)下降趨勢，和田地區(qū)呈現(xiàn)先上升后下降的波動趨勢。56～70 d 3個地區(qū)含量較為接近，變化較小，70 d后喀什地區(qū)和和田地區(qū)駿棗對香豆酸含量緩慢上升，阿克蘇地區(qū)駿棗在84 d后迅速上升。第98 d阿克蘇地區(qū)駿棗對香豆酸含量為27.87 ng/kg，喀什地區(qū)駿棗為16.72 ng/kg，和田地區(qū)為15.09 ng/kg。圖5

圖5 3個產(chǎn)地駿棗中對香豆酸含量Fig.5 P-coumaric acid content of jujube from three producing areas

3 討 論

3.1 駿棗生長過程中苯甲酸含量變化及影響因素

在研究中，駿棗在0～28 d苯甲酸含量較少，與孫屏[18]和鞏志國[19]等結(jié)論一致，在青棗期苯甲酸含量較低，28 d后駿棗進(jìn)入膨大期，營養(yǎng)物質(zhì)開始積累轉(zhuǎn)化，苯甲酸含量也迅速增加。3個地區(qū)中喀什地區(qū)苯甲酸含量較高，在駿棗生長0～28 d喀什白天平均氣溫為32.3℃，和田地區(qū)為32.0℃，阿克蘇地區(qū)為31.2℃，張任等[20]研究表明，產(chǎn)地的氣象因子對駿棗中的營養(yǎng)物質(zhì)影響較大，平均氣溫就是影響駿棗關(guān)鍵指標(biāo)的氣象因子之一，Zhou等[21]研究表明，棗中苯甲酸含量與溫度相關(guān)性較大，喀什地區(qū)駿棗苯甲酸含量較高與其溫度有直接聯(lián)系。國家標(biāo)準(zhǔn)中苯甲酸允許添加量為0.5 g/kg，F(xiàn)DA要求食品中苯甲酸含量不得超過食品重量的0.1%，王群霞等[22]對生長期棗中苯甲酸含量進(jìn)行研究，駿棗中內(nèi)源苯甲酸含量高于灰棗，其在積累轉(zhuǎn)化期含量為83.0 mg/kg，孫屏等[18]對灰棗、駿棗、雞心棗中苯甲酸含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)駿棗中含量最多，達(dá)到153 mg/kg，李媛等[23]對陜北及新疆地區(qū)的8種干制紅棗進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)新疆阿克蘇地區(qū)的駿棗中苯甲酸含量最高，為87 mg/kg，試驗3個地區(qū)駿棗內(nèi)源苯甲酸含量均低于70 mg/kg，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)和FDA要求，主要原因是研究中的樣品基本為成熟紅棗，而駿棗苯甲酸含量隨著成熟度增加逐漸積累，且干制棗中的苯甲酸含量多于鮮棗。

3.2 反式肉桂酸含量對苯甲酸含量的影響

苯丙氨酸和酪氨酸發(fā)生脫氨基反應(yīng)，生成反式肉桂酸和對香豆酸[24]，反式肉桂酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為苯甲酸和水楊酸。

以喀什地區(qū)為例，駿棗中4種酚酸含量在生長初期由多到少排列順序為水楊酸>對香豆酸>苯甲酸>反式肉桂酸，在生長末期由多到少排列順序為：苯甲酸>水楊酸>對香豆酸>反式肉桂酸。苯甲酸、水楊酸和對香豆酸含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，苯甲酸含量積累最多，上升最迅速，駿棗全熟期苯甲酸含量是坐果期的53倍，而反式肉桂酸含量則呈現(xiàn)下降趨勢，其含量變化規(guī)律與轉(zhuǎn)化途徑有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。在駿棗生長0～14 d，對香豆酸含量高于反式肉桂酸，在14 d后對香豆酸含量逐漸降低，反式肉桂酸含量逐漸上升，脫氨基反應(yīng)前期生成對香豆酸較多，14 d后則主要生成反式肉桂酸，14～28 d積累的反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為大量苯甲酸，28 d后苯甲酸含量呈現(xiàn)快速上升趨勢，56 d后部分苯甲酸轉(zhuǎn)化為水楊酸，水楊酸含量逐漸增加。駿棗中苯甲酸的前體物質(zhì)反式肉桂酸含量越高，其轉(zhuǎn)化后的苯甲酸含量就越高。反式肉桂酸到苯甲酸的轉(zhuǎn)化路徑，還需要結(jié)合其代謝過程中的關(guān)鍵酶的活性做進(jìn)一步研究。

3.3 苯甲醛含量對苯甲酸含量的影響

植物苯甲酸的合成涉及并聯(lián)和交叉擴(kuò)散在多個亞細(xì)胞組分的路徑[25]，從反式肉桂酸到苯甲酸的合成，現(xiàn)已報道3種可能途徑：依賴CoA型β氧化生物合成途徑、依賴CoA型非氧化生物合成途徑、非依賴CoA型非氧化生物合成途徑[26]，苯甲醛是依賴CoA型非氧化生物合成途徑和非依賴CoA型非氧化生物合成途徑中生成苯甲酸的前體物質(zhì)，蜂蜜中的內(nèi)源苯甲酸就是由苯甲醛所轉(zhuǎn)化形成。

4 結(jié) 論

不同地區(qū)駿棗中酚酸含量差異顯著(P<0.05)，生長初期駿棗中內(nèi)源苯甲酸含量較少，28 d后進(jìn)入膨大期，苯甲酸含量逐漸增加，駿棗產(chǎn)地平均溫度越高苯甲酸含量越高，喀什地區(qū)駿棗生長的0～28 d平均溫度為32.3℃，其苯甲酸含量為2.65 mg/kg，反式肉桂酸含量越高苯甲酸含量越高，苯甲酸含量與駿棗生長時間呈現(xiàn)正相關(guān)變化趨勢，和苯甲醛含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)變化趨勢。