李嘉惠，歐曉華，劉曉瑩，盧昌華，張宏意, 2，何夢(mèng)玲, 2，嚴(yán)寒靜, 2*

基于SRAP分子標(biāo)記的何首烏種質(zhì)遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究

李嘉惠1，歐曉華1，劉曉瑩1，盧昌華1，張宏意1, 2，何夢(mèng)玲1, 2，嚴(yán)寒靜1, 2*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006

探究何首烏種質(zhì)的遺傳多樣性和居群結(jié)構(gòu)，為何首烏種質(zhì)資源的保護(hù)及合理利用提供參考。采用SRAP分子標(biāo)記方法，利用Structure 2.3.4、NTSYSpc、Popgen 32和MEGA 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得何首烏居群的多樣性水平、遺傳距離、遺傳分化程度、聚類結(jié)果和群體分析結(jié)果。何首烏野生居群遺傳多樣性大于栽培居群，多樣性主要來自居群間。野生居群中，四川和重慶居群的遺傳多樣性較高，何首烏樣品間遺傳距離與地理距離無明顯相關(guān)性；何首烏樣品的鄰接法（neighbor joining，NJ）聚類結(jié)果與地理分布相符，相同采集點(diǎn)樣品可聚在一起。結(jié)果還顯示農(nóng)戶栽培品親緣關(guān)系近，說明品種間存在相互引種情況。居群結(jié)構(gòu)分析表明，大部分何首烏樣品的血緣組成較為單一，且=16時(shí)，樣品分類效果最佳，而分類結(jié)果則與NJ聚類基本一致。SRAP分子標(biāo)記是何首烏遺傳多樣性估計(jì)和種群關(guān)系的有效分析工具，而地形復(fù)雜性可能是影響何首烏遺傳多樣性程度的重要因素，另外，廣西所產(chǎn)棱枝何首烏在何首烏種群中表現(xiàn)出特異性，與其他種源遺傳距離大，支持將其列為何首烏的變種。

何首烏；SRAP；遺傳多樣性；種質(zhì); 親緣關(guān)系

何首烏Thunb為蓼科多年生草本植物，其地下膨大的塊根，生則截瘧解毒、潤腸通便，炮制后可補(bǔ)益精血、固腎烏須，而現(xiàn)代研究表明，何首烏塊根具有調(diào)血脂和抗衰老等的作用[1]。隨著人們生活水平的提高及對(duì)保健領(lǐng)域的關(guān)注，具有補(bǔ)益功效的何首烏需求量日漸攀升，作為本品主流的野生何首烏在掠奪式的采挖中正以每年約15%的速度遞減[2]。有學(xué)者調(diào)查了我國何首烏野生品種的分布區(qū)域，并且對(duì)其蘊(yùn)藏量作了估算，發(fā)現(xiàn)調(diào)查的60多個(gè)樣方當(dāng)中，能采挖出來的一般為何首烏幼根，質(zhì)量在10 g左右，單個(gè)樣方的蘊(yùn)藏量還不足50 g，所走訪的湖北、廣西田林、貴州和河南嵩縣等地的何首烏野生品種也呈下降的趨勢(shì)[3]，而目前人工栽培的規(guī)模還未能滿足市場(chǎng)的需要，同時(shí)長期的扦插繁殖已導(dǎo)致栽培種質(zhì)的退化[4]，何首烏種質(zhì)資源正面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

植物的種質(zhì)資源，是植物在常年演化過程中，在經(jīng)歷自然選擇、人工馴化后形成的可以傳遞給下一代的遺傳物質(zhì)的總稱，凡是攜帶有遺傳信息的野生品種、栽培品種、變種和古老地方品種等都屬于種質(zhì)資源[5]。植物種質(zhì)資源的多樣性，一方面決定了植物種群在自然界中的生存能力和應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力，影響生存環(huán)境的生態(tài)平衡；另一方面，作為人類可利用的資源，它所蘊(yùn)含的遺傳物質(zhì)可以通過優(yōu)良種質(zhì)挖掘，抗性基因的篩選為人類帶來效益[6]。因此，為應(yīng)對(duì)何首烏資源日漸匱乏的境況，亟待加強(qiáng)何首烏種質(zhì)多樣性的研究，為其種質(zhì)保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

目前物種遺傳多樣性研究方法包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記方法、生化標(biāo)記方法、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記方法和分子標(biāo)記方法[5]。由于植物形態(tài)受環(huán)境的影響，因此以形態(tài)數(shù)據(jù)對(duì)種質(zhì)進(jìn)行研究往往會(huì)損失較多的遺傳多樣性，較難反映物種的真實(shí)情況，而分子標(biāo)記則是DNA分子水平的直接反應(yīng)，不受外界環(huán)境因素的影響，在植物生長的任何部位都可以檢測(cè)到，位點(diǎn)多且豐富，檢測(cè)較快[7]，因而更能代表種質(zhì)的多樣性。在植物研究領(lǐng)域一般使用的標(biāo)記方法包括了SSR、ISSR、AFLP、RFLP、RAPD和SRAP等，其中ISSR[8]、RAPD[9]和SRAP（sequence related amplified polymophism）[10]分子標(biāo)記方法在何首烏遺傳多樣性研究中已有使用。SRAP標(biāo)記方法是由Li等[11]于2001年創(chuàng)立的，相對(duì)于其它標(biāo)記方法，它具備分布普遍、可靠性和重復(fù)性高、技術(shù)難度低和多態(tài)性高等特點(diǎn)[12]，在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的研究[13]。程遠(yuǎn)輝[10]在研究重慶地區(qū)何首烏遺傳多樣性時(shí)，曾較長時(shí)間使用RAPD標(biāo)記方法進(jìn)行研究，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶少，重復(fù)性差，所以最終選擇SRAP方法進(jìn)行研究，可見SRAP標(biāo)記方法在何首烏遺傳多樣性研究上的優(yōu)勢(shì)。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用SRAP分子標(biāo)記方法，對(duì)全國12個(gè)省44個(gè)居群的327份何首烏樣品進(jìn)行研究，并以此探究我國何首烏的種質(zhì)多樣性和居群結(jié)構(gòu)，為何首烏種質(zhì)資源的保護(hù)及合理利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

于2017—2019年，采集327份樣品，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為蓼科植物何首烏Thunb.。樣品覆蓋我國12個(gè)省44個(gè)地點(diǎn)，其中218份為栽培品，109份為野生品，栽培品中包含一份棱枝何首烏（LZ），樣品詳細(xì)信息見表1、2。

1.2 方法

選用植物DNA提取試劑盒（寶生物工程有限公司，產(chǎn)品型號(hào)9768）對(duì)何首烏葉片的基因組DNA進(jìn)行提取。

利用前期篩選得到的13對(duì)引物對(duì)327份何首烏基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中反應(yīng)體系的總體積為20 μL，即10 μL premix（寶生物工程有限公司，產(chǎn)品型號(hào)RR902A），上下游引物（引物母液質(zhì)量濃度為10 ng/μL）各1 μL，DNA模板為40 ng，并用ddH20補(bǔ)充體積至20 μL，另外PCR反應(yīng)為SRAP標(biāo)記方法的一般程序，即94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃、1 min，35 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

表1 何首烏栽培品來源

Table 1 Origin of P. multiflorum cultivars

省份地點(diǎn)經(jīng)度（E）緯度（N）海拔/m時(shí)間數(shù)量/份樣品編號(hào) 廣東德慶莫村鎮(zhèn)太憲村112°05′31″23°21′56″602018-0420TX1～20 德慶新圩鎮(zhèn)大同村111°55′51″23°20′07″202018-0420DT1～20 高州石鼓鎮(zhèn)白泥塘村110°47′47″21°49′03″202017-0720BNT1～20 新興天堂鎮(zhèn)山塘角村112°01′05″22°34′36″202018-0718STJ1～18 德慶大橋村春牛亭111°47′22″23°08′26″302018-0420CNT1～20 廣西貴港109°23°?2019-0526GG1～26 貴州施秉牛大場(chǎng)鎮(zhèn)山口村107°48′44″26°20′05″800以上2018-0420SKC1～20 上海上海中醫(yī)藥大學(xué)121°35′57″31°11′39″102018-069SZY1～9* 益大本草園121°37′57″31°08′51″?1002018-06 1YD1* 愚園路121°25′57″31°13′15″702018-06 1YYL-1* 江西江西中醫(yī)藥大學(xué)115°44′43″28°40′45″602018-06 9JZY1～9* 江蘇南京中醫(yī)藥大學(xué)118°95′32″32°10′68″?2017-11 8HC1～8* 南京中醫(yī)藥大學(xué)118°94′85″32°10′54″?2017-1111YY1～11* 陜西陜西中醫(yī)藥大學(xué)108°44′19″34°19′03″343.52019-0420SXZ1～20* 河南河南中醫(yī)藥大學(xué)113°48′07″34°46′45″902019-0914HZY1～14* 廣東廣東藥科大學(xué)（原種為棱枝何首烏）113°25′12″23°03′36″?2019-11 1LZ1*

*為引種樣品，未加*為農(nóng)戶種植樣品，“?”代表無海拔數(shù)據(jù)，下表同

The introduction samples were marked with “*”, while the farmers planting samples were not marked with “*”, in addition “?” means no elevation data

表2 何首烏野生品來源

Table 2 Origin of wild P. multiflorum samples

產(chǎn)地地點(diǎn)經(jīng)度（E）緯度（N）海拔/m時(shí)間數(shù)量/份樣品編號(hào) 廣東德慶官圩金光村111°49′45″23°18′18″?2017-09 1JGC1 德慶官圩五福村111°47′39″23°15′31″ 402017-09 2WFC1～2 德慶官圩金林電站111°24′40″23°17′67″ 802017-09 1DZ1 德慶官圩酒廠111°23′23°16′?2017-09 1JC1 高要河臺(tái)112°23°?2017-09 2HT1～2 高州石鼓鎮(zhèn)白泥塘村110°47′47″21°49′03″ 202017-08 1BNT1* 肇慶鼎湖山112°33′03″23°9′42″?2017-10 1DHS1 德慶莫村鎮(zhèn)太憲村112°07′33″23°24′35″ 602017-07 2TX1～2* 云浮市大方鎮(zhèn)增西村111°34′37″22°56′46″ 962017-06 1ZXC1 茂名110°21°?2019-04 1MM1 重慶北碚區(qū)金剛碑106°24′52″29°50′23″?2017-10 5JGB1～5 北碚區(qū)西南大學(xué)106°25′55″29°49′41″?2017-10 6XNU1～6 南岸區(qū)五公里106°34′48″29°30′36″?2017-10 1WGL1 南川區(qū)重慶市藥用植物園107°12′36″29°07′48″?2019-0116ZWY1～16 四川巴中市南龕山106°45′42″31°50′44″?2017-10 2NKS1～2 巴中市平昌元山鎮(zhèn)107°10′29″31°43′13″?2017-10 1YSZ1 簡(jiǎn)陽市平泉鎮(zhèn)104°38′52″30°20′47″?2017 1PQZ1 樂山市峨眉山103°20′20″29°36′24″10352018-05 1EMS1 103°20′03″29°36′13″ 9532018-05 1EMS2 成都市武侯區(qū)林蔭街104°04′07″30°38′18″ 5192019-0410CD1～10 貴州貴陽市寶福山106°45′05″26°34′37″?2019-04 7BFS1～7 貴陽市小河106°26°32′21″?2019-04 9XH1～9 貴陽市花溪106°26°23′04″?2019-04 3HX1～3 湖南張家界賀龍公園110°29′33″29°22′53″?2018-08 1HLP1 南岳區(qū)衡山112°42′48″27°16’47″ 3602019-04 7HS1～7 112°41′40″27°17′36″11602019-04 2HS8～9 南岳樹木園112°41′38″27°17’47″12302019-04 3SMY1～3 江蘇宜興市119°34′42″31°10′36″ 902018-05 1YX1 119°33′43″31°10′35″ 902018-05 1YX2 119°33′46″31°10′27″ 902018-05 3YX3～5 安徽廣德縣119°35′49″31°05′50″ 902018-05 2GD1～2 119°35′45″31°05′44″ 902018-05 1GD3 119°35′59″31°06′02″ 902018-05 1GD4 119°36′04″31°05′40″ 902018-05 1GD5 119°36′16″31°05′41″ 1002018-05 2GD6～7 119°36′17″31°05′42″ 1002018-05 2GD8～9 黃山市浮溪村118°08′30″30°05′12″?2018-08 1FXC1 118°08′57″30°04′44″?2018-08 5FXC2～6

何首烏SRAP-PCR產(chǎn)物通過6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法進(jìn)行條帶顯示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用條帶識(shí)別軟件Quantity-One加人工識(shí)別的方式統(tǒng)計(jì)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上各泳道的條帶遷移距離，相同位置有條帶則記為“1”，無則為“0”，并建立二維數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYSpc、Popgen 32、MEGA 7和Structure 2.3.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得何首烏種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)、遺傳距離、樣品聚類和分類結(jié)果。

2 結(jié)果及分析

2.1 13對(duì)引物在何首烏種質(zhì)研究中的多態(tài)性分析

如表3所示，13對(duì)SRAP引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)范圍為17～31個(gè)，總位點(diǎn)數(shù)為318個(gè)，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為313個(gè)，所有引物均表現(xiàn)出極高的多態(tài)性，其中有9對(duì)引物多態(tài)性百分?jǐn)?shù)為100%，結(jié)果表明13對(duì)引物擴(kuò)增條帶及引物多態(tài)性豐富，SRAP分子標(biāo)記方法適用于何首烏種質(zhì)的遺傳多樣性研究。

2.2 何首烏種質(zhì)遺傳多樣性分析

何首烏種質(zhì)遺傳多樣性、居群分化及基因交流程度結(jié)果如表4所示。野生品遺傳多樣性大于栽培品，栽培品中的農(nóng)戶種植樣品，其奈氏基因多樣性（）和香農(nóng)信息指數(shù)（）均小于0.01，且多態(tài)位點(diǎn)百分比小于5%，表明以上居群遺傳多樣性較少，居群內(nèi)樣品整齊度較高，而引種樣品遺傳多樣性則相對(duì)較高；野生品種中，重慶野生居群和四川野生居群的和值分別大于0.2和0.3，其多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)分別為71.1%和66.0%，說明2居群野生何首烏遺傳多樣性較豐富；而貴州、湖南和安徽野生居群遺傳多樣性則僅次于重慶和四川，其他省份何首烏野生居群遺傳多樣性則相對(duì)較低。此外，栽培品和野生品居群間基因多樣性（t）均大于居群內(nèi)多樣性（s），說明種質(zhì)多樣性主要來自居群間。整個(gè)何首烏種質(zhì)資源的基因差異分化系數(shù)（st）為0.753 1（＞0.500），表明地方群體間遺傳分化程度大，但居群間的基因交流值（m）為0.163 9（＜1.000）說明居群間的基因交流較少。另外栽培品的分化程度極高，但基因交流則極小，推測(cè)是由于栽培過程主要采用營養(yǎng)繁殖造成的。

表3 13對(duì)SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果

Table 3 Amplified results of 13 SRAP primers combinations

引物對(duì)總位點(diǎn)數(shù)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)多態(tài)性百分?jǐn)?shù)/% ME2EM9 24 24100.0 ME2EM13 23 23100.0 ME2EM18 19 19100.0 ME2EM20 25 25100.0 ME4EM11 24 24100.0 ME6EM8 22 21 95.5 ME8EM3 25 23 92.0 ME8EM4 26 26100.0 ME15EM15 17 17100.0 ME17EM2 26 25 96.2 ME17EM9 29 28 96.6 ME17EM13 31 31100.0 ME18EM8 27 27100.0 13對(duì)引物318313 98.4 平均值24.524.1 98.4

2.3 何首烏遺傳距離和遺傳一致度

居群間的遺傳距離和遺傳一致度結(jié)果見表5。栽培品中，除德慶大橋村CNT居群外，農(nóng)戶種植品居群間遺傳一致度均大于0.89，說明農(nóng)戶栽培品種存在相互引種的情況。據(jù)調(diào)查，CNT何首烏栽培方法與德慶其他地方差異較大，且種苗一般為自留苗，推測(cè)這可能是導(dǎo)致遺傳距離較大的原因，其塊根形態(tài)與其它地區(qū)顯示出明顯差異，提示該種源的特異性。同為上海的2個(gè)栽培品YYL和YD間遺傳距離較小，而棱枝何首烏則與其他所有居群的相似度均極小，遺傳相似系數(shù)約為0.5；野生品中，廣東野生居群和農(nóng)戶栽培品的相似度極高，而貴州的野生居群和其他居群的遺傳相似性均相對(duì)較低，其值在0.6～0.8，但與四川居群的相似性最大，遺傳相似系數(shù)為0.804 6。

2.4 何首烏遺傳距離和地理距離的相關(guān)性

利用樣品的經(jīng)緯度信息，代入2點(diǎn)間地理距離公式，如公式1所示，式中1和2分別表示地方1和地方2的緯度，而1和2則表示地方1和地方2的經(jīng)度，單位為米，如圖1所示，何首烏樣品間地理距離和遺傳距離間的相關(guān)性極低，相關(guān)系數(shù)值僅為7.326×10?4，說明遺傳距離與地理距離無明顯相關(guān)性。

（1）

表4 何首烏居群遺傳多樣性

Table 4 Genetic diversity of P. multiflorum populations

居群名居群個(gè)體數(shù)NaNeHI多態(tài)位點(diǎn)數(shù)多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)/%HtHsGstNm STJ181.006 31.002 00.001 30.002 1 2 0.63 DT201.003 11.001 00.000 70.001 2 1 0.31 CNT201.012 61.006 70.004 40.006 7 4 1.26 TX201.003 11.000 70.000 60.001 1 1 0.31 BNT201.009 41.001 00.000 90.001 9 3 0.94 GG261.034 61.007 20.004 90.008 411 3.46 SKC201.000 01.000 00.000 00.000 0 0 0.00 SZY 91.242 11.167 00.093 90.137 57724.21 JZY 91.289 31.182 90.105 00.155 89228.93 YY111.207 51.135 80.076 70.113 36620.75 HC 81.072 31.049 10.027 70.040 623 7.23 SXZ201.103 81.040 20.025 90.040 83310.38 HZY141.289 31.167 90.097 40.146 19228.93 YYL 11.000 01.000 00.000 00.000 0 0 0.00 YD 11.000 01.000 00.000 00.000 0 0 0.00 LZ 11.000 01.000 00.000 00.000 0 0 0.00 廣東野生居群131.317 61.184 50.107 90.161 810131.76 重慶野生居群281.710 71.399 90.229 60.344 422671.07 四川野生居群161.660 41.357 50.205 00.311 221066.04 貴州野生居群191.496 91.255 90.150 30.228 515849.69 湖南野生居群131.449 71.232 00.136 10.207 314344.97 江蘇野生居群 51.242 11.160 80.091 50.135 0 7724.21 安徽野生居群151.503 11.273 60.162 10.245 416050.30 栽培品2181.896 21.369 80.223 40.348 221889.620.242 40.027 50.886 70.063 9 野生品1091.956 01.477 00.285 40.436 330495.600.276 30.154 70.440 20.635 8 全部樣品3271.984 31.454 90.271 70.417 931398.430.268 00.066 20.753 10.163 9

表5 何首烏居群間遺傳距離和遺傳一致度

Table 5 Genetic distance and genetic consistency between P. multiflorum populations

居群名STJDTCNTTXBNTGGSKCSZYJZYYYHCSXZHZYYYLYDLZ廣東野生居群重慶野生居群四川野生居群貴州野生居群湖南野生居群江蘇野生居群安徽野生居群 STJ****0.941 50.776 30.906 90.973 00.965 80.995 00.782 60.830 10.775 10.753 90.737 60.750 10.774 80.734 00.534 30.927 70.812 90.791 90.653 90.811 70.779 20.763 4 DT0.060 3****0.765 40.896 90.937 00.929 80.940 20.764 90.833 00.771 20.730 20.728 50.758 70.757 70.730 30.524 90.913 80.813 00.785 90.662 20.793 00.798 20.790 7 CNT0.253 20.267 4****0.830 20.791 00.783 20.781 30.783 60.849 90.789 30.739 40.716 00.723 70.779 90.762 70.491 30.821 90.792 50.783 60.608 10.785 80.758 40.739 9 TX0.097 80.108 80.186 0****0.927 90.920 30.911 90.754 30.830 30.759 30.769 50.692 70.728 70.767 20.732 60.496 70.887 80.788 50.754 20.603 30.773 80.758 30.738 6 BNT0.027 40.065 10.234 50.074 8****0.993 20.978 00.775 20.828 50.758 60.762 70.722 00.741 80.770 60.723 40.519 00.917 40.805 10.779 30.631 30.794 40.778 00.765 2 GG0.034 80.072 80.244 30.083 00.006 8****0.970 80.767 80.820 80.754 40.759 00.725 40.734 40.763 70.722 90.518 60.912 50.802 30.774 70.627 90.788 60.770 20.757 6 SKC0.005 00.061 70.246 80.092 20.022 30.029 6****0.781 70.829 40.774 70.759 10.731 40.748 90.773 60.732 70.534 60.928 10.812 10.788 50.649 10.809 30.777 40.763 9 SZY0.245 10.268 00.243 80.282 00.254 70.264 20.246 3****0.837 40.864 50.798 80.780 80.756 20.899 10.815 90.572 20.849 80.880 90.852 50.749 90.846 90.840 30.850 7 JZY0.186 20.182 70.162 60.186 00.188 20.197 50.187 10.177 4****0.827 90.788 40.751 60.780 80.811 60.787 00.556 00.890 90.869 50.831 90.676 40.846 60.801 40.820 7 YY0.254 80.259 80.236 60.275 30.276 30.281 80.255 30.145 60.188 9****0.797 90.821 60.778 60.815 20.960 90.575 50.844 20.882 90.867 60.699 40.856 50.867 40.882 0 HC0.282 50.314 40.302 00.262 00.270 90.275 80.275 60.224 70.237 70.225 8****0.717 80.727 70.780 90.773 70.540 40.779 00.804 00.779 80.640 30.768 10.803 20.759 5 SXZ0.304 40.316 70.334 00.367 20.325 70.321 00.312 80.247 50.285 60.196 50.331 6****0.750 90.745 40.775 30.576 30.779 40.812 40.857 60.680 00.777 60.797 60.824 8 HZY0.287 60.276 20.323 30.316 50.298 60.308 70.289 20.279 50.247 50.250 30.317 90.286 5****0.746 20.733 00.604 30.801 90.819 90.826 90.707 50.799 10.775 30.801 8 YYL0.255 20.277 40.248 60.265 00.260 50.269 60.256 70.106 40.208 70.204 30.247 30.293 90.292 7****0.783 00.540 90.832 40.837 40.810 10.698 70.815 20.801 50.810 6 YD0.309 20.314 40.270 90.311 20.323 70.324 40.311 00.203 40.239 50.039 90.256 60.254 60.310 60.244 6****0.544 00.800 70.827 10.802 00.648 30.808 70.835 70.833 9 LZ0.626 80.644 50.710 60.699 80.655 90.656 60.626 30.558 30.587 00.552 60.615 50.551 10.503 70.614 60.608 8****0.569 60.627 60.642 10.631 50.589 50.598 10.642 0 廣東野生居群0.075 10.090 10.196 10.119 00.086 20.091 60.074 60.162 70.115 50.169 30.249 70.249 20.220 80.183 50.222 30.562 8****0.880 50.863 00.714 10.857 60.840 70.843 8 重慶野生居群0.207 20.207 10.232 50.237 60.216 70.220 20.208 10.126 90.139 80.124 50.218 10.207 80.198 50.177 50.189 80.465 80.127 3****0.911 60.795 40.881 30.855 90.892 6 四川野生居群0.233 40.240 90.243 80.282 10.249 40.255 20.237 70.159 60.184 10.142 10.248 70.153 70.190 10.210 60.220 60.443 00.147 30.092 6****0.804 60.867 20.864 50.890 7 貴州野生居群0.424 90.412 20.497 40.505 30.459 90.465 30.432 20.287 80.391 00.357 50.445 90.385 70.346 00.358 60.433 40.459 70.336 80.228 90.217 4****0.764 30.702 00.785 0 湖南野生居群0.208 60.232 00.241 10.256 50.230 20.237 50.211 50.166 20.166 60.154 90.263 90.251 50.224 20.204 30.212 30.528 40.153 60.126 40.142 50.268 7****0.848 40.876 8 江蘇野生居群0.249 50.225 40.276 60.276 70.251 00.261 10.251 80.174 10.221 50.142 30.219 10.226 20.254 50.221 30.179 50.514 10.173 50.155 60.145 70.353 90.164 4****0.887 0 安徽野生居群0.270 00.234 80.301 30.302 90.267 60.277 60.269 30.161 70.197 60.125 50.275 10.192 70.220 90.210 00.181 60.443 20.169 80.113 60.115 70.242 10.131 40.1199****

“****”上方為居群間的遺傳一致度，“****”下方為居群間的遺傳距離

The top of “****” in the table is the genetic consistency between populations, and the bottom of “****” is the genetic distance between populations

圖1 何首烏樣品間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性

2.5 何首烏樣品的聚類分析和主成分分析

采用鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建何首烏樣品的聚類樹，結(jié)果如圖2所示。何首烏樣品主要分成4大分支，第1分支為棱枝何首烏，它與其它種源表現(xiàn)出明顯的不同，因此獨(dú)立成支；第2分支包括四川的EMS1-2和貴州的所有野生品，而河南鄭州的樣品則聚類為第3支，其余的所有樣品組成第4分支。第4分支中，農(nóng)戶種植的栽培品相似度較高，聚為一小支，而廣東野生品則分散聚類在該小支中，此外，除重慶和四川的樣品聚類結(jié)果較為分散外，其余采自相同省份和相同地點(diǎn)的樣品基本能聚在一起，說明重慶和四川的野生品遺傳多樣性較大，樣品間存在較大差異。

樣品主成分分析分布圖見圖3，圖中樣品距離越小代表樣品間的遺傳關(guān)系越接近，反之則說明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。利用主成分分析對(duì)樣品進(jìn)行分類，主要可以把何首烏樣品分成3個(gè)類群，分類結(jié)果和NJ聚類結(jié)果相似，棱枝何首烏單獨(dú)作為一個(gè)類群，第2類群為貴州省的所有樣品和四川峨眉山的2個(gè)樣品，而第3類群則由其他樣品組成。

幾何形狀代表何首烏樣品，空心圖形為栽培品，實(shí)心為野生品，其中填充顏色相同即代表該野生何首烏來自相同的省份

圖3 何首烏樣品主成分分析

2.6 何首烏群體結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3.4軟件對(duì)何首烏種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，假定群體數(shù)目值為1～23，每個(gè)值重復(fù)運(yùn)算10次，根據(jù)Evanno等[14]的方法計(jì)算出Δ值，如圖4所示，結(jié)果表明當(dāng)＝16時(shí)，其Δ值最大，說明種群分成16個(gè)類群時(shí)最佳，并由此獲得群體結(jié)構(gòu)圖，如圖5所示，不同顏色代表不同類群，每個(gè)長方形表示一個(gè)樣品，縱坐標(biāo)為各類群種質(zhì)占其祖先成分的比例，根據(jù)劉麗華等[15]的研究，單個(gè)樣品某血統(tǒng)≥0.600說明該樣品血統(tǒng)及遺傳基礎(chǔ)較單一，可歸類到對(duì)應(yīng)的類群中，＜0.600則具有混合血緣，即遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜且沒有明確的類群歸屬特性，經(jīng)樣品歸納如表6所示，何首烏327份樣品中，319份樣品在某一類群中的≥0.600，說明何首烏群體中大部分種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，而EMS（1～2）、HLP1、JGB1、DZ1、JGC1及HT（1～2）樣品則血統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜。此外結(jié)果還表明，相同采集點(diǎn)樣品血緣組成相似，可大致歸在同一類群中，其中除CNT血統(tǒng)較為特殊外，其余農(nóng)戶栽培品遺傳基礎(chǔ)相同均歸為一類。和NJ聚類相似，群體結(jié)構(gòu)的分類是NJ聚類4大分支基礎(chǔ)上的細(xì)分和調(diào)整，不同的地方是在NJ聚類圖中單獨(dú)成支的棱枝何首烏（LZ）此處則與重慶和四川的野生品WGL1、PQZ1和YSZ1分在同一類。

圖4 ΔK值運(yùn)算結(jié)果

3 討論

3.1 SRAP分子標(biāo)記方法在何首烏種質(zhì)研究中的有效性

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)研究何首烏栽培和野生種群的遺傳多樣性，其擴(kuò)增條帶及多態(tài)性條帶較豐富，且通過SRAP標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)種群進(jìn)行劃分，分類結(jié)果和種質(zhì)來源相符，證明該方法能夠反映何首烏種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳差異的真實(shí)情況，目前相關(guān)研究也證明，SRAP分子標(biāo)記是遺傳多樣性估計(jì)和種群關(guān)系的有效分析工具[16]。

3.2 何首烏居群遺傳多樣性

經(jīng)種質(zhì)遺傳多樣性分析，野生居群的多樣性大于栽培居群，盡管引種品居群內(nèi)及居群間樣品存在一定的遺傳多樣性，但由于農(nóng)戶種植品種存在相互引種的情況，且居群內(nèi)種源一致度較高，因此相較于野生居群，栽培品居群整體的多樣性較低。而野生居群中，四川和重慶居群的遺傳多樣性較高，湖南、貴州和安徽居群次之，而廣東和江蘇居群相對(duì)較低。通過地形分析發(fā)現(xiàn)，四川、重慶位于我國西南地區(qū)，地處第1和第2階梯中，地形海拔高、重巒疊嶂、復(fù)雜多變，湖南和安徽雖處于第3階梯，然而兩地樣品采集地分別為衡山和黃山，海拔較高，而貴州的3個(gè)樣品采集點(diǎn)也位于云貴高原中，其它采樣點(diǎn)則處于南方丘陵地區(qū)和華東、華中平原地帶，由此可見，地形復(fù)雜性和海拔可能是影響遺傳多樣性程度的重要因素。也有研究發(fā)現(xiàn)利用ISSR[8]技術(shù)，野生和栽培何首烏的多樣性無明顯差異，經(jīng)核對(duì)文獻(xiàn)，本課題組認(rèn)為樣品采集數(shù)量和采樣點(diǎn)分布范圍及研究方法的不同造成了結(jié)果的不一致。此外，基因交流是減少遺傳漂變的重要途徑，然而何首烏為自交物種[10]，因此居群基因交流少，而遺傳分化程度高。

圖5 何首烏群體結(jié)構(gòu)

表6 何首烏樣品分類結(jié)果

Table 6 Classification results of P. multiflorum samples

Q值組別樣品編號(hào) ≥0.6001TX（1～20）、DT（1～20）、BNT（1～20）、STJ（1～18）、GG（1～26）、SKC（1～20）、JZY（1～9） 2CNT（1～20） 3SZY（1～9）、YD1、YYL1、YY（1～11） 4HC（1～8） 5SXZ（1～20）、CD（1～10） 6HZY（1～14） 7LZ1、WGL1、PQZ1、YSZ1 8WFC（1～2）、JC1、DHS1、BNT*1、ZXC1、MM1、TX*（1～2） 9JGB（2～5） 10XNU（1～6） 11ZWY（1～16） 12NKS（1～2） 13BFS（1～7）、XH（1～9）、HX（1～3） 14HS（1～9）、SMY（1～3） 15YX（1～5）、FXC（1～6） 16GD（1～9） ＜0.600EMS（1～2）、HLP1、JGB1、DZ1、JGC1、HT（1～2）

3.3 遺傳距離和地理距離的關(guān)系

研究結(jié)果表明何首烏樣品間遺傳距離與地理距離無明顯相關(guān)性。首先栽培品存在相互引種的情況，再者西南地區(qū)地形復(fù)雜，居群多樣性高，盡管西南地區(qū)內(nèi)部采樣點(diǎn)相距較近，但地形差異造成的遺傳分化致使遺傳距離相對(duì)較大，2個(gè)原因共同導(dǎo)致兩者不呈明顯的相關(guān)性。

3.4 NJ聚類結(jié)果和STRUCTURE居群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果及比較

NJ聚類和STRUCTURE群體分析是種質(zhì)親緣關(guān)系研究及樣品分類的方法，相較于NJ聚類，STRUCTURE既可以研究每個(gè)樣品的血統(tǒng)構(gòu)成，還可以明確種群的最佳類群數(shù)，而聚類分析則是根據(jù)樣品間的差異程度進(jìn)行分類，類群數(shù)一般為人為所定，缺乏一定的科學(xué)性，不過聚類圖能清楚呈現(xiàn)類群間的親緣關(guān)系，因此結(jié)合2種方法能更深入地探究種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)。

利用遺傳距離構(gòu)建的聚類結(jié)果和以STRUCTURE軟件獲得的居群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果對(duì)種源的分類基本一致，聚類特點(diǎn)與已有研究相似，即聚類結(jié)果與地理分布相符，相同采集點(diǎn)樣品可分在同一類中[8-10,17-19]。群體結(jié)構(gòu)分析顯示，大部分何首烏樣品的血緣組成較單一，相同采集點(diǎn)樣品血緣組成相似，可大致歸在同一類群中，其中除CNT血緣較為特殊外，其余農(nóng)戶栽培品遺傳基礎(chǔ)相同均歸為一類。值得關(guān)注的結(jié)果是農(nóng)戶種植品種和廣東野生品種聚為一支，說明樣品間親緣關(guān)系較接近，從側(cè)面可反映目前農(nóng)戶栽培品可能由廣東野生品種馴化而來，并且廣東野生品間并未出現(xiàn)明顯分化。另外，四川EMS和貴陽的樣品與其它樣品遺傳距離大，獨(dú)立成支，有研究人員在何首烏種質(zhì)研究中也發(fā)現(xiàn)，貴州居群葉片側(cè)葉脈有較大程度的白斑，同時(shí)該居群與其它居群遺傳距離較大，基因交流值僅為0.01[8]，而本實(shí)驗(yàn)也同樣發(fā)現(xiàn)貴陽的居群葉脈有較大的白斑，可能是樣品位于云貴高原的特殊地形所致。同時(shí)，棱枝何首烏在何首烏種群中表現(xiàn)出極大的特異性，與其他種源遺傳距離大，支持將其列為何首烏的變種。

上述結(jié)果可以把何首烏種質(zhì)特點(diǎn)總結(jié)為：由于較快的遺傳進(jìn)化速度，為適應(yīng)多變的環(huán)境，何首烏形成不同的地理種源，相同環(huán)境下何首烏遺傳距離小，相似度較高，且血緣組成相同，而地理距離較近，但不同地形環(huán)境的何首烏存在差異，因此地形的復(fù)雜性和海拔是何首烏種群遺傳多樣性的重要影響因素。由于何首烏為自交的物種，基因交流少，因此地理環(huán)境所造成的居群遺傳分化未能通過基因交流而得到減少，所以何首烏居群間的遺傳分化較大，最終導(dǎo)致何首烏大部分樣品的血統(tǒng)組成單一，但是不同生長環(huán)境居群的血緣組成不同的現(xiàn)象。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Genetic diversity and population structure ofgermplasm based on SRAP molecular marker

LI Jia-hui1, OU Xiao-hua1, LIU Xiao-ying1, LU Chang-hua1, ZHANG Hong-yi1,2, HE Meng-ling1,2, YAN Han-jing1,2

1.School of Traditional Chinese medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Key Laboratory of Production & Development of Cantons Medicinal Materials, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

Toinvestigate the genetic diversity and population structure ofgermplasm, in order to provide reference for the protection and rational utilization ofgermplasm resources.Base on SRAP molecular marker method, the diversity level, genetic distance, genetic differentiation degree, clustering results and population analysis results ofpopulation were obtained by using Structure 2.3.4, NTSYSpc, Popgen 32 and MEGA 7 software to make statistics on the data.The genetic diversity ofwas mainly from intergroup, and the genetic diversity of wild population was greater than that of cultivated population. In the wild population, the genetic diversity was high in Sichuan and Chongqing population, and the genetic distance between samples ofhad no obvious correlation with geographical distance; The NJ clustering results of the samples were consistent with the geographical distribution, and the samples from the same collection point could be clustered together. In addition, the results also showed that the cultivars of peasant households were closely related, indicating the existence of mutual introduction between the cultivars. Population structure analysis showed that most samples had single consanguinity, and the best classification result which was consistent with NJ clustering result could be obtained when= 16 was used.SRAP molecular marker technique is an effective analysis tool for genetic diversity estimation and population relationship studies of. The complexity of terrain may be an important factor affecting the genetic diversity of. In addition,var.from Guangxi shows specificity inpopulation and has a large genetic distance from other provenances, therefore, it is suggested to classify it as a variety of.

Thunb.; SRAP; genetic diversity; germplasm

R286.12

A

0253 - 2670(2022)07 - 2115 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.022

2021-08-09

廣東省科技廳項(xiàng)目（2017A020213023）

李嘉惠（1994—），女（漢族），廣東肇慶人，碩士研究生，主要從事中藥資源開發(fā)與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究工作。E-mail: 787517019@qq.com

嚴(yán)寒靜（1972—），女（漢族），重慶人，碩士研究生導(dǎo)師，博士學(xué)位，主要從事中藥資源開發(fā)與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究工作。E-mail: yanhanjing1211@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]