張 超，梁 舒，郭占非，左淑飛，范文強

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院、新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院風濕免疫科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

類風濕性關節(jié)炎(RA)是臨床常見自身免疫性疾病，主要病理特征為炎性細胞浸潤、新生血管形成血管翳、關節(jié)滑膜細胞增生、軟骨和骨結構破壞，主要臨床常表現(xiàn)為關節(jié)腫脹、麻木、變形、僵硬、足跛難行，嚴重者會致使關節(jié)畸形、骨強直、殘疾，甚至是功能喪失[1,2]。全球類風濕性關節(jié)炎人數(shù)占總人口的1.00%，成年人患病率高達2～4/10000，我國類風濕性關節(jié)炎患病人數(shù)高達540萬，患病率為0.5%，年齡越大，患病率越高，在60歲以上人群中，患病率高達40.00%，嚴重影響患者生命質量。成纖維樣滑膜細胞(FLS)是導致骨關節(jié)破壞、滑膜組織增生的主要效應細胞，在RA患者發(fā)病過程中，F(xiàn)LS呈“瘤樣增生”、異?；罨癄顟B(tài)，因此，對FLS的活性狀態(tài)研究具有重要意義[3]。在RA患者中，微小R-142-3P(miR-142-3P)呈升高狀態(tài)，而解聚素金屬蛋白酶17(ADAM17)與miR-142-3P由靶向關系[4]，故本研究旨在觀察miR-142-3P靶向ADAM17對RA-FLS活性的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

10%胎牛血清(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)，2.5g/L胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基(北京澤平科技有限責任公司)，100U/mL青鏈霉素雙抗(浙江羽翔生物科技有限公司)，RIPA裂解液、PVDF膜、TBST、Lipofectamine2000(北京伊塔生物科技有限公司)，50g/L脫脂奶粉(北京百奧萊博科技有限公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。

1.2 細胞來源及培養(yǎng)

于中科院上海細胞庫購買RA-FLS、12份類風濕關節(jié)炎-外周血單個核細胞(RA-PBMC)、3分正常人外周血單個核細胞(PBMC)，12份類風濕關節(jié)炎-外周血單個核細胞(RA-PBMC)，隨機分為4個RA-PBMC組，每組3份，3份正常人外周血單個核細胞(PBMC)記為正常PBMC組，RA-FLS采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，RA-PBMC、PBMC采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有100U/mL青鏈霉素雙抗及10%胎牛血清，均放于5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度為37℃，培養(yǎng)過程采用顯微鏡觀察細胞生長情況，生長至密度達80%，給予2.5g/L胰蛋白酶消化，給予其傳代。

1.3 檢測靶向解聚素金屬蛋白酶17(ADAM17)和微小R-142-3P(miR-142-3P)表達情況

(1)選擇1組RA-PBMC及1組正常PBMC， 采用Western blot法檢測檢查ADAM17表達情況，細胞總蛋白采用RIPA裂解液提取，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白轉移至PVDF膜，給予50g/L脫脂奶粉封閉，封閉溫度為常溫，封閉1h，封閉完成后加入一抗，孵育過夜，孵育溫度為4℃，再給予TBST洗滌3次，每次洗滌10min，加入二抗，孵育1h，孵育溫度為常溫，再給予TBST洗滌3次，每次洗滌10min，化學發(fā)光液顯色，以β-actin為內參，采用光密度分析法計算蛋白表達情況。采用實時熒光定量PCR檢測miR-142-3P ，采用Trizol試劑提取RA-PBMC、正常PBMC中總RNA水平，并合成cDNA，以此為模板進行PCR測定，嚴格按照時熒光定量PCR試劑盒說明書操作，以U6為內參，計算miR-142-3P 表達水平，算法為2-ΔΔCt 。

1.4 過度表達ADAM17和miR-142-3P的RA-PBMC對RA-FLS凋亡及增殖的影響

將3組RA-PBMC隨機分為空白對照組、過度ADAM17組、過度miR-142-3P組，每組3個，RA-FLS接種于Transwell小室下室，將RA-PBMC接種于Transwell小室上室，給予Lipofectamine2000轉染相應質粒，收集RA-FLS，檢測細胞增殖活性和凋亡情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 RA-PBMC組、正常PBMC組中ADAM17和miR-142-3P表達情況比較

RA-PBMC組中ADAM17水平低于正常PBMC組，RA-PBMC組中miR-142-3P水平高于正常PBMC組(P<0.05)，見表1 。

表1 RA-PBMC組、正常PBMC組中ADAM17和miR-142-3P表達情況

2.2 RA-FLS凋亡率、增殖活性比較

過度miR-142-3P組RA-FLS凋亡率高于空白對照組(P<0.05)，RA-FLS增殖活性低于空白對照組(P<0.05)；過度ADAM17組RA-FLS凋亡率低于空白對照組，RA-FLS增殖活性高于空白對照組(P<0.05)，見表2 。

表2 3組RA-FLS凋亡率、增殖活性比較

3 討論

RA是臨床常見疑難病之一，環(huán)境、性激素、遺傳、微生物感染等均是RA誘發(fā)因素[5]。RA是以滑膜病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊。げ∽冎饕獮檠仔约毎?、骨組織損傷、血管翳形成、侵蝕性軟骨、滑膜增生，伴隨不可逆性、進行性關節(jié)破壞、畸形及功能喪失[6]?；ぜ毎删奘杉毎癋LS組成，其中FLS是滑膜細胞的主要成分，對滑膜細胞的活性、遷移、凋亡等具有影響作用[7]。miRNA是一種內源性非編碼RNA，參與細胞的生長、增殖、分化等，在RA的發(fā)展中具有重要作用，其miR-142-3P高表達于系統(tǒng)性硬化癥，參與自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展，與類風濕因子水平呈正相關，在RA中發(fā)揮重要作用[8]。ADAM17是一種轉換酶，可通過裂解各種跨膜蛋白及其受體調控基因表達，還可釋放生物活性因子、活化配體，是抵御感染、傷害的第一道防線，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3P與ADAM17有靶向調控作用，可調控FLS活性[4]。為進一步了解影響RA-FLS活性因素，本次研究旨在觀察miR-142-3P靶向ADAM17對RA-FLS活性的影響。

本研究對正常PBMC及RA-PBMC中miR-142-3P、ADAM17表達進行檢驗，發(fā)展RA-PBMC組中ADAM17水平低于正常PBMC組，RA-PBMC組中miR-142-3P水平高于正常PBMC組，說明RA-PBMC中ADAM17呈低表達狀態(tài)，miR-142-3P呈高表達狀態(tài)。進一步觀察miR-142-3P、ADAM17對RA-FLS活性及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)過度miR-142-3P組RA-FLS凋亡率高于空白對照組，RA-FLS增殖活性低于空白對照組；過度ADAM17組RA-FLS凋亡率低于空白對照組，RA-FLS增殖活性高于空白對照組，說明miR-142-3P與RA-FLS活性呈負相關，ADAM17與RA-FLS活性呈正相關。

綜上所述，RA-PBMC中ADAM17呈低表達狀態(tài)，miR-142-3P呈高表達狀態(tài)，miR-142-3P與RA-FLS活性呈負相關，ADAM17與RA-FLS活性呈正相關。