陳暉寬，黃雪琴，何若云，羅玉瓊，陳信偉，羅國(guó)慶

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院， 廣東 湛江 524001)

喉癌是頭頸部常見的一種惡性腫瘤，由于其發(fā)病位置較為特殊，嚴(yán)重的影響到患者的生活質(zhì)量。除常規(guī)手術(shù)治療，大部分的喉癌患者需要結(jié)合化療，研究證實(shí)順鉑(cisplatin，DDP)是喉癌等相關(guān)腫瘤的一線化療藥物，具有良好的治療效果[1]。然而，伴隨長(zhǎng)期化療藥物使用喉癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性明顯降低，嚴(yán)重地影響了DDP的治療效果[2]。但是目前有關(guān)喉癌細(xì)胞對(duì)DDP耐藥的機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞凋亡和增殖是腫瘤細(xì)胞惡性病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)控凋亡和增殖在腫瘤細(xì)胞化療敏感性中發(fā)揮重要作用[3]。賴氨酰氧化酶樣蛋白-2(Lysyl oxidase-like 2 protein，LOXL2)最初是從衰老成纖維細(xì)胞中分離出來，是一種分泌性蛋白[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)LOXL2參與了多種腫瘤，如胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。另外，基因沉默LOXL2能夠抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。以上研究表明LOXL2可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子之一。但是目前有關(guān)LOXL2對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡和DDP化療敏感性的影響尚不清楚。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)喉癌細(xì)胞株Hep2，探究LOXL2對(duì)細(xì)胞凋亡和DDP化療敏感性的影響，以期為喉癌的治療提供新的可能性靶標(biāo)分子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑

人喉鱗癌Hep2細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：4030ES20)；MTT檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C0009S)；細(xì)胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、BCA試劑盒、一抗稀釋液、山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗稀釋液和ECL發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq以及TRIzol Reagent(日本Takara公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；LOXL2兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：9047)；β-actin小鼠單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：AF5001)；DDP(山東齊魯制藥有限公司)。

1.1.2 主要儀器

細(xì)胞勻漿儀(武漢泰普拓公司，型號(hào)：TWK-FST32)；高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)：Micro17R)；倒置熒光顯微鏡(日本尼康(Nikon)公司，型號(hào)：GPJ9-TS100-F)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)：FC)；電泳儀(美國(guó)伯樂Bio-Rad公司，型號(hào)：1658033)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

Hep2細(xì)胞采用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM并置于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng)，待生長(zhǎng)融合度達(dá)80%～90%時(shí)，傾去培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化3min至細(xì)胞呈現(xiàn)卵圓形，10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行傳代處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control)、轉(zhuǎn)染LOXL2無關(guān)片段組(LOXL2-NC)、轉(zhuǎn)染LOXL2 siRNA組(LOXL2-siRNA)以及轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染Lipofectamine 2000組(Lipofectamine 2000)組。

1.2.2Westernblot檢測(cè)LOXL2蛋白表達(dá)水平

Hep2細(xì)胞碾磨，渦旋(5min/次)，冰上裂解1h；之后利用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度并按照30μg/孔上樣計(jì)算得出各組上樣體積；制備濃縮膠與分離膠凝膠，上樣；電泳90min；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜120 min；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)LOXL2兔單克隆抗體(1：1000)，β-actin小鼠單克隆抗體(1：2000)，4℃過夜，孵育對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1：5000)1～2h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。LOXL2蛋白表達(dá)表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。將消化后的Hep2細(xì)胞按照96孔板密度為：1×104/孔接種，細(xì)胞分別貼壁生長(zhǎng)24h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT溶液10μL(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去細(xì)胞上清，每孔加入150μL的DMSO震蕩10min，使得充分溶解，酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為570nm檢測(cè)各孔的吸光度值，以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞的增殖活力。細(xì)胞增殖率(%)=各處理組細(xì)胞OD/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，PBS潤(rùn)洗3遍，離心后傾去細(xì)胞液，細(xì)胞重懸將濃度調(diào)整為1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，在488nm處，分別激發(fā)525nm和620nm帶孔濾波器，檢測(cè)FITC和PI熒光，從而得到5組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep2細(xì)胞，按照5×105個(gè)/孔濃度接種于6孔板內(nèi)，每組各5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24h，按照1.2.1方法分組，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度80%～90%時(shí)，對(duì)上述各組細(xì)胞加入DDP干預(yù)處理，終濃度為0.00、0.01、0.10、1.00以及10.00mg/L。胰蛋白酶消化處理并將各組細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，并按照50、100以及200個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿梯度稀釋后進(jìn)行集中培養(yǎng)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散均勻。于100×顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。集落形成率(%)=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。集落抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組集落形成率/對(duì)照組集落形成率)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LOXL2-siRNA轉(zhuǎn)染至Hep2細(xì)胞對(duì)LOXL2表達(dá)的影響

與Control組相比，LOXL2-siRNA組細(xì)胞LOXL2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，LOXL2-NC 組和Lipofectamine 2000組細(xì)胞LOXL2蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05)，見圖1。

圖1 LOXL2蛋白表達(dá)水平

2.2 LOXL2-siRNA對(duì)Hep2細(xì)胞周期和凋亡的影響

與Control組相比，LOXL2-siRNA組細(xì)胞G0/G1期比率以及凋亡指數(shù)升高(P<0.01)，S期以及G2/M期細(xì)胞降低(P<0.01)，LOXL2-NC 組和Lipofectamine 2000組細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)均無顯著變化(P>0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)的比較

2.3 LOXL2-siRNA對(duì)Hep2細(xì)胞化療敏感性的影響

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DDP處理Control組相比，不同濃度DDP處理LOXL2-siRNA組細(xì)胞克隆形成率均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，DDP處理LOXL2-NC 組和Lipofectamine 2000組細(xì)胞克隆形成率無明顯變化(P>0.05)，見圖2。MTT檢測(cè)顯示在同一DDP藥物濃度下，與Control組相比，LOXL2-siRNA組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，LOXL2-NC 組和Lipofectamine 2000組細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

圖2 各組細(xì)胞克隆形成率

圖3 各組細(xì)胞存活率比較

3 討論

LOXL2是一種分泌性蛋白，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞系中LOXL2蛋白呈高表達(dá)，且LOXL2表達(dá)上調(diào)與乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)[7]。但是目前有關(guān)LOXL2對(duì)喉癌疾病進(jìn)展的影響尚不清楚。細(xì)胞凋亡是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的主要方式。另外，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖亦是喉癌細(xì)胞惡性病變的關(guān)鍵[8]。因此，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的平衡是抑制腫瘤惡性病變的關(guān)鍵?；贚OXL2在腫瘤中的作用，本研究推測(cè)其可能參與喉癌細(xì)胞增殖和凋亡的過程。為此，本實(shí)驗(yàn)首先通過基因沉默LOXL2觀察Hep2細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示與Control組相比，轉(zhuǎn)染LOXL2-siRNA組細(xì)胞LOXL2蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，初步表明LOXL2參與喉癌細(xì)胞的凋亡過程，抑制LOXL2表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。長(zhǎng)期的DDP化療會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞化療敏感性降低，其機(jī)制涉及多種途徑，包括增殖、凋亡、侵襲和遷移等[9]。喉癌細(xì)胞化療敏感性的降低也是制約其治療的關(guān)鍵。因此，積極探尋喉癌細(xì)胞化療敏感性的發(fā)生機(jī)制尤為重要。為此，本研究通過設(shè)置不同濃度的DDP處理Hep2細(xì)胞，觀察LOXL2-siRNA對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示沉默LOXL2能夠抑制Hep2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增加DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。以上研究表明LOXL2在喉癌細(xì)胞增殖、凋亡以及化療敏感性中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)LOXL2是通過何種途徑影響喉癌細(xì)胞凋亡和化療敏感性尚不清楚。既往研究顯示LOXL2能夠通過Snail、PI3K/Akt以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[10]。為此，本研究后續(xù)將探究LOXL2對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡和化療敏感性的相關(guān)作用機(jī)制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過探究LOXL2對(duì)人喉鱗癌Hep2細(xì)胞凋亡、增殖及化療敏感性的影響。結(jié)果顯示沉默LOXL2能夠抑制Hep2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及增加Hep2細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。以上研究結(jié)果為喉癌的化療提供了新的作用機(jī)制。