張國(guó)梁，吳 江，王佳琦，魏 巍，宋振宇，任寶瑞

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

近年來(lái)，口腔癌癥已經(jīng)成為全球性健康難題之一[1]。我國(guó)的口腔癌主要以口腔鱗狀細(xì)胞癌為主，約占口腔癌的95%，是世界上12種最常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤之一[2,3]?？谇击[狀細(xì)胞癌以分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為特征，易出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有明顯的高侵襲性的鱗狀上皮細(xì)胞癌[4,5]。主要發(fā)生于舌、牙齦、頰黏膜、唇黏膜、腭部、上頜竇等部位[6,7]。其中舌鱗狀細(xì)胞癌在OSCC中最常見(jiàn)，具有典型性特點(diǎn)，多發(fā)生于舌緣、舌尖、舌背部位。患者預(yù)后差，生存率低，而且OSCC晚期患者會(huì)影響咀嚼、呼吸、吞咽等口腔功能，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[8～10]。因此，研究口腔鱗癌的轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制，具有一定的臨床意義。

20世紀(jì)70年代，Kato等從子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中分離出一種腫瘤特異性抗原，最初命名為“TA-4”，又稱為鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen， SCCA)，屬于內(nèi)源性蛋白酶抑制劑的SERPIN家族成員，與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌晚期密切相關(guān)[11]。具有抑制溶酶體組織蛋白酶作用的SERPINB3，在子宮頸、食管、頭頸部、舌、肝臟等粘膜上皮鱗癌中高表達(dá)，但在上述部位的正常鱗狀上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)不表達(dá)或低表達(dá)[12,13]。關(guān)于SERPINB3基因在口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的研究甚少，本研究主要探討SERPINB3基因與口腔鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(TCA8113)。含SERPINB3 shRNA的慢病毒購(gòu)自Genecopoeia, 其作用靶點(diǎn)分別為：shRNA1: 5’-GATGAGGCAATACACATCTTT-3’；shRNA2：5’-GCACAACAGATTAAGAAGGTT-3’；shRNA3:5’-GGTAATATTGGCAGCAATACC-3’。三個(gè)質(zhì)粒中均含有嘌呤霉素抗性基因及EGFP標(biāo)簽。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

利用含10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)TCA8113細(xì)胞。每隔3天傳代一次，以保證細(xì)胞的活性狀態(tài)。

1.3 SERPINB3基因敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選

將TCA8113細(xì)胞按照2.0×105個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于6孔板中，培養(yǎng)16h后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，進(jìn)行SERPINB3 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：

將TCA8113細(xì)胞在4℃條件下冷凍處理2h；轉(zhuǎn)染前，利用完全培養(yǎng)基將病毒稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?每孔加入病毒4.5μL(2.08×108TU/mL)，MOI ≈ 1)，同時(shí)加入Polybrene(索萊寶，貨號(hào)：H8761)至其終濃度為5μg/mL，充分混合均勻；利用PBS對(duì)細(xì)胞清洗三次；加入上述稀釋好的含病毒顆粒的培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)基更換為新鮮的不含病毒的完全培養(yǎng)基；在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)72h后，加入終濃度為1μg/mL的嘌呤霉素；再培養(yǎng)24h，待未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞完全死亡后，更換培養(yǎng)基為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，即得SERPINB3基因被穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系。

1.4 Western blotting檢測(cè)

首先收集細(xì)胞，加入含PMSF的RIPA 裂解液獲得細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行BCA定量，蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，根據(jù)ECL發(fā)光試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行顯影和定影，照相，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選用的內(nèi)參基因?yàn)槭罂谷甩? Actin (Abcam, ab6276)，兔SERPINB3抗體(Abcam, ab154971)。目標(biāo)基因SERPINB3曝光、顯影后，再依次用蒸餾水處理10min，0.2 M NaOH處理10min，蒸餾水處理10min，把SERPINB3抗體剝離，之后再?gòu)姆忾]那步開(kāi)始，然后孵育抗體β-Actin，曝光、顯影。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組為Control組和SERPINB3敲低組，將野生型TCA8113細(xì)胞系以及SERPINB3 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系分別按照3.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于6孔板，培養(yǎng)16h后，利用無(wú)菌吸頭均勻地在培養(yǎng)皿中進(jìn)行劃線。利用PBS對(duì)細(xì)胞清洗3次后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，并分別測(cè)量0h、24h、48 h劃痕的寬度，最后根據(jù)劃痕寬度變化評(píng)估細(xì)胞遷移能力的改變，具體公式如下：

遷移率 =(0h寬度 -t時(shí)間寬度)/ 0h寬度，其中t為劃痕寬度檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)。

最后，將上述所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 6.0軟件分析。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Transwell實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組為Control組和SERPINB3敲低組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，以1:8的比例稀釋基質(zhì)凝膠，并涂覆Transwell室底膜的上表面，室溫風(fēng)干5h后，加入50μL 含0.1% BSA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基并于37℃條件下孵育30min以水化基質(zhì)膠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照4×104個(gè)細(xì)胞/孔的量分別將野生型TCA8113細(xì)胞以及SERPINB3敲低型細(xì)胞接種于Transwell小室中，其中上層培養(yǎng)液為100μL含0.1% BSA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，下層為700μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h后，利用醫(yī)用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞。PBS清洗細(xì)胞3次后，利用甲醇固定20min，并再次利用PBS對(duì)細(xì)胞清洗3次。利用0.1%的結(jié)晶紫染色10min。PBS溶液沖洗3次。然后在熒光顯微鏡下觀察。選擇不同視野進(jìn)行對(duì)比，判斷SERPINB3 敲低對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。最后，將上述所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行GraphPad Prism 6.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting檢測(cè)SERPINB3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染情況

含SERPINB3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染48h后，TCA8113細(xì)胞中SERPINB3蛋白的表達(dá)情況。在與空白對(duì)照Control組的蛋白表達(dá)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SERPINB3 shRNA3慢病毒質(zhì)粒能夠有效的減弱SERPINB3在TCA8113細(xì)胞中的表達(dá)。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選用SERPINB3 shRNA3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 SERPINB3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染48h后SERPINB3表達(dá)

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)確定SERPINB3 敲低對(duì)細(xì)胞遷移的影響。按照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h3個(gè)時(shí)間段，分別對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h后創(chuàng)口寬度變化比值所繪制的柱狀圖，見(jiàn)圖2，根據(jù)創(chuàng)面愈合大小定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SERPINB3敲低后，細(xì)胞的創(chuàng)口愈合速度明顯受到抑制，結(jié)果證明SERPINB3的表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌的遷移有一定相關(guān)性。數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism軟件處理，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，和對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(***P<0.001)。

圖2 SERPINB3 敲低后細(xì)胞遷移能力變化(200μm，40×)

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell試驗(yàn)是根據(jù)通過(guò)基質(zhì)凝膠的細(xì)胞數(shù)量來(lái)判斷毒性質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。相同時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞透過(guò)基質(zhì)膠的數(shù)量越少，則表明毒性質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移能力抑制作用越強(qiáng)。見(jiàn)圖3，顯微鏡下觀察到SERPINB3 敲低后，穿過(guò)基質(zhì)凝膠的細(xì)胞明顯比Control組細(xì)胞的數(shù)量少，從而證明SERPINB3的表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌的侵襲有一定相關(guān)性。數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism軟件處理，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，和對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(***P<0.001)。

圖3 SERPINB3敲低后細(xì)胞侵襲能力變化(50μm，200×)

3 討論

在上皮源性鱗癌癥發(fā)展過(guò)程中，SERPINB3可以抑制癌細(xì)胞凋亡，繞過(guò)細(xì)胞死亡的通路機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散及預(yù)后惡化。SERPINB3的重要致癌特征是誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)上皮源性鱗癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下借助低氧誘導(dǎo)因子HIF-2α誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)SERPINB3能夠促進(jìn)EMT和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子生成，并且成為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[14]。在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中，發(fā)現(xiàn)SERPINB3的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頻率相一致[15]。有研究通過(guò)向HepG2細(xì)胞系和MDCK細(xì)胞系中分別添加上調(diào)外源重組SERPINB3蛋白，發(fā)現(xiàn)SERPINB3的表達(dá)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞簇狀且連接松散，細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)形改變，并且證明這些改變與減少E-cadherin鈣粘蛋白和增加β-catenin平行增加相關(guān)[16]。由此可見(jiàn)，SERPINB3的表達(dá)上調(diào)與癌細(xì)胞的EMT密切相關(guān)，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活，增加細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，加速癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提高癌細(xì)胞的增殖能力。本研究提示通過(guò)shRNA基因干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SERPINB3敲低能夠抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移，SERPINB3基因有可能成為基因治療口腔鱗癌的靶點(diǎn)，為建立腫瘤特異性基因調(diào)控自殺基因成為靶向毒素體系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。