呂紅梅， 朱景鑫，鄭 坤，趙云波

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院,黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154003)

增生性瘢痕(HS)是人體組織創(chuàng)傷修復過程中不可避免的產(chǎn)物，其組織學特征在于成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質(zhì)的過度沉積[1]，嚴重影響了人體的結構及功能，其發(fā)病機制尚不明確。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1) 是重要的促纖維化細胞因子，其異常表達是促進增生性瘢痕形成的主要因素[2]。Smad家族作為TGF-β下游重要的信號分子，可對活化的TGF-β受體復合物作出應答，參與調(diào)控增生性瘢痕的形成[3]，可見TGF-β1/Smad 信號轉(zhuǎn)導通路在增生性瘢痕發(fā)病中起著關鍵作用，并且可能成為防治增生性瘢痕形成的重要靶點。姜黃素是從姜黃等植物的根莖中提取的一種多酚類活性物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化等多種藥理作用[4]。本次研究通過不同濃度的姜黃素對瘢痕模型進行治療，探討姜黃素對TGF-β1/Smad 信號通路存在的影響，為姜黃素治療增生性瘢痕提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

姜黃素(美國Sigma公司，與黃凡士林，液體石蠟配制成不同濃度軟膏)；戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術有限公司)；蘇木素、伊紅染色液(碧云天生物技術)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；石蠟切片機(德國)；實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫公司)；微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；顯微鏡(DM 2000)(奧林巴斯株式會社)。

1.2 方法1.2.1 瘢痕模型的建立

12只健康新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～3.0kg，由遼寧長生生物技術有限公司提供，適應性喂養(yǎng)3d。隨機留取3只為對照組，其余兔子參考李薈元[5]方法，構建兔耳增生性瘢痕模型。戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，常規(guī)消毒，在兔耳腹側中段做6個直徑為1cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，創(chuàng)面深至軟骨層，完整去除軟骨膜，相鄰創(chuàng)面間隔1cm以上，壓迫止血后創(chuàng)面暴露，自行結痂愈合，2周左右創(chuàng)面完全上皮化。

1.2.2 實驗分組及給藥

術后2周左右，創(chuàng)面痂皮自然脫落，將動物隨機分為3組，瘢痕模型組(B組)涂抹不含姜黃素的軟膏基質(zhì)，姜黃素低劑量組(C組)及姜黃素高劑量組(D組)涂抹濃度為2.5%、10%的姜黃素軟膏，每次0.1g，每日2次，連續(xù)用藥28d。3只正常皮膚對照組(A組)不予特殊處理。

1.2.3 標本取材及處理

實驗結束后，戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉將白兔處死，留取瘢痕組織(每組36個)，一部分用甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片進行HE染色觀察，另一部分保存在-80℃的冰箱中備用，用于PCR 檢測。

1.2.4大體形態(tài)學觀察及瘢痕增生指數(shù)(HI)的測定

給藥結束后，觀察瘢痕組織顏色、硬度及厚度的改變。用游標卡尺測量兔耳瘢痕的厚度 (瘢痕隆起的最高點至軟骨表面的垂直距離)及瘢痕周圍正常皮膚的厚度(正常皮膚至軟骨的垂直距離)[1]，二者相除即為HI。

1.2.5 病理組織學觀察

標本用4%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，4～5μm厚度切片, 按照蘇木素-伊紅(HE)染色操作步驟進行，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察各組瘢痕組織的病理學改變；隨機選取5個視野，高倍鏡下計算各組瘢痕中單位面積的成纖維細胞數(shù)目(NA)，結果取均值。

1.2.6TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA檢測

取各組組織0.5g放入EP管中，按照Trizol總RNA提取試劑盒說明書提取組織內(nèi)RNA，紫外分光光度計測定RNA的含量和純度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將各組總RNA進行cDNA合成，所得cDNA置于-20℃保存；產(chǎn)物cDNA進行RT-PCR擴增實驗，反應體系如下：SYBR qPCR Mix 10μL、上游/下游引物各1μL、DEPC水7μL、cDNA 1μL；反應條件如下：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。各基因引物序列如下：

TGF-β1:(F)5’-TGGAACGGGCTCAACATCTACAC-3’,(R)5’-AATGTACAGCTGCCGCACAC-3’;Smad2:(F)5’-CAGCGACCACCAGATGAAC-3’,(R)5’-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’;Smad3: (F) 5’-CAGCGACCACCAGATGAAC-3’，(R)5’-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’;GAPDH:(F)5’-ACCACAGTCCATGCCTACAC-3’, (R)5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，所有引物均由大連寶生物有限公司合成。反應結束后整理數(shù)據(jù)，以GAPDH為內(nèi)參基因，記錄各樣本Ct值作為統(tǒng)計參數(shù)，利用靶基因量=2-△△Ct公式計算各個基因mRNA 的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大體觀察及瘢痕增生指數(shù)(HI)的變化

模型組中瘢痕增生明顯，瘢痕厚度約為正常皮膚的2.5倍，瘢痕質(zhì)地較硬，顏色深紅；姜黃素藥物組中瘢痕增生較慢，瘢痕體積減小，質(zhì)地變軟，顏色變淺，姜黃素高劑量組改善尤為明顯，瘢痕顏色基本接近正常膚色；各組瘢痕均未超出原創(chuàng)傷范圍。與對照組相比，模型組中HI明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，姜黃素組HI明顯降低，且姜黃素高劑量組小于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 )。見表1。

表1 各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、成纖維細胞密度的比較

2.2 病理組織學觀察

HE染色結果顯示：與對照組相比，模型組中可見大量成纖維細胞及排列紊亂的膠原纖維，并伴有炎細胞的浸潤；姜黃素組相對于模型組，成纖維細胞則明顯減少，膠原纖維排列相對規(guī)則，高劑量組改善更加明顯，見圖1。

對照組 模型組 姜黃素低劑量組 姜黃素高劑量組

2.3 成纖維細胞密度(NA)

模型組中NA顯著大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；姜黃素組中NA顯著低于模型組，且姜黃素高劑量組明顯低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4 TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達

與對照組相比，模型組中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素高、低劑量瘢痕組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達水平均明顯降低，且高劑量組變化更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 TGF-β1、Smad2、Smad3 熒光定量PCR檢測

3 討論

HS 是一種皮膚纖維增生性疾病，其形成和發(fā)展是一個比較復雜的生物學過程，是機體在一系列刺激下多種因素通過多種途徑作用的結局[6]，目前其發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床上亦缺乏特異有效的治療藥物。

姜黃素是姜黃的主要活性成分，近年發(fā)現(xiàn)其具有抗纖維化作用。王學敏等[7]研究證實，給腎臟缺血再灌注后腎小管間質(zhì)纖維化的大鼠灌胃姜黃素后，腎小管及間質(zhì)纖維化明顯減輕，腎組織中膠原纖維含量明顯降低，腎功能的生化指標明顯好轉(zhuǎn)，并與姜黃素劑量高低呈正相關。秦開秀等[8]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制人皮膚成纖維細胞的增殖，使S期細胞數(shù)減少，G1期細胞數(shù)量增加。本實驗采用不同濃度的姜黃素軟膏對增生性瘢痕模型進行治療，結果顯示姜黃素能抑制瘢痕的形成，10%姜黃素軟膏效果尤為明顯，瘢痕平坦，瘢痕顏色接近正常膚色，組織學切片可見成纖維細胞密度明顯下降，膠原纖維排列規(guī)則，提示姜黃素抑制瘢痕的形成。

TGF-β1是目前已知的與瘢痕形成關系最密切的細胞因子，其廣泛存在于哺乳動物中。在創(chuàng)傷修復過程中，其作為一種強趨化因子，能刺激巨噬細胞、中性粒細胞通過自分泌及旁分泌使TGF-β1局部濃度升高，通過自身誘導功能促進成纖維細胞增殖、膠原蛋白合成，并抑制細胞外基質(zhì)的降解[3]。通常情況下，TGF-β1 在細胞內(nèi)不具有活性，它必須通過TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮上述生物效應。機體創(chuàng)傷時，活化的TGF-β1受體復合物啟動了細胞內(nèi)信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導，Smad蛋白則是接受該受體激活的信號蛋白，是TGF-β1信號傳導的關鍵介質(zhì)[7]。Smad 蛋白包括受體活化型Smad(R-SMADs)、共同通路型 Smad(Co-SMADs)、抑制型Smad(I-SMADs)[2]。Smad2、3作為重要的R-Smad 蛋白，激活磷酸化后會將TGF-β1的刺激信號從細胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，觸發(fā)靶基因轉(zhuǎn)錄，促進纖維化基因過度表達，膠原過度增值，導致瘢痕形成[9]。

本實驗RT-PCR結果顯示：模型組中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達水平均明顯高于對照組(P<0.05 )；姜黃素藥物組中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA明顯低于模型組，且高劑量組變化更明顯(P<0.05 )，提示姜黃素通過抑制TGF-β1和其下游信號Smad2、Smad3的表達來抑制增生性瘢痕的形成，證實了TGF-β1/Smad 信號通路與增生性瘢痕之間的關系，也為姜黃素的臨床應用提供一定的實驗依據(jù)。

綜上所述，姜黃素對皮膚增生性瘢痕形成具有一定的抑制和改善作用，其作用機制可能與TGF-β1/Smad通路有關。