胡懿心，王彩霞，刁為英

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

胃癌(Gastric cancer，GC)是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展過程中多種基因和蛋白表達失常，侵襲轉移能力強，預后差。當前的胃癌標志物，如：血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA199)在胃癌的診斷和預后方面敏感性和特異性都相對較低[1]。因此，找尋新的、敏感的、特異的生物學標志物是非常有必要的。本文采用免疫組織化學染色(PV6000vision)法檢測INHBA和Flot2在胃癌組織中的表達、與臨床病理特征的關系，并分析二者在胃癌組織中的相關性，通過探討INHBA和Flot2的表達變化來提升胃癌的診療水平。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用單純隨機抽樣的方法在黑龍江省佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2018-01～2021-01手術切除的胃癌標本中抽取60例，經我院資深病理醫(yī)生證實為GC患者，且均為初次手術，術前未行放化療。收集他們的胃癌組織及距癌組織2～5cm處正常胃組織的石蠟標本、相關臨床病理特征資料。其中男32例，女28例；年齡<55歲者19例；腫瘤直徑<5cm者20例。腫瘤病理分級根據WHO標準，高+中分化27例，低分化33例；根據2017年美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版標準對GC進行浸潤深度及TNM分期，其中T1+T2為16例，T3+T4為44例；I～II期為26例，III～IV為34例。此外，有脈管侵犯者26例；有神經侵犯者36例；有淋巴結轉移者35例。

1.2 免疫組化方法

用10%中性緩沖福爾馬林(或 4% 緩沖多聚甲醛)進行標本的固定，將組織脫水包埋，采用免疫組化 PV6000vision法，分別對胃癌和癌旁組織進行INHBA、Flot2 抗原抗體染色。按 1： 100 稀釋一抗 INHBA(兔抗人多克隆抗體)，按1:300稀釋一抗Flot2(兔抗人多克隆抗體)，均購自Proteintech公司。免疫組化 PV6000Vision 試劑盒(兔)、DAB 染色試劑盒和 EDTA 抗原修復液( pH8.0，pH9.0) 均購自北京中杉金橋。陽性對照INHBA參考人胎兒前列腺組織，F(xiàn)lot2參考人肺癌組織，用PBS代替一抗作為陰性對照，其它具體操作參考說明書。

1.3 判定標準

每張切片觀察5個(40×10) 有代表性視野，視野以染色強度和陽性細胞數(shù)所占百分比分別計分。其中無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計為 0、1、2、3分；細胞陽性百分比，無陽性細胞為0分； ≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%計為 1、2、3、4分。兩項分數(shù)相乘， <8分低表達，≥8 分為高表達[2]。所有切片染色結果判定由兩名資深病理醫(yī)生通過雙盲法單獨進行評定，最后統(tǒng)一評分。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS20.0 進行數(shù)據統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以n(%)表示,χ2檢驗，采用spearman等級相關檢驗分析INHBA與Flot2的相關性，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 GEPIA數(shù)據庫差異表達分析與生存分析

本研究中利用GEPIA數(shù)據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析了INHBA與Flot2在胃癌及正常胃黏膜樣本中的表達差異及二者高表達時對患者總體生存期(Overall Survival，OS)的影響。

2 結果

2.1 INHBA 和 Flot2 在胃癌組織中的表達

INHBA和Flot2在胃癌細胞中有陽性表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。INHBA定位于細胞漿，F(xiàn)lot2定位于細胞漿和細胞膜。INHBA在GC中高表達率73.33%(44/60)顯著高于癌旁正常胃組織8.33%(5/60)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=52.463，P<0.05)，見表1，圖1；Flot2在GC中高表達率75.00%(45/60)顯著高于癌旁正常胃組織10.00%(6/60)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=51.867，P<0.05)，見表1，圖2。

表1 胃癌和癌旁正常胃黏膜組織中INHBA、Flot2的表達

圖1 A:INHBA在胃癌組織中陽性表達(×200)； B:INHBA在癌旁正常胃組織中陰性表達(×200)

圖2 A:Flot2在胃癌組織中陽性表達(×200)； B:Flot2在癌旁正常胃組織中陰性表達(×200)

2.2 INHBA、Flot2表達與GC臨床病理學參數(shù)的關系

按照胃癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、脈管侵犯、神經侵犯、浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期分為9組。分別比較、分析不同組別INHBA和Flot2表達水平的差異，結果表明INHBA 的高表達與GC患者的腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有顯著相關性(P<0.05)，與年齡、性別、脈管侵犯、神經侵犯無顯著相關性；Flot2的高表達與GC患者的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有顯著相關性(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤直徑、脈管侵犯、神經侵犯均無顯著相關性,見表2。

表2 INHBA、Flot2的表達與60例胃癌臨床病理參數(shù)的關系

2.3 INHBA 與 Flot2 在胃癌中表達的相關性

有 38 例病例中INHBA和Flot2在腫瘤中表達同為陽性，同為陰性的有9例。應用spearman相關性檢驗分析發(fā)現(xiàn)GC組織中INHBA與Flot2的表達具有顯著相關性(r=0.435，P=0.001),見表3。

表3 INHBA與Flot2的表達在GC中的相關性

2.4 GEPIA數(shù)據庫中胃癌中INHBA、Flot2的表達差異

雖然兩種mRNA在胃癌組織中的表達量均高于正常胃黏膜組織，但Flot2的差異表達分析并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。進一步的OS分析中，二者高表達組患者生存情況均差于低表達組，但Flot2的OS分析同樣較欠統(tǒng)計學意義(P=0.11)。見圖3。

圖3 A:胃癌和正常胃黏膜組織中INHBA的表達差異(紅色代表胃癌組織，黑色代表正常組織)；B:胃癌和正常胃黏膜組織中Flot2的表達差異(紅色代表胃癌組織，黑色代表正常組織)；C:INHBA總體生存期分析；D:Flot2總體生存期分析。

3 討論

抑制素βA(INHBA)基因定位于7p14.1[3]，作為轉化生長因子β(TGF-β)超家族的成員之一 ，它參與生殖細胞的發(fā)育和成熟、紅細胞分化、下丘腦及垂體激素分泌、性腺激素和胰島素的分泌、神經細胞存活、胚胎軸向發(fā)育或骨生長等過程[4]。有研究人員指出INHBA表達增加與腫瘤直徑和腫瘤浸潤深度有關，INHBA表達較高的患者無瘤生存率較短[5]。同時，近年來的多項研究表明，INHBA以高表達參與多種癌癥的細胞增殖，如食管鱗狀細胞癌、肺腺癌、卵巢癌和鼻咽癌等。

本組實驗通過觀察INHBA在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜中的表達差異，發(fā)現(xiàn)有 73.33%(44/60)的胃癌組織高表達INHBA，癌旁正常胃黏膜組織中的高表達率僅有 8.33%(5/60)，這兩者差異有顯著性，與GEPIA數(shù)據庫分析結論一致。實驗數(shù)據顯示，INHBA高表達的GC患者腫瘤直徑更大、分化程度更低、浸潤更深、TNM分期更高，有淋巴結轉移組中的表達高于無淋巴結轉移組以上五個臨床病理參數(shù)的數(shù)據的差異均具有顯著性(P<0.05)，與年齡、性別、脈管侵犯、神經侵犯無顯著相關性。提示INHBA可能與癌細胞的增殖以及侵襲、遷移密切相關，參與胃癌的進一步惡化，這與GEPIA數(shù)據庫生存分析顯示INHBA高表達患者生存期較短一致。目前關于INHBA的表達與腫瘤臨床病理特征的關系的研究較少，Chen等[5]的研究認為在胃癌組織中，INHBA的表達上調，INHBA與癌癥直徑和腫瘤浸潤深度顯著相關，并且INHBA表達較高的患者也具有較短的無病生存期；INHBA過表達可以預測第二和第三階段胃癌的預后。此研究結果與本組實驗結果有相似之處。

脂筏是存在于生物膜上的微結構域，其特征蛋白Flot2(脂筏結構蛋白2)，亦稱為Reggie-1，大小為48KDa，為一個完整的膜蛋白，且高度保守。在一些乳腺癌細胞系及腫瘤樣本中，可有Flot2基因編碼的Flot2蛋白的高表達[6]。Flot2在腎癌組織中為高表達，其與腎癌的腫瘤分期、組織學分級、淋巴結轉移以及遠處轉移相關[7]。除此之外，F(xiàn)lot2在鼻咽癌、胃癌、惡性黑色素瘤等腫瘤中均存在異常表達，體內外實驗表明腫瘤的進展與其密切相關，這使其可能成為判斷腫瘤侵襲及預后的指標[8]。

本組實驗通過觀察Flot2在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜中的表達差異，發(fā)現(xiàn)有 75.00%(45/60)的胃癌組織高表達Flot2，癌旁正常胃黏膜組織中的高表達率僅有 10.00%(6/60)，兩者的差異有顯著性。本組對Flot2的表達與腫瘤臨床病理特征的關系研究的實驗數(shù)據顯示，F(xiàn)lot2高表達的GC 患者分化程度更低、浸潤更深、TNM 分期更高，有淋巴結轉移組中的表達高于無淋巴結轉移組，以上四組差異均具有顯著性(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤直徑、脈管侵犯、神經侵犯均無顯著相關性，提示Flot2可能參與胃癌的進一步惡化。Cao等[9]的研究表明，在胃癌患者癌組織和癌旁組織中，F(xiàn)lot2基因在癌組織中的陽性表達率更高，采用si-RNA干擾Flot2的表達后，胃癌細胞的增殖、遷移及轉移能力都顯著下降，與本組實驗結論一致。

在GEPIA數(shù)據庫中，F(xiàn)lot2在胃癌中的表達量高于正常胃黏膜組織，F(xiàn)lot2高表達組患者生存情況差于低表達組，與實驗結果保持了一致，這說明Flot2可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但是Flot2的差異表達分析及OS分析較欠統(tǒng)計學意義，與本組實驗得到的具有顯著性差異的結果有所偏差，這種情況可能與兩種分析方式所納入樣本的人種及生存地的不同、樣本所處的癌癥的不同階段以及樣本量的不足有關。

在腫瘤進展過程中，上皮細胞從其微環(huán)境接收的轉化生長因子-β (TGF-β)信號可以誘導上皮間質轉化(EMT)[10]。EMT被認為是胃癌侵襲轉移的關鍵步驟之一，其發(fā)生與多種信號通路有關，其中TGF-β信號通路被認為是EMT的最重要通路之一。有研究表明上調的Flot2在TGF-β介導的上皮間質轉化(EMT)相關的胃癌侵襲中起到了關鍵作用[8]，而INHBA是TGF-β超家族的一員。對INHBA與Flot2是否在同一條通路上調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及兩者在胃癌中的表達是否具有相關性的研究甚少。本組實驗結果顯示，胃癌中INHBA與Flot2的表達具有一致性及正相關性，提示INHBA和Flot2在胃癌中作用的發(fā)揮可能具有協(xié)同性。但本研究僅在蛋白水平對兩個因子進行了研究，且實驗樣本例數(shù)相對較少、人種單一，其更微觀的作用機制并不清楚，所以兩者是否真的在同一條通路上協(xié)同調節(jié)胃癌的發(fā)展還需要進一步去擴大樣本量、進行細胞和分子水平的實驗來進行探索及驗證。

總之，本研究顯示胃癌中INHBA、Flot2過表達，二者的表達具有正相關性，且它們的高表達預示著淋巴結轉移及更高的TNM分期，說明INHBA、Flot2的高表達提示腫瘤有較強的侵襲和遷移能力。深入研究INHBA、Flot2兩種蛋白具有重要意義，它們可能成為胃癌未來潛在的新治療靶點。