張 琳，李 玥，劉春陽，劉 寧，徐 輝

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；3.安康學(xué)院醫(yī)學(xué)院,陜西 安康 725000)

微小RNA(miRNA)是一類高度保守的單鏈RNA，由長度約為22個核苷酸組成的，在機體發(fā)育代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在大量的miRNA，不僅與神經(jīng)細胞的發(fā)育、分化和生理功能密切相關(guān)，在腦缺氧缺血后神經(jīng)病變和功能失調(diào)中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，提高新生大鼠HIE腦組織 miRNA-210 表達水平可緩解腦損傷程度[1]，而另有研究顯示miRNA-210在新生大鼠 HIE 腦組織中表達上調(diào)后反而加重腦損傷程度[2]。miRNA-210到底是危險因子還是保護因子尚無定論。我們以黑龍江省漢族人群HIE患兒為研究對象檢測miRNA-210的表達水平和缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1α)的含量，以明確特定人群中miRNA-210在新生兒腦缺血缺氧后的變化，探討其在HIE中發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018-05～2019-12在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科就診的HIE患兒，根據(jù)病情程度分為輕度組、中度組和重度組，每組選取樣本12例，對照組樣本選取同時期體檢的健康兒童或非神經(jīng)系統(tǒng)疾病兒童，共12例。分別采集外周靜脈血5mL，3500r/min離心10min，留取血清保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。所有研究對象選擇在黑龍江省居住三代以上的漢族人群。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑:血清/血漿miRNA提取分離試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRNA熒光定量檢測試劑盒(Tiangen公司)，hsa-U6(CD201-0145，Tiangen公司)，hsa-miR-210-3p引物(CD201-0293，Tiangen公司)，酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，T100TM型逆轉(zhuǎn)錄Thermal Cycler儀(BIO-RAD公司)，7300型Real time PCR system擴增儀(Applied Biosystems公司)。

1.2.2 血清miRNA提取:按照miRNA提取分離試劑盒使用說明書提取血清miRNA，測定A260/A280吸光度。

1.2.3 miRNA逆轉(zhuǎn)錄:參照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件為42℃ 60min，95℃ 3min。

1.2.4 miRNA210檢測:按miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書進行real time PCR檢測miR-210表達水平，20μL反應(yīng)體系，預(yù)變性95℃ 15min，反應(yīng)5個循環(huán)，條件為94℃ 20s，65℃ 30s，72℃34s；然后反應(yīng)40個循環(huán)，條件為94℃ 20s，60℃ 34s。以U6為內(nèi)對照，反應(yīng)結(jié)束后自動計算出Ct值。

1.2.5 HIF-1α檢測:按照酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書檢測血清中HIF-1α的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA210表達情況

提取研究對象血清樣本的RNA，使用核酸定量儀測定RNA濃度和純度，光密度A260/A280均在1.8～2.0，說明RNA無降解，質(zhì)量較好。RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，進行熒光定量PCR檢測。熔解曲線圖未見雜峰，說明擴增產(chǎn)物單一，沒有非特異性擴增。從擴增曲線可見所有樣品均己進入擴增平臺期，說明反應(yīng)條件設(shè)定準(zhǔn)確。

根據(jù)軟件分析的結(jié)果得到miRNA-210和U6的Ct值，其相對表達量△Ct(△Ct=CtmiR210-CtU6)。根據(jù)PCR反應(yīng)原理，2-△Ct則代表樣本中miRNA-210相對于內(nèi)參基因U6的倍比關(guān)系。通過計算發(fā)現(xiàn)miRNA-210在病例輕度、中度、重度組中的表達水平均高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 熒光定量PCR檢測miR-210在樣本中的表達

2.2 HIF-1α含量

病例組各組HIF-1α、VEGF值明顯升高，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組血清中HIF-1α水平的比較

3 討論

3.1 HIE患兒血清miRNA210表達的變化

本研究首次以黑龍江省漢族人群HIE患兒為研究對象，結(jié)果顯示，在病例輕度、中度、重度組患兒血清中miRNA-210的表達水平均高于對照組，提示HIE發(fā)生時血清miRNA表達發(fā)生變化。大量研究表明miRNA 在生命發(fā)育進程中扮演著關(guān)鍵角色[3]。研究結(jié)果顯示miRNA還涉及許多疾病的病理和生理過程，包括腫瘤、細胞凋亡、細胞增殖、組織發(fā)育等等[4]。研究發(fā)現(xiàn)缺氧缺血可誘導(dǎo)腦組織 miRNA 的異常表達，介導(dǎo)機體發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默。通過對新生大鼠 HIE 進行 miRNA 芯片的檢測和分析，發(fā)現(xiàn)有 5種表達上調(diào)，30種表達下調(diào)。國內(nèi)研究者也發(fā)現(xiàn)新生大鼠HIE腦組織中有 27 種 miRNA 表達上調(diào)，60種表達下調(diào)，均提示miRNA與HIE 密切相關(guān)。研究人員通過 miRNA 芯片技術(shù)比較HIE患兒與健康足月兒外周血漿的miRNA水平表達，在HIE組中共檢測出55種miRNA 表達差異，其中29種表達上調(diào)，26種表達下調(diào)。國內(nèi)外研究人員對缺氧缺血后新生大鼠和新生兒的樣本進行 miRNA 芯片的檢測和分析的結(jié)果均提示HIE后會出現(xiàn)一定數(shù)量的 miRNA表達上調(diào)或下調(diào)[5]。

不同的研究結(jié)果顯示，miRNA-210在HIE后表達的高低不盡相同，更多的研究顯示缺氧缺血后miRNA-210表達上調(diào)，認為miRNA-210為缺氧特異性miRNA[6,7]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)黑龍江省漢族人群HIE患兒血清中miRNA-210表達上調(diào)，與多數(shù)研究結(jié)果一致。

3.2 miRNA210在HIE發(fā)生過程中的作用

在國內(nèi)外的報道中miRNA-210上調(diào)后對腦組織的影響結(jié)果有所不同。Fasanaro P 等證實體外環(huán)境下過表達miRNA-210 可顯著促進血管生成[8]，提示腦缺血后miRNA-210 的上調(diào)與缺血后血管新生關(guān)系密切。而Ma 等[2]研究顯示miRNA-210在新生大鼠 HIE 腦組織中表達上調(diào)后反而加重腦損傷程度。為明確miRNA-210表達上調(diào)后是否與血管新生有關(guān)，我們進一步分析了血清中與血管新生有關(guān)的HIF-1α的含量，結(jié)果顯示HIE后HIF-1α的含量增加。

近年來，研究認為HIF-1α、VEGF在腦損傷過程中發(fā)揮著重要作用[9,10]。研究表明，HIF-1α在腦缺氧缺血損傷中具有腦保護作用[11,12]。腦缺血缺氧可以通過激活HIF-1α誘導(dǎo)VEGF的表達[13]。VEGF是缺氧時HIF-1α的最重要的靶基因之一，VEGF可能通過促新生血管形成發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。在新生血管的形成過程中，VEGF是血管新生過程中重要的一種促細胞分裂原，在血管生成的各個階段發(fā)揮了重要作用[14]?？梢奌IE發(fā)生時，HIF-1α含量的增加對腦損傷發(fā)揮了保護作用。

研究表明，miRNA-210具有HIF-1α依賴性[15]，持續(xù)穩(wěn)定的 HIF-1α過度表達可誘導(dǎo)miRNA-210表達增加，抑制 HIF-1α可阻止低氧對miRNA-210的誘導(dǎo)，在體研究也顯示向肌肉中轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定表達HIF-1α活性形式的腺病毒也可引起miRNA-210表達上調(diào),在不表達 HIF-1α的成纖維細胞中不能誘導(dǎo) miRNA-210表達增加，提示 HIF-1α是miRNA- 210的主要調(diào)節(jié)劑。

本研究證實了HIE血清樣本HIF-1α含量增加，同時缺氧缺血后miRNA-210表達也增加，并且在病例輕度、中度、重度組中的表達和含量均高于對照組，表明miRNA-210可能在HIE發(fā)生過程中與HIF-1α共同發(fā)揮了積極的作用。黑龍江省漢族人群HIE患兒血清中miRNA-210表達上調(diào)，與HIF-1α共同對腦組織發(fā)揮了保護作用，這為miRNA-210作為治療藥物的靶點提供了理論基礎(chǔ)，相關(guān)研究在國內(nèi)外尚未見報道。同時，缺血后 miRNA 特異性表達的時間效應(yīng)，被認為是臨床診斷腦損傷和預(yù)后的有效生物指標(biāo)。臨床上已經(jīng)廣泛開展應(yīng)用人血清中miRNA 的改變，對于腫瘤等相關(guān)疾病做出早期的診斷。本研究結(jié)果也提示miRNA-210可能會在HIE的診斷和預(yù)后評定中發(fā)揮一定的作用。臨床上可根據(jù) HIE 患兒 miRNA-210 表達水平對病情嚴重程度進行分類，指導(dǎo)臨床治療，因此，將miRNA-210作為臨床診斷腦缺氧缺血及預(yù)后的一種新型生物標(biāo)志物具有十分重要的意義。

由于miRNA的作用機制復(fù)雜多樣，其作用于血管新生的具體機制尚不明確，本研究采取個別因子為切入點，不能完全闡明其作用機制，尚有待繼續(xù)深入研究。同時本研究僅對黑龍江省漢族人群進行了研究，雖然避免了不同民族人群差異對研究結(jié)果造成的影響，但是其他地區(qū)及不同民族人群HIE的miRNA-210表達情況還需進一步研究。