王艷紅，張任男，王纓，歷娜，沈振鐸

1.山東藥品食品職業(yè)學院，山東 威海 264210；2.山東博安生物技術(shù)有限公司，山東 煙臺 264670

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實。習稱“北五味子”。研究表明，五味子中木脂素類成分為主要的活性成分［1-3］，起到保肝、抗氧化等藥理作用。五味子為臨床常用中藥，收錄于《中國藥典》（2020 年版）一部［4］。目前五味子質(zhì)量標準尚存在諸多不足，特別是指標成分較為單一。中藥化學成分的復雜性和多樣性是其發(fā)揮療效的基礎(chǔ)，亦是評價藥材質(zhì)量的重點和難點［5］。中藥材色譜指紋圖譜可以從整體上反應藥材全貌和主要化學成分的特征；可評價中藥材間的質(zhì)量差異，用于綜合判斷中藥材質(zhì)量。目前，五味子指紋圖譜多采用高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC）［6-11］等，但當前的色譜方法對主要成分的分離效果參差不齊，且對藥材評價手段未達成共識。因此，本研究建立了五味子藥材的HPLC 指紋圖譜及多指標成分指認，通過聚類分析建立相似度模型，綜合判斷五味子藥材質(zhì)量，為五味子中藥材質(zhì)量控制提供支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀；CPA225D 電子天平（賽多利斯公司）；XSE205 十萬分之一天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；HH-6 電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海拓赫機電科技有限公司）。

1.2 試藥

標準化合物五味子醇甲、戈米辛-D、戈米辛-J、五味子醇乙、前戈米辛、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、巴豆酰戈米辛-P、戈米辛-E、五味子甲素、戈米辛-N、五味子乙素和五味子丙素均由沈陽藥科大學藥物分析實驗室從五味子中分離得到，并用TLC、HPLC 方法確認其性質(zhì)和純度，純度均在95%以上。甲醇（色譜純，Merk）、乙腈（色譜純，Merk）；超純水自制。本研究共自采了14 批不同產(chǎn)地五味子藥材，見表1，經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院孫啟時教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill 的干燥成熟果實，藥材粉碎后過 40 目篩，粉末置干燥器中于陰涼處密閉儲存。

表1 五味子藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，55%A →35%A；20～26 min，35%A；26～50 min，35%A →25%A，柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：220 nm；進樣量：5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取木脂素類對照品五味子醇甲（Schi）、戈米辛-D（GD）、戈米辛-J（GJ）、五味子醇乙（Aom）、前戈米辛（Pre-G）、當歸酰戈米辛H（Ange）、五味子酯甲（Schi-A）、巴豆酰戈米辛-P（Tig）、戈米辛-E（GE）、五味子甲素（Deoschi）、戈米辛-N（GN）、五味子乙素（γ-schi）和五味子丙素（Schi-C）對照品適量，精密稱定，置10 mL 容量瓶，加入適量甲醇溶解，并繼續(xù)用甲醇定容即得，使Schi、GD、GJ、Aom、Pre-G、Ange、Schi-A、Tig、GE、Deo-schi、GN、γ-schi 和Schi-C各成分濃度依次為2.0，1.0，1.0，2.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0 和1.0 mg/mL，2～8 ℃于藥品儲存柜保存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取藥材粉末500 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加入色譜甲醇約20.0 mL，超聲波提取20 min，甲醇定容至刻度，混勻，0.45 μm 濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液分析。

2.3 精密度試驗

取藥材（5）粉末約500 mg，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的配制”項下操作，按“2.1 色譜條件”項下連續(xù)進樣6 次。結(jié)果顯示，主要成分色譜峰的相對保留時間（RRT）的RSD 小于0.2%，相對峰面積（RA）的RSD 小于0.6%，精密度良好。

2.4 重復性試驗

取藥材（5）粉末約500 mg，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的配制”項下操作，平行制備5 份供試品溶液，按“2.1 色譜條件”檢測分析。結(jié)果顯示，主要成分色譜峰的RRT 的RSD 小于0.9%，RA 的RSD小于4.2%，方法重復性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取五味子藥材（5）約500 mg，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的配制”項下操作，分別在0、2、4、8、12 和24 h 時間點檢測分析，結(jié)果顯示，主要成分色譜峰的RRT 的RSD 小于0.9%，RA 的RSD 小于3.4%，說明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 五味子HPLC 色譜指紋圖譜共有模式的建立

內(nèi)參比峰選擇：選擇位于保留時間中間位置的Tig（8 號峰）為內(nèi)參比峰。14 批五味子共確定了13 個共有峰，并且對13 個共有峰進行了指認。圖譜見圖1。

圖1 五味子HPLC指紋圖譜：A.對照品；B.樣品

2.7 五味子藥材色譜指紋圖譜

測定了14 批樣品，以各色譜峰的RRT 定性，按下式計算各色譜峰面積相對其稱樣量的比值，數(shù)據(jù)見表2。HPLC 指紋圖譜見圖2。

圖2 14批五味子HPLC指紋圖譜

表2 14批五味子指紋圖譜中13個指認成分的相對峰面積

注：Xn表示第n個樣品的某個組分的峰面積與稱樣量的比值，若某一樣品在指定位置未檢測到色譜峰，則Xn為零；An表示第n個樣品相應組分的峰面積；Wn表示第n個樣品的稱樣量。

2.8 五味子HPLC 指紋圖譜質(zhì)量鑒定

2.8.1 基于SPSS 的聚類分析 將表2 數(shù)據(jù)代入SPSS 軟件對其進行聚類分析，采用組間（between groups）鏈鎖法，以歐氏距離（euclidean distance）為測度。結(jié)果顯示，14 批五味子樣品被劃分為兩類，結(jié)合外觀形態(tài)，可判定第I 類為推薦品，第Ⅱ類為一般品。聚類譜系圖見圖3。聚類分析結(jié)果：1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14 號樣品為第I 類，9 號樣品為第Ⅱ類。

圖3 五味子聚類譜系圖

2.8.2 共有模式建立 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”處理軟件，選取第I類13 批推薦品建立共有模式。

2.8.3 五味子樣品相似度計算 以建立的共有模式為標準，計算各批藥材與共有模式間的相似度，結(jié)果見表3。

表3 14批五味子相似度分析結(jié)果

若樣品與共有模式間的相似度在0.90 以上，則為推薦藥材。若樣品與共有模式間的相似度在0.90以下則為非推薦藥材。實驗結(jié)果表明，9 號產(chǎn)地五味子為非推薦藥材，其他產(chǎn)地五味子均為推薦藥材。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

本文對三種不同的色譜柱（Luna C18、Elite-Hpersil ODS、Diamonsil C18）進行了研究，Luna C18 色譜柱分離效果最佳。

3.2 檢測波長選擇

考察了218、220、240、254 和280 nm 波長下的色譜圖。結(jié)果表明，在木脂素最大吸收波長220 nm處色譜響應最佳。

3.3 流動相選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水流動相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，乙腈-水組成的體系能將所有組分基線分離。

3.4 提取條件選擇

本研究對提取方法、提取溶劑、提取時間和溶劑量對提取效果的影響進行了研究。比較回流提取和超聲提取兩種方法，結(jié)果表明，超聲提取具有提取效率高、方便、耗時短等優(yōu)點，因此，選擇了超聲提取方式。考察以正己烷、氯仿、無水乙醇、乙醇-水（75∶25）、乙醇-水（95∶5）和甲醇為提取溶劑，其中乙醇-水（75∶25）、乙醇-水（95∶5）和甲醇的提取效率較高。為了方便起見，選擇甲醇為提取溶劑。考察提取時間：10、20、30、40、50 和60 min?？疾烊軇┍读浚?0、30、40、60 和80 倍。結(jié)果表明，在其他條件不變的情況下，提取時間大于20 min 或溶劑倍量大于30 的組分變化不顯著。因此，提取時間選擇20 min，提取溶劑倍量大于30。

3.5 小結(jié)

本研究采用HPLC 法建立五味子藥材的指紋圖譜。選擇13 個響應較高且分離度較好的木脂素類成分作為共有特征峰，建立共有模式，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”處理軟件評價藥材質(zhì)量，結(jié)果顯示，除9 號產(chǎn)地藥材外均為推薦品，本研究思路為五味子中藥材的質(zhì)量控制提供了方法學上的參考，可用于判斷和鑒別五味子藥材的質(zhì)量。