王 丹，邱長云，孟凡濤，趙 娣，劉翠蘭，劉 晶，李 晨，王文濤

性愛行為對于物種延續(xù)是必不可少的，嗅覺運(yùn)動(dòng)發(fā)生在行為交互中，并引導(dǎo)性行為的發(fā)生[1]。嚙齒類動(dòng)物中，嗅覺幫助動(dòng)物發(fā)現(xiàn)配偶，決定它們的行為輸出[2]，對動(dòng)物嗅覺行為的檢驗(yàn)可作為評價(jià)小鼠性相關(guān)行為的指標(biāo)[3]。腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area, VTA)是調(diào)控性獎(jiǎng)賞行為的主要腦區(qū)。VTA-多巴胺環(huán)路系統(tǒng)處理動(dòng)機(jī)以及與社會(huì)獎(jiǎng)賞相關(guān)的需求[4-6]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是大腦中含量最豐富、分布最廣的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，研究報(bào)道BDNF能夠調(diào)控動(dòng)機(jī)行為和影響性行為[7-9]，性行為也能影響VTA腦區(qū)BDNF的表達(dá)[10]。但是，慢性不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)致小鼠抑郁后，小鼠性行為表現(xiàn)及VTA腦區(qū)BDNF的表達(dá)尚未報(bào)道。該研究利用CUS小鼠抑郁模型，結(jié)合性相關(guān)行為測定方法及綜合運(yùn)用免疫熒光、Western blot、熒光定量PCR的方法檢測VTA腦區(qū)BDNF的變化，為研究抑郁降低小鼠性相關(guān)行為提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只C57BL/6J雄鼠，從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室購買，并在SPF級動(dòng)物房進(jìn)行繁殖飼養(yǎng)，小鼠3～5只/籠，自由飲水和飲食，環(huán)境溫度19～22 ℃，相對濕度40%～60%，維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)律。小鼠飼養(yǎng)到8周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK(魯)2018 022，所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗BDNF單克隆抗體(英國Abcam公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國Cell signaling公司)；鼠抗TH抗體(美國immunostar公司)；羊抗兔二抗IR Dye800CW，驢抗鼠二抗IR Dye680LT，ALexa fluor 488山羊抗兔熒光二抗、ALexa fluor 546驢抗鼠熒光二抗(美國Thermo Fisher公司)。雙紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey Sa(美國Li-COR公司)。共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯有限公司(FV1200)?？俁NA提取試劑盒(美國Omega公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Real-time PCR儀(StepOnePlus)(美國麻省ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)步驟 小鼠隨機(jī)分為Control組和CUS組，每組10只。CUS組單籠飼養(yǎng)，方法參照文獻(xiàn)[11]，對照組3～5只/籠，不給于任何干預(yù)，放置在另一房間。CUS結(jié)束后，小鼠進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測CUS的效果；通過嗅覺偏好測試和雌鼠尿液嗅實(shí)驗(yàn)檢測CUS對小鼠性行為的影響。小鼠進(jìn)行自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的活動(dòng)能力。最后小鼠斷頭取腦，提取小鼠VTA腦區(qū)組織，檢測BDNF蛋白及mRNA的水平。

1.2.2CUS抑郁模型的建立 CUS抑郁模型參考文獻(xiàn)的方法[11]，CUS組給予21 d CUS結(jié)合單籠飼養(yǎng)：第1、8、15天束縛2 h，第2、9、16天給與24 h光照，第3、10、17天電擊10 min(0.3 mA電擊2 s，間歇16 s，共10 min)，第4、11、18天夾尾15 min，第5、12、19天高臺30 min，第6、13、20天給與24 h濕盒并傾斜45°，第7、14、21 天冷水游泳(8 ℃)。整個(gè)應(yīng)激在盡力減少小鼠不舒適性的前提下讓刺激達(dá)到最大的不可預(yù)知性，應(yīng)激結(jié)束后經(jīng)抑郁樣行為實(shí)驗(yàn)評判模型是否成功。

1.2.3糖水偏好實(shí)驗(yàn) 小鼠在進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)雙瓶水1周。然后小鼠在居住籠中進(jìn)行測試，測試前小鼠剝奪飲水5 h，然后小鼠籠中一側(cè)放平時(shí)用的飲水，另一側(cè)放置飲水配置的1%的蔗糖水，測試夜間12 h內(nèi)小鼠攝取的飲水量和糖水量，然后計(jì)算糖水偏好指數(shù)(糖水偏好指數(shù)=糖水消耗/總液體消耗×100%)，糖水偏好指數(shù)反映小鼠快感缺乏程度。

1.2.4強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 小鼠在測試房間適應(yīng)2～3 h后開始進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)高度25 cm、直徑10 cm的透明樹脂圓筒，實(shí)驗(yàn)時(shí)注入深度為15 cm、溫度為24 ℃的自來水，將小鼠放置進(jìn)水中，放置小鼠時(shí)要避免小鼠頭部入水，用攝像頭記錄小鼠6 min的行為視頻，其中前2 min為小鼠適應(yīng)階段，分析小鼠后4 min的靜止不動(dòng)時(shí)間。以小鼠在絕望環(huán)境中試圖逃脫又無法逃脫的狀態(tài)評判小鼠的抑郁程度，每只小鼠都需更換新水。

1.2.5自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 小鼠在測試房間適應(yīng)2～3 h后開始進(jìn)行自主活動(dòng)測試。小鼠放置在40 cm×40 cm×40 cm的曠場裝置中自由探索30 min，通過裝置上方攝像頭跟蹤記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)，然后通過Anymaze軟件對小鼠運(yùn)動(dòng)的距離進(jìn)行分析。

1.2.6嗅覺偏好測試 參照文獻(xiàn)[12]的方法測試前先要進(jìn)行適應(yīng)1 d，小鼠放置于裝置中自由探索15 min，允許它們能夠自由探索整個(gè)裝置，以便排除對一側(cè)有偏好的小鼠。接下來的2 d，測試小鼠在此裝置中對發(fā)情期雌鼠污染過的墊料或者雄鼠污染過的墊料以及干凈墊料的偏好(墊料的順序需要在小鼠之間進(jìn)行平衡)。10 min適應(yīng)之后，30 ml干凈的墊料放置于一側(cè)的塑料杯中，另一側(cè)放置相同量的污染過的墊料，兩個(gè)塑料杯分別放在2個(gè)箱室的一個(gè)角落。小鼠自由探索5 min。記錄小鼠分別與兩個(gè)杯子交互的時(shí)間和在兩側(cè)箱室的時(shí)間，通過Anymaze軟件對小鼠運(yùn)動(dòng)的軌跡進(jìn)行記錄。

1.2.7雌鼠尿液嗅實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠單籠適應(yīng)2～3 h。然后籠子中放入一個(gè)滅菌的棉簽適應(yīng)1 h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)都要在燈光昏暗的房間進(jìn)行，亮度為3 lux。實(shí)驗(yàn)開始后小鼠籠中放置蘸有水的棉簽測試3 min，測試蘸有水的棉簽45 min后，小鼠籠中放置蘸有來自發(fā)情期雌鼠的尿液的棉簽測試3 min。3 min測試期間記錄小鼠嗅聞棉簽的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中需要排除在籠中不動(dòng)，不聞嗅棉簽的小鼠。

1.2.8Western blot CUS結(jié)束后，小鼠斷頭，并在冰上迅速分離海馬，置液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取出海馬用含1% PMSF的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，然后加入5×上樣染料，沸水煮10 min，然后用12%或15%的SDS-PAGE膠進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，膜用TBST buffer(20 μmmol/L TRIs-HCl，pH7.4，150 μmmol/L NaCl，0.1% Tween-20)配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，然后經(jīng)過一抗(兔抗BDNF 1 ∶500，鼠抗β-actin 1 ∶1 000)過夜孵育，加熒光二抗(羊抗兔1 ∶5 000，驢抗鼠1 ∶5 000)室溫孵育1 h，經(jīng)Odyssey Sa雙紅外激光成像系統(tǒng)成像并進(jìn)行灰度識別分析。

1.2.9免疫熒光 腦片制備C57BL/6小鼠，4%水合氯醛深度麻醉后，4%多聚甲醛固定，取腦組織，經(jīng)30%蔗糖水脫水進(jìn)行冰凍切片，厚度40 μm。免疫熒光染色：取VTA腦區(qū)的腦片經(jīng)封閉液封閉后，加入稀釋后的一抗(兔抗BDNF 1 ∶200，鼠抗TH 1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗混合液(ALexa fluor 488山羊抗兔熒光二抗1 ∶400、ALexa fluor 546驢抗鼠熒光二抗1 ∶400)室溫避光孵育4 h，抗猝滅封片劑封片，最后用共聚焦觀察并拍照。

1.2.10RNA提取、cDNA合成及Q-PCR 按照總RNA提取試劑盒說明書提取VTA總RNA，然后利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行Q-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)水平。反應(yīng)體系及計(jì)算基因相對表達(dá)量方法參考文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果

2.1 CUS后小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為小鼠進(jìn)行21 d的CUS后，通過糖水偏好實(shí)驗(yàn)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測CUS后小鼠的表型，測試示意圖見圖1A。結(jié)果顯示CUS組糖水偏好降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.336，P<0.05)，見圖1B。強(qiáng)迫游泳結(jié)果顯示CUS組小鼠不動(dòng)時(shí)間長于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.273，P<0.05)，見圖1C。小鼠自主活動(dòng)結(jié)果顯示CUS組小鼠與Control組小鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1D、E。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。

圖1 小鼠抑郁樣行為測試

2.2 CUS損害小鼠的性行為上述結(jié)果已經(jīng)證實(shí)CUS后小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為，接下來進(jìn)一步通過小鼠嗅覺偏好測試實(shí)驗(yàn)和雌鼠尿液嗅實(shí)驗(yàn)檢測抑郁小鼠的性行為表現(xiàn)，小鼠嗅覺偏好測試示意圖見圖2A。結(jié)果顯示，Control組小鼠在雌鼠墊料一側(cè)的時(shí)間和在雄鼠墊料一側(cè)的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.801，P<0.05)；而CUS組小鼠在雌鼠墊料一側(cè)的時(shí)間和在雄鼠墊料一側(cè)的時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.618，P>0.05)，見圖2B、C。Control組小鼠與雌鼠墊料交互的時(shí)間和與雄鼠墊料交互的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.996，P<0.05)；而CUS組小鼠與雌鼠墊料交互的時(shí)間和與雄鼠墊料交互的時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.643，P>0.05)，見圖2D。雌鼠尿液嗅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Control組小鼠和CUS組小鼠聞嗅沾有水的棉簽的時(shí)間無差異，CUS組小鼠對雌鼠尿液聞嗅的時(shí)間減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.579，P<0.05)，見圖2E；每只小鼠聞嗅沾有水的棉簽的時(shí)間和沾有雌鼠尿液的時(shí)間，Control組中2只小鼠不動(dòng)，CUS組1只小鼠不動(dòng)，需要排除，見圖2F。

圖2 CUS后小鼠性行為測試

2.3 CUS后小鼠VTA腦區(qū)BDNF的表達(dá)下降對C57小鼠進(jìn)行免疫組化測定VTA腦區(qū)BDNF與神經(jīng)元的共標(biāo)情況。BDNF為綠色熒光，TH為紅色熒光，BDNF和TH兩種蛋白重合之后呈現(xiàn)黃色，見圖3，結(jié)果表明VTA腦區(qū)BDNF基本存在于TH神經(jīng)元中。

圖3 VTA腦區(qū)BDNF和TH免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果

行為測定結(jié)束后，取小鼠VTA腦區(qū)組織測定BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與Control組比較，CUS組BDNF蛋白表達(dá)量降低，見圖4A，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.387，P<0.05)，見圖4B。BDNF總mRNA及Exons mRNA表達(dá)量結(jié)果顯示，與Control組比較，CUS小鼠VTA腦區(qū)BDNF總mRNA表達(dá)量下降(t=4.652，P<0.05)，見圖4C；CUS組BDNF Exon Ⅰ mRNA表達(dá)量下降(t=4.557，P<0.05)，見圖4D；Exon Ⅱ mRNA表達(dá)量下降(t=3.092，P<0.05)，見圖4E；Exon Ⅳ mRNA表達(dá)量無變化(t=0.919，P>0.05)，見圖4F；Exon Ⅵ mRNA表達(dá)量無變化(t=0.114，P>0.05)，見圖4G。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。

圖4 CUS組和Control組VTA腦區(qū)BDNF蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平

3 討論

性行為在哺乳動(dòng)物和其他物種的繁殖中發(fā)揮重要的作用。性愛過程分為兩個(gè)階段，欲望階段和完成階段。欲望階段對于動(dòng)物選擇一個(gè)合適的配偶至關(guān)重要。性愛行為的兩個(gè)階段都需要?jiǎng)游锏母泄賲⑴c。嚙齒類動(dòng)物利用他們的嗅覺來控制性愛行為[1]。本研究中通過對雄性小鼠性行為相關(guān)的嗅覺行為的測試，檢測CUS致小鼠抑郁對小鼠性行為的影響。雌鼠尿液嗅實(shí)驗(yàn)和小鼠嗅覺偏好測試實(shí)驗(yàn)是性愛過程第一階段欲望階段的檢測，發(fā)現(xiàn)CUS致小鼠抑郁后，小鼠的性行為受損。性行為相關(guān)的神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)在多個(gè)腦區(qū)調(diào)控性行為，如VTA、伏隔核(NAc)、前額葉皮層(mPFC)等。VTA腦區(qū)是調(diào)控性獎(jiǎng)賞行為的主要腦區(qū)。多巴胺是一種受壓力應(yīng)激很大的神經(jīng)遞質(zhì)，它與感覺運(yùn)動(dòng)功能、激勵(lì)動(dòng)機(jī)、獎(jiǎng)賞進(jìn)程、強(qiáng)化學(xué)習(xí)等相關(guān)[13]。多巴胺神經(jīng)元在獎(jiǎng)賞的識別和與獎(jiǎng)賞相關(guān)的動(dòng)機(jī)行為中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。VTA-多巴胺環(huán)路系統(tǒng)處理情感、動(dòng)機(jī)以及與社會(huì)獎(jiǎng)賞相關(guān)的更多的認(rèn)知方面的需求。研究[4]發(fā)現(xiàn)在性行為活動(dòng)的獎(jiǎng)賞屬性中多巴胺能神經(jīng)元被激活。慢性應(yīng)激降低VTA-多巴胺環(huán)路的活性，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的退化或局部小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[8]。

BDNF是大腦中含量最豐富、分布最廣的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅在早期發(fā)育中，而且在成年大腦中都被認(rèn)為是神經(jīng)元突觸可塑性、存活和分化的主要調(diào)節(jié)因子[5]。研究[6]報(bào)道BDNF在前額葉皮層、海馬、VTA及NAc的抑郁癥的發(fā)生發(fā)展和抗抑郁治療中起重要作用。早期的社會(huì)行為能夠調(diào)控BDNF水平和BDNF甲基化[14]。文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道BDNF調(diào)控社交行為。在雌鼠特異的社交行為中，BDNF在OXY神經(jīng)元中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和重塑[15]。性行為影響VTA腦區(qū)BDNF的表達(dá)[10]。BDNF能夠調(diào)控動(dòng)機(jī)行為并影響性行為[7-9]，應(yīng)激會(huì)影響VTA-多巴胺的重塑和連接性[4]。CUS行為是一種具有預(yù)測效果、表面效度、結(jié)構(gòu)效度的抑郁動(dòng)物模型。本研究證實(shí)CUS所致抑郁小鼠性行為受損，VTA腦區(qū)BDNF與標(biāo)記多巴胺神經(jīng)元的TH共存，且VTA腦區(qū)BDNF蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)減少，說明VTA腦區(qū)BDNF的表達(dá)參與了性行為的調(diào)節(jié)。在后續(xù)的研究中會(huì)利用BDNF轉(zhuǎn)基因小鼠及DAT-cre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步研究VTA腦區(qū)多巴胺神經(jīng)元中BDNF敲除對小鼠性行為的影響。

綜上所述，本研究證實(shí)CUS所致的抑郁小鼠性行為受損，并且CUS能降低VTA腦區(qū)BDNF的表達(dá)。提示VTA腦區(qū)BDNF參與性行為的調(diào)控，但其發(fā)揮作用的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。